張　芳　劉紅芝

【摘要】 目的 探討硝酸甘油(NG)對大鼠缺血性腦缺血再灌注中Akt和Bad(ser136)磷酸化的影響。方法 36只健康SD(Sprague-Dawley)大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注組(對照組)、硝酸甘油組。以大鼠四肢動脈結(jié)扎腦缺血模型為基礎(chǔ)，應(yīng)用焦油紫染色法檢測海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡，采用免疫印跡檢測Akt和Bad(ser136)的磷酸化。結(jié)果 硝酸甘油組腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡顯著少于對照組(P<0.05)；硝酸甘油組Akt、Bad(ser136)的磷酸化顯著高于對照組 (P<0.05)。結(jié)論 硝酸甘油能顯著減輕腦缺血再灌注后腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡，明顯提高Akt、Bad(ser136)的磷酸化水平，對腦缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】 腦缺血；硝酸甘油；海馬；Akt

Protection of nitroglycerine on neurons and effect on Akt signaling pathway during ischemic cerebral stroke in rats ZHANG Fang，LIU Hong-zhi.School of Basic Medical Science，Xuzhou Medical College，Xuzhou，Jiangsu，221004，China

【Abstract】 Objective To investigate the effect of NG on the phosphorylation of Akt and Bad(ser136) during ischemic cerebral stroke in rats.Methods 36 Adult male SD(Sprague-Dawley) rats were randomly divided into sham-operated group，ischemia-reperfusion group(control group)，NG opener treatment group(NG group).Basing on the four-vessel occlusion models，neuron apoptosis in CA1 region of hippocampus was detected by cresyl violet staining，the phosphorylation of Akt and Bad(ser136)were detected by immunoblotting.Results The number of apoptotic neurons in NG group were significantly more than that of control group(P<0.05).The phosphorylation of Akt and Bad(ser136) in NG group was significantly less than that in control group(P<0.05).Conclusion Nitric oxide donor NG has a protective effect on neuron in CA1 region of hippocampus following cerebral ischemia-reperfusion by significantly increasing the phosphorylation of Akt and Bad(ser136)and neuronal apoptosis.

【Key words】 Cerebral ischemia；Nitroglycerine；Hippocampus；Akt

一氧化氮(nitric oxide，NO)是非經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)和細(xì)胞功能調(diào)節(jié)因子，它維持神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能和對缺血性腦損傷的保護(hù)作用日益受到關(guān)注，但具體機(jī)制不十分清楚。本實驗通過觀察NO的供體硝酸甘油(nitroglycerine，NG)對大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)元凋亡及Akt和Bad(ser136)磷酸化的影響，以探討其腦保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物分組 健康雄性 SD(Sprague-Dawley)大鼠 36只，體質(zhì)量 250～300 g，清潔級。大鼠被隨機(jī)分為兩組，缺血15 min再灌5 d為甲組，再灌12 h為乙組。各組又分為假手術(shù)組、缺血再灌注組(對照組)、硝酸甘油組，各6只。甲組用于海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡檢測，乙組用于Akt和Bad(ser136)磷酸化測定。

1.2 動物模型制備及給藥方式 用20%水合氯醛(300～350 mg/kg)腹腔注射麻醉動物后，參照宋遠(yuǎn)見等^[1]實驗分離雙側(cè)頸總動脈并電凝椎動脈。手術(shù)第2天于動物清醒狀態(tài)下結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈，使全腦缺血15 min，然后再灌注不同的時間，缺血時保持其直腸溫度在36.5℃～37.5℃，以缺血動物體征表現(xiàn)判斷缺血模型的可靠性。假手術(shù)組的處理同實驗組，但不結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈。硝酸甘油組于缺血前20 min給藥，腹腔注射硝酸甘油5 mg/kg。

1.3 焦油紫染色 甲組于再灌注第5天，以水合氯醛麻醉大鼠，接著以生理鹽水和4%多聚甲醛進(jìn)行心室灌注。取腦組織在4℃多聚甲醛中固定1 d以上后，于梯度乙醇溶液中脫水并在二甲苯中透明。包臘后的腦塊進(jìn)行切片(5 μm)，經(jīng)脫蠟、二甲苯，最后放于焦油紫溶液中染色。取海馬CA1區(qū)1 mm內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量作為計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 Akt和Bad(ser136)磷酸化免疫印跡檢測 乙組于再灌12 h將大鼠快速斷頭取腦，分離雙側(cè)海馬，置液氮中凍存?zhèn)溆谩Ｒ韵虏僮骶诒≈羞M(jìn)行。從液氮中取出海馬，加1.7 ml勻漿緩沖液，用Teflon勻漿器高速勻漿(10 s×6次)，800 g×10 min離心，棄上清液，加入0.6 ml buffer B振蕩搖勻，12 000 g×10 min離心，取上清，按改良Lowry法，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白測蛋白，經(jīng)過計算，各組樣品配成相同蛋白濃度后分裝，置-80℃冰箱待用。等量蛋白樣品經(jīng)7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，以濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至NC膜上，轉(zhuǎn)移緩沖液：25 mmol Tris，190 mmol甘氨酸，20%甲醇和0.05%SDS。轉(zhuǎn)移后的NC膜經(jīng)封閉液室溫封閉3 h后加入一抗p-Akt、p-bad(ser 136)，4 ℃過夜。用洗滌液洗膜三遍，加入二抗羊抗兔IgG-AP，37℃反應(yīng)2 h，洗膜。以NBT/BCIP顯色，水洗終止反應(yīng)。用圖像處理儀(Gene Company)對結(jié)果分析處理，假手術(shù)組的灰度設(shè)為1，其他各組以假手術(shù)組為標(biāo)準(zhǔn)分別計算出相對值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 以 SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析處理。所有數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗方差具有齊性，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

因本實驗室以前的研究已證實，與假手術(shù)組相比，腦缺血再灌注組第5天海馬神經(jīng)元損傷嚴(yán)重；腦缺血再灌注后15 min時腦組織中Akt和bad(ser 136)的磷酸化程度相對假手術(shù)組明顯降低，30 min時開始升高，3 h時達(dá)到最高，而后逐漸降低，到12 h時回到與假手術(shù)組相近的水平，實驗證實這一回落導(dǎo)致了細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷(P<0.05)[2]。故本文僅取甲組的存活神經(jīng)元數(shù)、存活量表示大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞存活情況，用乙組的Akt和Bad(ser 136)數(shù)值表示大鼠Akt和Bad(ser 136)的磷酸化情況。見表1。

2.1 神經(jīng)元凋亡 假手術(shù)組海馬CA1區(qū)僅僅有少量細(xì)胞凋亡，對照組凋亡細(xì)胞與假手術(shù)組相比明顯增多(P<0.05)，硝酸甘油組凋亡細(xì)胞較對照組顯著減少(P<0.05)。見表1。

2.2 Akt和Bad(ser136)的磷酸化 假手術(shù)組和對照組Akt和Bad(ser136)的磷酸化有一定水平，硝酸甘油組Akt和Bad(ser136)的磷酸化較對照組顯著升高(P<0.05)。見表1。

3 討論

NO作為細(xì)胞間信使物質(zhì)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)行使多種生理功能，同時它還是一種重要的腦缺血損傷介質(zhì)，參與血管調(diào)節(jié)、神經(jīng)遞質(zhì)傳遞、炎性反應(yīng)、免疫反應(yīng)等過程。腦海馬CA1區(qū)是對缺血最為敏感而發(fā)生大量細(xì)胞凋亡的區(qū)域之一，本實驗通過焦油紫染色法檢測海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的凋亡情況證實了這一點。在本實驗中以硝酸甘油作為NO的供體，實驗結(jié)果顯示：硝酸甘油組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡明顯少于對照組，說明NO對腦缺血再灌注引起的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡具有較好的保護(hù)作用。

近年來研究表明，Akt活化后能經(jīng)多種途徑促進(jìn)細(xì)胞存活，其重要機(jī)制之一就是通過磷酸化 Bcl-2家族成員Bad實現(xiàn)其促進(jìn)生長的作用。Bad是否磷酸化關(guān)系到細(xì)胞的成活和死亡，是神經(jīng)存活因子控制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的重要環(huán)節(jié)。Bad的功能受它的Ser-112和Ser-136位點磷酸化所調(diào)節(jié)。磷酸化的Bad能與伴侶蛋白(Chaperone)14-3-3蛋白相互作用，Bad-14-3-3結(jié)合物可釋放Bcl-2和/或 Bcl-xl，發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡效應(yīng)。Akt是強(qiáng)有力的Bad(Ser-136)激酶，活化的 Akt可以使Bad的Ser-136位點磷酸化，有效阻斷 Bad誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。本實驗室研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注后15 min時腦組織中Akt和bad(ser 136)的磷酸化程度相對假手術(shù)組明顯降低，30 min時開始升高，3 h時達(dá)到最高，而后逐漸降低，到12 h時回到與假手術(shù)組相近的水平，實驗證實這一回落導(dǎo)致了細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷^[2]。本實驗結(jié)果證明：硝酸甘油可以明顯上調(diào)12 h時Akt和Bad(ser136)的磷酸化水平，減少神經(jīng)元凋亡，對腦缺血再灌注損傷起保護(hù)作用。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] 宋遠(yuǎn)見，裴冬生，孫亞峰，等.腦缺血再灌注后依達(dá)拉奉聯(lián)合黃芪對大鼠神經(jīng)元的保護(hù)作用及機(jī)制.山東醫(yī)藥，2008，48(22)：6-8.

[2] Wang XT，Pei DS，Xu J，et al.Opposing effects of Bad phosphorylation at two distinct sites by AKT1 and AKT on ischemic brain injury.Cell Signal，2007，19(9)：1844-1856.