夏艷飛　陽(yáng)冬芳　李海軍　曾令斌

【摘要】 目的 探討環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)基因和蛋白在腎癌組織中的表達(dá)及與其分型之間的關(guān)系。方法 收集經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)腎癌組織的標(biāo)本39例和正常腎組織8例,采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)及Western免疫印跡分別檢測(cè)COX-2 mRNA及蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果 腎癌組織中的COX-2的基因和蛋白的表達(dá)明顯高于正常腎組織組(P<0.01)；在三種類(lèi)型的腎癌中，混合型腎癌組織中COX-2表達(dá)最強(qiáng)，顆粒細(xì)胞癌的表達(dá)水平次之，腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)最少(P<0.01)。結(jié)論 COX-2的基因和蛋白的表達(dá)在腎癌組織中增高且與其病理分型密切相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 腎癌；環(huán)氧化酶-2；基因；蛋白質(zhì)

環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)是前列腺素合成過(guò)程中的重要限速酶,它在某些腫瘤組織中高表達(dá),可能參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。腎癌是一種常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)腫瘤,發(fā)生率僅次于膀胱癌。本研究采用Western免疫印跡及逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)人不同臨床類(lèi)型的腎癌組織中COX-2基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)，初步探討COX-2的表達(dá)與腎癌病理分型之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 收集2004-2007年本院術(shù)后經(jīng)HE 染色病理證實(shí)腎透明細(xì)胞癌39例,其中男28例,女11例,年齡35~66歲(平均48.5歲),其中透明細(xì)胞癌19例,顆粒細(xì)胞癌12例,混合型8 例。切取距離腫瘤3 cm以外的正常腎臟組織8例為對(duì)照,經(jīng)病理檢查無(wú)癌細(xì)胞浸潤(rùn)。

1.2 主要試劑 Reverse Transcription System購(gòu)自美國(guó)Promega公司；COX-2及GAPDH上、下游引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)試劑。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)腎癌組織COX-2 mRNA的表達(dá) 用TRIzol 試劑提取細(xì)胞總RNA，溶于無(wú)Rnase水中，紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260/OD280 的比值在118~210。取總RNA 2 μg，用Promega公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，再取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物110 μl進(jìn)行PCR循環(huán)。內(nèi)參照采用GAPGH，引物序列為:上游5′-AACTTTGGCATT GTG2GAAGG-3′，下游5′-TGTGAGGGA GATGCTCAGTG-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為599 bp。COX-2引物序列：上游5′-TTCAAATGAGATTGTGGGAAAAT TGCT-3′,下游5′-AGATCATCTCTGGCCTGAGTATCTTT-3′,擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度305 bp。PCR反應(yīng)條件：95℃溫育3 min，94℃變性45 s，60℃復(fù)性40 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，末次循環(huán)72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取RT-PCR 產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，加樣量均為5 μl，溴化乙錠染色。電泳條帶采用UVP型凝膠圖像分析系統(tǒng)做積分吸光度測(cè)定和分析，以各組目的基因與內(nèi)參照基因的RT-PCR擴(kuò)增DNA片段的吸光度值減去背景值的比值來(lái)比較待測(cè)基因的mRNA表達(dá)差異。

1.4 Western免疫印跡檢測(cè)COX-2蛋白質(zhì)的表達(dá) 取腎癌組織及對(duì)照正常腎組織，用PBS洗滌3次，洗去殘血，加入三去污劑裂解緩沖液裂解組織提取蛋白，BCA法蛋白質(zhì)定量。10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離（積層膠80 V，分離膠120 V）后，半干轉(zhuǎn)移法進(jìn)行電轉(zhuǎn)移（60 mA 1 h）至PDVF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后，按1∶1000比例加入兔抗人COX-1一抗，于室溫孵育1 h；TBST洗滌3次，每次5 min；按1∶1000比例加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫孵育1 h；TBST洗3次，每次5 min；然后用Western blot熒光檢測(cè)試劑激發(fā)熒光，顯示于X光片。結(jié)果用凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)膠片掃描進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 腎癌組織及正常腎組織中COX-2 mRNA的表達(dá) RT-PCR分別檢測(cè)腎癌組織及正常腎組織COX-2 mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在正常腎組織中，COX-2的基因表達(dá)很少，大部分呈陰性表達(dá)。而腎癌組織中其表達(dá)明顯增加，且三種類(lèi)型的腎癌中，混合型腎癌組織中表達(dá)最強(qiáng)，腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)最少，而顆粒細(xì)胞癌的表達(dá)水平居中（結(jié)果如圖1）。

2.2 腎癌組織及正常腎組織中COX-2蛋白的表達(dá) Western免疫印跡法分別檢測(cè)腎癌組織及正常腎組織COX-2 蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在正常腎組織中，COX-2蛋白表達(dá)較少，而腎癌組織中其表達(dá)明顯增加，其中混合型腎癌織中表達(dá)最強(qiáng)，顆粒細(xì)胞癌的表達(dá)水平次之，腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)最少（結(jié)果如圖2）。

3 討論

腎癌是腎臟最常見(jiàn)的惡性腫瘤,發(fā)病率約占腎惡性腫瘤的80%,占全身惡性腫瘤的3%。其生物學(xué)行為多變，發(fā)病機(jī)制以及發(fā)生、發(fā)展的分子生物學(xué)基礎(chǔ)及預(yù)后仍不清楚。近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)犬科動(dòng)物腎細(xì)胞癌模型體內(nèi)COX-2具有高表達(dá)，并在腫瘤細(xì)胞增長(zhǎng)調(diào)節(jié)方面起重要作用，COX-2與腎盂移行細(xì)胞癌的分型和分期的具有相關(guān)性，而COX-2選擇性抑制劑可用于防治腎細(xì)胞癌［1-3］。

環(huán)氧化酶是花生四烯酸合成前列腺素(prostaglandin,PG)的一個(gè)限速酶，可將花生四烯酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦鞣NPG產(chǎn)物，維持機(jī)體的各種病理生理過(guò)程。目前發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物COX 至少有2種同工酶，即COX-1和COX-2，其中COX-2為誘導(dǎo)性表達(dá)，靜息時(shí)并不表達(dá)，在大多數(shù)正常組織難以發(fā)現(xiàn)，一般只在受刺激時(shí)迅速合成，這種刺激因子可為細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、促癌劑以及癌基因產(chǎn)物等。COX-2在致癌作用中充當(dāng)重要角色，研究發(fā)現(xiàn)它在人體結(jié)腸癌、直腸癌、胃癌、肺癌、食管癌、前列腺癌、喉癌等組織中檢測(cè)到COX-2的高表達(dá)［4］。羅洪波等通過(guò)免疫組化研究認(rèn)為，腎細(xì)胞癌中COX-2的高表達(dá)與腎癌的分級(jí)、分期、分型及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)［5］,也有研究提示COX-2與腎細(xì)胞癌病理分級(jí)成正相關(guān)［6,7］,呂紅凱等［8］在研究中認(rèn)為，COX-2對(duì)腎癌的早期診斷有意義，這些數(shù)據(jù)說(shuō)明COX-2 與腎細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展之間聯(lián)系密切。

本研究通過(guò)收集臨床病例并進(jìn)行分型，檢測(cè)了不同臨床類(lèi)型的腎癌組織中COX-2 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在正常腎組織中，COX-2基因和蛋白的表達(dá)較少，大部分呈陰性，而腎癌組織中其表達(dá)明顯增加。在三種不同臨床類(lèi)型的腎癌組織中，混合型腎癌組織中表達(dá)最強(qiáng)，顆粒細(xì)胞癌的表達(dá)水平次之，腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)最少。結(jié)果提示，COX-2的表達(dá)與腎癌的分型有關(guān)，其中與混合型腎癌的關(guān)系最為密切，檢測(cè)COX-2的表達(dá)有利于協(xié)助腎癌的分型診斷。COX-2的表達(dá)為腎癌發(fā)生的早期事件，與腎癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，有可能作為腎癌早期診斷及分型的指標(biāo)，并有可能為腎癌的預(yù)防提供新的靶向。

參 考 文 獻(xiàn)

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［4］ 敬前程，羅志強(qiáng).環(huán)氧化酶2在鼻咽癌的研究進(jìn)展.醫(yī)學(xué)綜述，2008,14(20):3078-3081.

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［8］ 呂紅凱，張雁鋼，王東文.COX-2 在腎癌中的表達(dá)及其臨床意義.臨床醫(yī)藥實(shí)踐雜志，2008,17(1):13-16.