云　強(qiáng)　蘇秀蘭　歐陽(yáng)曉暉

【摘要】 目的 研究抗癌活性肽對(duì)人膽囊癌細(xì)胞系GBC-SD細(xì)胞作用前后的基因表達(dá)譜，篩選與抗癌活性肽作用相關(guān)的基因表達(dá)改變。方法 將1152條人類全長(zhǎng)基因的PCR產(chǎn)物按微矩陣排列點(diǎn)樣于特殊處理的玻片上制備成表達(dá)譜芯片；按一步法抽提抗癌活性肽作用前后體外培養(yǎng)的膽囊癌細(xì)胞的RNA并純化mRNA，通過逆轉(zhuǎn)錄用兩種熒光Cy3-dUTP和Cy5-dUTP標(biāo)記對(duì)照和實(shí)驗(yàn)組膽囊癌細(xì)胞cDNA，制成cDNA探針并與表達(dá)譜芯片雜交，用ScanArray4000掃描儀掃描芯片上兩種熒光信號(hào)，計(jì)算機(jī)分析判定差異表達(dá)的基因。結(jié)果 在1152條基因中篩選出有差異表達(dá)的基因245條，其中上調(diào)的121條，下調(diào)的124條。結(jié)論 利用本基因表達(dá)譜芯片可同時(shí)研究數(shù)以千計(jì)的基因表達(dá)水平，從而在基因水平上探討抗癌活性肽對(duì)膽囊癌GBC-SD細(xì)胞作用的機(jī)制。

【關(guān)鍵詞】 抗癌活性肽；膽囊癌；細(xì)胞系；基因芯片；基因表達(dá)譜

Analysis of gene expression pattern in gallbladder carcinoma cells treated by anti-cancer bioactive peptide (ACBP) YUN Qiang，SU Xiu-lan，OU YANG Xiao-hui.Inner Mongolia Hospital，Inner Mongolia 100027，China

【Abstract】 Objective To investigate gene expression pattern of human gallbladder carcinoma cell line treated by anti-cancer bioactive peptide (ACBP)，and in the identification of novel cance rassociated genes.Methods The cDNA retro-transcribed from equal quantity mRNA from the gallbladder carcinoma cell line (GBC-SD) which were labeled with Cy5 and Cy3 fluorescence as a probes.The mixed probe was hybridized with cDNA microarray which representing a set of 1152 human genes.It was scanned by laser scanner.The acquired image was analyzed by software.Results 245 differentially expressed genes were identified that further identified 121 upregulated and 124 downregulated gene.Conclusion cDNA microarray for analysis of gene expression patterns is a powerful method to identify nove cancer as sociated genes.

【Key words】 Anti-cancer bioactive peptide (ACBP)；Gallbladder carcinoma；Cell line；Gene chip；Gene expression pattern

本研究將通過基因芯片技術(shù)比較分析抗癌活性肽對(duì)膽囊癌GBC-SD細(xì)胞的基因表達(dá)譜的影響，了解作用前后基因表達(dá)的變化，深入探討這種新型生物活性制劑的分子機(jī)制，為腫瘤治療提供新方法。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 人膽囊癌GBC-SD細(xì)胞由山東大學(xué)齊魯醫(yī)院腫瘤研究所保存并提供。

1.2 主要試劑與耗材

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑

1.2.2 細(xì)胞總RNA提取、分析試劑

1.2.3 基因芯片標(biāo)記、雜交試劑盒 上海博星(BioStar)基因芯片有限責(zé)任公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與藥物作用 膽囊癌細(xì)胞按適當(dāng)密度接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)常規(guī)培養(yǎng)，當(dāng)達(dá)到80%融合時(shí)，加入活性肽使終濃度達(dá)到8 mg/ml繼續(xù)培養(yǎng)48 h開始有形態(tài)的改變時(shí)終止。

1.3.2 探針制備 用改進(jìn)的Trizol試劑一步法抽提培養(yǎng)細(xì)胞總RNA。

1.3.3 芯片雜交洗滌 按雜交試劑盒說明操作。

1.3.4 檢測(cè)與分析 用ScanArray4000掃描儀掃描芯片，用GenePix Pro3.0圖象分析軟件分析Cy3和Cy5兩種熒光信號(hào)的強(qiáng)度和比值。

2 結(jié)果

2.1 總RNA抽提結(jié)果 所提兩組細(xì)胞(GBC-SD細(xì)胞對(duì)照組、GBC-SD細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組)RNA OD260/OD280：1.8～2.0；1%瓊脂糖凝膠電泳28 s、18 s條帶清晰，無(wú)DNA雜帶，證明已抽提高純化的細(xì)胞總RNA。

2.2 芯片雜交結(jié)果分析

2.3 基因芯片檢測(cè)結(jié)果 總基因位點(diǎn)1152條，歸一化選擇后基因總數(shù)1010條，有差異表達(dá)的基因245條，占基因總數(shù)的21.27%。其中經(jīng)活性肽誘導(dǎo)后表達(dá)降低的124條，表達(dá)增高的121條。

3 討論

利用基因芯片技術(shù)可以大規(guī)模、高通量、快速高效的對(duì)大量基因進(jìn)行同時(shí)研究。表達(dá)譜基因芯片是用于基因功能研究的一種芯片，對(duì)來(lái)源于不同下的細(xì)胞內(nèi)的mRNA或逆轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的cDNA與表達(dá)譜基因芯片進(jìn)行雜交、洗滌，用特有的熒光波長(zhǎng)掃描芯片，計(jì)算機(jī)分析檢測(cè)結(jié)果，對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行綜合的分析和判斷，將某個(gè)或幾個(gè)基因與疾病聯(lián)系起來(lái)。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是多因素、多階段、多基因參與的復(fù)雜過程，利用基因芯片技術(shù)可以平行檢測(cè)數(shù)千條基因，了解藥物對(duì)基因表達(dá)的影響，從而推測(cè)藥物作用的基因靶點(diǎn)及機(jī)制，有利于發(fā)揮生物制劑特異性靶向調(diào)節(jié)作用。

3.1 缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)反應(yīng)性基因RTP801和內(nèi)皮素1(ET-1)表達(dá)降低 HIF-1在多數(shù)腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，上調(diào)參與腫瘤增殖和代謝通路的靶基因。其機(jī)制主要是通過提高葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、糖酵解速率及形成多血管體系來(lái)使腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧的環(huán)境^[2]。其功能可分為：①促進(jìn)糖酵解：能使腫瘤細(xì)胞適應(yīng)不利環(huán)境，減少有氧代謝中氧自由基對(duì)DNA復(fù)制的破壞；②促進(jìn)新生血管生成，給瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件^[3]；③慢性缺氧狀態(tài)下，HIF-1α可能參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Nip是Bcl-2凋亡家族的凋亡前成員，它的啟動(dòng)子中包含HIF-1反應(yīng)元件。在慢性缺氧及強(qiáng)制表達(dá)HIF-1α?xí)r均可使Nip3表達(dá)活躍，啟動(dòng)Bcl-2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡^[4]；④其他：HIF-1還可誘導(dǎo)各種促紅細(xì)胞生成因子(如EPO、轉(zhuǎn)鐵蛋白)、擴(kuò)血管因子(如誘導(dǎo)型一氧化氮合酶)、內(nèi)皮素1等的表達(dá)來(lái)增加組織氧的運(yùn)輸和利用能力。拮抗HIF-1能抑制血管增生和腫瘤生長(zhǎng)。RTP801是一個(gè)新克隆的HIF-1反應(yīng)性基因，在體外和體內(nèi)缺血性動(dòng)物模型都可以檢測(cè)到RTP801表達(dá)增高，將含有RTP801cDNA的脂質(zhì)體導(dǎo)入小鼠肺內(nèi)可導(dǎo)致大量細(xì)胞死亡^[5]。內(nèi)皮素是由內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生的含有21個(gè)氨基酸殘基的短肽，有四種亞型，有強(qiáng)烈的縮血管作用，ET-1作用最強(qiáng)。現(xiàn)已證實(shí)，多數(shù)腫瘤能產(chǎn)生ET-1并表達(dá)內(nèi)皮素受體，內(nèi)皮素可通過多種途徑參與腫瘤的血管生成^[6]。推測(cè)活性肽能通過抑制腫瘤血管形成和影響腫瘤細(xì)胞能量代謝，促進(jìn)凋亡而起到抗腫瘤效應(yīng)。

3.2 參與H+轉(zhuǎn)運(yùn)的ATP合成酶表達(dá)下降 細(xì)胞能量代謝最重要過程三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化都在線粒體內(nèi)進(jìn)行，而細(xì)胞凋亡時(shí)最早發(fā)生的改變就是線粒體內(nèi)跨膜電位改變。本實(shí)驗(yàn)中ATP5G1和ATP5J表達(dá)下降提示活性肽可能通過干擾線粒體正常功能誘導(dǎo)凋亡。

3.3 Survivin和凋亡抑制蛋白1(IAP-1/MIHC)表達(dá)下調(diào) Survivin是一種凋亡抑制因子，是凋亡抑制蛋白(IAP)家族的成員。Survivin主要通過抑制Caspases-3和Caspases-7阻斷細(xì)胞凋亡。另外Survivin 也通過p21間接抑制Caspases，其機(jī)制是Survivin 與細(xì)胞周期調(diào)控因子CDK4形成復(fù)合體，使得p21從CDK4的復(fù)合體中釋放出來(lái)，p21進(jìn)一步與線粒體Caspases 結(jié)合，抑制其活性，阻礙凋亡^[7]。有研究報(bào)道^[8]Survivin可能是血管形成中生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的保護(hù)性基因，維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的正常增殖。Survivin在腫瘤組織中表達(dá)的相對(duì)特異性，使抗Survivin療法具有良好的靶向特異性，對(duì)正常組織損害小^[9]。MIHC作為IAP家族成員通過阻斷Caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)而抑制細(xì)胞凋亡。

3.4 與細(xì)胞外基質(zhì)有關(guān)的基質(zhì)降解酶人類基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)、組織蛋白酶D、纖溶酶原激活物抑制劑Ⅰ型(絲氨酸蛋白酶抑制劑)和層粘連蛋白以及血管生成誘導(dǎo)劑CYR61表達(dá)均下調(diào)。惡性腫瘤組織通過產(chǎn)生或誘導(dǎo)產(chǎn)生各種蛋白酶降解ECM而向周圍浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。MMPs的蛋白溶解作用可能有3個(gè)后果：①允許內(nèi)皮細(xì)胞降解并浸潤(rùn)血管基底膜；②產(chǎn)生ECM降解產(chǎn)物，趨化內(nèi)皮細(xì)胞；③激活并固定ECM中的生長(zhǎng)因子。MMPs可調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞間及細(xì)胞與基質(zhì)間的粘附，調(diào)節(jié)新生血管的生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)^[10]。此外，MMP11有抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的作用^[11]。組織蛋白酶D(CD)是一種天冬氨酸類溶酶體肽鏈內(nèi)切酶，分泌到細(xì)胞外后便降解細(xì)胞外基質(zhì)成分。有研究表明CD在侵透胃壁，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性胃癌組織中表達(dá)增加，有更強(qiáng)的腹膜轉(zhuǎn)移傾向。而且發(fā)現(xiàn)浸潤(rùn)到肌層的胃癌細(xì)胞CD強(qiáng)表達(dá)，表現(xiàn)出更強(qiáng)的侵襲能力^[12]。層粘連蛋白(LN)是細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分之一，生理情況下細(xì)胞通過LN介導(dǎo)其與細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞與細(xì)胞間粘附和信息傳遞，影響細(xì)胞的附著、游走、增殖和分化。CYR61是一個(gè)細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)的信號(hào)分子，作為整合素受體的配體能促進(jìn)細(xì)胞黏附，游走，增殖和蛋白質(zhì)合成^[13]。此外，作為一個(gè)血管生成素誘導(dǎo)劑能促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和血管形成。因此，活性肽可能通過影響細(xì)胞黏附和血管形成從而抑制腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。

3.5 腫瘤壞死因子誘導(dǎo)蛋白(GG2-1)、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3(TRAF-3)、腫瘤壞死因子超家族成員4(TNFSF4)和干擾素(α、β、δ)受體1(IFNAR1)，TGF-βRⅡ表達(dá)均增高。腫瘤壞死因子對(duì)腫瘤細(xì)胞有細(xì)胞毒作用和生長(zhǎng)抑制作用，可誘導(dǎo)許多不同來(lái)源腫瘤細(xì)胞凋亡；損傷腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞和堵塞血管引起腫瘤缺血、壞死并介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)。干擾素是具有生物活性的細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)；促進(jìn)成熟單核巨噬細(xì)胞的吞噬作用，加強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力；干擾素還可以上調(diào)腫瘤細(xì)胞MHC抗原和黏附分子的表達(dá)，促進(jìn)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和加強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)；TGF-β對(duì)細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生、血管的生成、細(xì)胞凋亡及機(jī)體免疫系統(tǒng)均起著重要的調(diào)節(jié)作用^[14]。推測(cè)抗癌生物活性肽可能通過促進(jìn)TNF、TGF-β和IFN生成來(lái)攻擊、殺傷腫瘤細(xì)胞，增強(qiáng)人體免役防御能力，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

通過基因芯片技術(shù)對(duì)活性肽作用前后膽囊癌GBC-SD細(xì)胞基因表達(dá)譜的研究，可以發(fā)現(xiàn)有很多表達(dá)差異的基因。一方面能初步了解活性肽作用的分子機(jī)制，另一方面能發(fā)現(xiàn)更多的與活性肽作用有關(guān)的基因、蛋白產(chǎn)物，為進(jìn)一步的研究提供新思路。測(cè)定結(jié)果說明活性肽抗腫瘤的機(jī)制可能是多種多樣的，多途徑的。通過多種途徑抑制腫瘤新生血管形成，抑制糖酵解從而影響腫瘤細(xì)胞的能量代謝；影響線粒體能量代謝觸發(fā)凋亡；下調(diào)多種基質(zhì)降解酶，防止腫瘤細(xì)胞向細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜浸透，降低腫瘤細(xì)胞的局部浸潤(rùn)能力和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力。

總之，抑制腫瘤生長(zhǎng)的基因表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)腫瘤凋亡的基因表達(dá)上調(diào)，兩者協(xié)同作用誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。因此提示抗癌生物活性肽是一個(gè)多作用靶點(diǎn)的新型生物制劑，具有良好的應(yīng)用、開發(fā)前景。但目前的研究還僅限于動(dòng)物臟器的粗提物，還須以后進(jìn)一步深入探討其具體的表達(dá)產(chǎn)物，利用基因工程技術(shù)純化，擴(kuò)增，用于腫瘤治療。

參 考 文 獻(xiàn)

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