賈媛媛　張永兵　刁衛(wèi)平　陳勁楓

摘要：通過未成熟胚子葉的組織培養(yǎng)創(chuàng)造體細(xì)胞無性系變異，誘導(dǎo)出了齊甜1號的同源四倍體甜瓜，激素質(zhì)量濃度以BA3.0mg/L為佳，加倍率為14.3％。對再生的同源四倍體及二倍體甜瓜植株進(jìn)行了莖、葉、花、果實、種子的形態(tài)觀察，及各項形態(tài)指標(biāo)和主要品質(zhì)指標(biāo)的測定。結(jié)果表明：除果形指數(shù)變小外，四倍體植株的莖、葉、花、果實、種子各項形態(tài)指標(biāo)的值均顯著大于二倍體。同時，四倍體甜瓜維生素C、可溶性糖含量也顯著高于二倍體。

關(guān)鍵詞：甜瓜；未成熟胚子葉；同源四倍體；形態(tài)；品質(zhì)

同源多倍體是遺傳和育種研究的重要材料。多倍體的“巨型性”及次生代謝產(chǎn)物增加和抗逆性增強(qiáng)的特性可被用來改善植物農(nóng)藝性狀、增加產(chǎn)量、改善品質(zhì)。多倍體育種可創(chuàng)造新的種質(zhì)資源，擴(kuò)大種質(zhì)資源的利用范圍，通過多倍體誘變、遠(yuǎn)緣雜交等使野生種與栽培種的優(yōu)良性狀相結(jié)合，產(chǎn)生并固定雜種優(yōu)勢。

在植物多倍體誘導(dǎo)中，利用組織培養(yǎng)過程中的無性系體細(xì)胞變異出現(xiàn)自然加倍獲得四倍體再生植株具有成功率高、可一定程度避免嵌合體的產(chǎn)生及條件易調(diào)控等優(yōu)點。本文通過未成熟子葉培養(yǎng)過程篩選鑒定同源四倍體甜瓜，建立同源四倍體誘導(dǎo)體系，并且對獲得的同源四倍體甜瓜進(jìn)行了形態(tài)觀察和品質(zhì)測定，為甜瓜多倍體育種實踐打下了一定的基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

供試材料為早皇后、9904、4810、黃金瓜、齊甜1號、新青玉，其中早皇后是地方常規(guī)品種，4810為多抗源復(fù)合雜交后的低代自交系，其余4個為雜交F，代品種。試驗于2006年在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)進(jìn)行。

1.2方法

1.2.1未成熟子葉培養(yǎng)從田間摘取發(fā)育18～23d的未成熟果實，經(jīng)流水沖洗果面后在超凈工作臺上用75％的酒精進(jìn)行表面消毒。然后剖開果實，取出尚未發(fā)育成熟的種子。去掉種皮并切取近胚軸端子葉中部組織作為外植體，接種在誘導(dǎo)無性系變異培養(yǎng)基上。誘導(dǎo)培養(yǎng)基共4種，分別為：MS+BA 1.0mg/L；MS+BA 2.0 mg/L；MS+BA 3.0 mg/L；MS+BA 4.0mg/L。每個處理接種約20個外植體，置于弱散射光條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)。培養(yǎng)至葉面或葉緣產(chǎn)生芽叢后，將芽叢及時切下，轉(zhuǎn)移到生長培養(yǎng)基(MS+BA 0.2 mg/ L)上，以促進(jìn)芽伸長。

除特別說明外，所有培養(yǎng)基均為固體培養(yǎng)基，附加3％蔗糖，0.8％瓊脂，pH值5.8左右。培養(yǎng)條件：溫度(25±2)℃，每日光照16 h，光照度2 000 lx左右。

1.2.2倍性鑒定將馴化后的植株移栽于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)蔬菜試驗基地。植株長出2-3片真葉后，取長0.5～1.0 cm的細(xì)嫩卷須，參照陳勁楓等的方法進(jìn)行有絲分裂染色體制片，以確定植株染色體數(shù)目，統(tǒng)計處理芽數(shù)、愈傷組織數(shù)、出芽數(shù)、變異芽數(shù)和加倍芽數(shù)，計算出愈率(愈傷組織數(shù)/處理芽數(shù))、出芽率(出芽數(shù)/處理芽數(shù))、變異率(染色體數(shù)目發(fā)生變異的株數(shù)/處理芽數(shù))和加倍率(加倍株數(shù)/處理芽數(shù))。

1.2.3形態(tài)性狀觀察甜瓜進(jìn)入盛花期，測量植株第3、5、7、9節(jié)的節(jié)間長、莖粗、葉長、葉寬、葉柄長、葉柄粗等形態(tài)指標(biāo)；每株分別取5朵當(dāng)天開放的雌、雄花，測量花萼長、花辦長和花辦寬。授粉20d后測果實縱徑、果實橫徑、單果質(zhì)量并計算果形指數(shù)(果實縱徑/果實橫徑)。果實成熟期，采摘四倍體再生植株及二倍體植株果實5個，每個單瓜隨機(jī)選擇20粒種子進(jìn)行觀察、測量。

1.2.4維生素C及可溶性糖含量的測定參照李合生的方法，從田間摘取發(fā)育正常的甜瓜果實，洗凈、擦干，用不銹鋼刀取果肉2g，磨碎后用比色法測定維生素C含量。同時，采用蒽酮比色法測定葉片可溶性糖含量。均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行LSD測驗。

2結(jié)果與分析

2.1未成熟胚子葉經(jīng)誘導(dǎo)后組織再生情況

白色的未成熟胚子葉外植體(圖版1 A)接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上2～5 d后急速膨大變綠(圖版1B)，切口邊緣形成少量愈傷組織，10～15 d后子葉邊緣或表面開始分化出芽叢(圖版1C)或形成愈傷組織塊(圖版1D)。出芽部位多集中在外植體近下胚軸一端切口邊緣與維管束交接處，另一端則較少，30d左右芽長達(dá)1～2 cm。將芽叢切下轉(zhuǎn)移至伸長培養(yǎng)基中培養(yǎng)(圖版1 E)，離體條件下發(fā)生變異的小植株已經(jīng)可以看出其葉片與普通二倍體的不同(圖版1 F)。將所有植株生根后進(jìn)行馴化。

2.2不同質(zhì)量濃度的激素對甜瓜未成熟胚子葉再生及加倍的影響

試驗共設(shè)4個不同BA質(zhì)量濃度誘導(dǎo)甜瓜無性系變異的發(fā)生。表1結(jié)果顯示，BA較高的培養(yǎng)基出愈率也較高，出芽率則相對較低；相反，BA較低的培養(yǎng)基出愈率較低，出芽率則較高。觀察得到，BA質(zhì)量濃度較高的培養(yǎng)基相對于較低的培養(yǎng)基，芽叢和愈傷組織塊較為緊實，分化單芽頻率也較低，而低BA質(zhì)量濃度培養(yǎng)的芽叢和愈傷組織塊則相對疏松，分化單芽頻率也較高，

不同BA質(zhì)量濃度誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生無性系變異，成株訓(xùn)化后經(jīng)細(xì)胞染色體計數(shù)鑒定，獲得了2n=48的四倍體。各處理的誘導(dǎo)結(jié)果如表l所示。BA質(zhì)量濃度不同對四倍體出現(xiàn)頻率有較大影響。表1顯示，齊甜1號以BA 3.0 mg/L最好，加倍率達(dá)到14.3％，而4.0 mg/L時加倍率僅為6.9％。

2.3再生四倍體植株形態(tài)特征觀察

由表2～4可知，除節(jié)間長、葉柄長、萼片長、果形指數(shù)、單果質(zhì)量外，四倍體植株的莖、葉、花、果實、種子的大多數(shù)形態(tài)指標(biāo)值顯著大于二倍體，且除雄花、雌花的萼片長外，二者的差異都達(dá)到了極顯著水平。四倍體的果形指數(shù)為0.78，二倍體為1.68，二者差異極顯著。

根據(jù)田間觀察結(jié)果可知，由于四倍體植株的莖、葉、花外形上具有明顯的巨大性，生長較為緩慢，葉片肥厚，形狀鈍圓，葉色深綠(圖版2A右)，畸形葉較多，且多發(fā)于植株較低或基部節(jié)位(圖版2 B、C、D)，再生的四倍體植株莖節(jié)變得短粗，分枝力較之二倍體植株差，開花期，花器官變大，花辦顏色變深(圖版3)，花辦肥厚，雌蕊和子房增大，且大多數(shù)雌花著生于主蔓莖節(jié)基部，而二倍體植株的雌花則多著生在延伸出的側(cè)蔓上：果形指數(shù)極顯著低于二倍體，果實較為短粗(圖版4A)；種子增大加厚，呈淡褐色，表面有少許光澤，二倍體種子呈淡黃灰色，表面無光澤(圖版4B)。

2.4四倍體甜瓜的品質(zhì)變化

表5結(jié)果顯示，四倍體的維生素C與可溶性糖含量都極顯著高于二倍體，其中可溶性糖含量超過了二倍體的2倍。這表明。四倍體甜瓜在風(fēng)味上有所變化，甜度增加：維生素C含量的增加表明營養(yǎng)價值也有所增加。

3討論與結(jié)論

植物體細(xì)胞無性系變異是指植物細(xì)胞經(jīng)組織培養(yǎng)產(chǎn)生的遺傳變異。體細(xì)胞無性系變異是植物組織培養(yǎng)中的普遍現(xiàn)象。難以預(yù)料的染色體變異給某些作物的改良帶來了機(jī)會，也開辟了一條染色體加倍的新途徑。

在甜瓜子葉組織培養(yǎng)中，子葉不定芽的分化具有明顯的極性現(xiàn)象。這種極性現(xiàn)象主要表現(xiàn)在不定芽的誘導(dǎo)上?？拷咻S部位的子葉塊不定芽的誘導(dǎo)率高于遠(yuǎn)離胚軸端的子葉塊，而且在每個了葉塊中也存在這種極性現(xiàn)象，即子葉塊的切口中，靠近胚軸的切口容易產(chǎn)生不定芽，遠(yuǎn)離胚軸的切口則難以形成不定芽。

子葉能否誘導(dǎo)出不定芽有2個關(guān)鍵因素：一是子葉苗齡，二是激素質(zhì)量濃度。有學(xué)者認(rèn)為，采用未成熟甜瓜子葉進(jìn)行組織培養(yǎng)時有時間上的優(yōu)勢。馬國斌等叫在用不同日齡的甜瓜子葉塊作為外植體時觀察到叢生芽的誘導(dǎo)率隨著子葉日齡的增長而下降，這種現(xiàn)象被認(rèn)為是由于此時細(xì)胞生理上處于“幼態(tài)”，全能性細(xì)胞多的緣故。

本試驗對再生的四倍體及二倍體甜瓜植株進(jìn)行了莖、葉、花、果實、種子的形態(tài)觀察，及各項形態(tài)指標(biāo)和主要品質(zhì)指標(biāo)的測定。結(jié)果表明，除果形指數(shù)變小外，四倍體植株莖、葉、花、種子各項形態(tài)指標(biāo)的值均顯著大于二倍體，體現(xiàn)出了基因的劑量效應(yīng)。因此，在對植株進(jìn)行鑒定時，可以結(jié)合四倍體的形態(tài)特征及生長緩慢且分枝力差等特點初步篩選變異株，再進(jìn)一步采用染色體制片技術(shù)確定植株倍性，這樣可大大節(jié)約倍性鑒定時間，減少工作量。本研究還發(fā)現(xiàn)，四倍體甜瓜的維生素C、可溶性糖含量也顯著高于二倍體，說明二倍體甜瓜經(jīng)染色體加倍后品質(zhì)得到了改善，營養(yǎng)價值也有所提高。