王　丹　楊　宇

摘要概述了植物基因功能的主要研究方法，并論述了主要技術(shù)如cDNA微陣列與基因芯片技術(shù)、反向遺傳學(xué)技術(shù)、表達序列標簽(EST)、蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息學(xué)等及其應(yīng)用。

關(guān)鍵詞植物功能基因組；方法；應(yīng)用

中圖分類號Q943文獻標識碼B文章編號 1007-5739(2009)01-0277-02

基因組學(xué)(genomics)指對所有基因進行基因組作圖、核苷酸序列分析、基因定位和基因功能分析的一門科學(xué)[1，2]。許多生物全基因組的破譯，使基因組學(xué)的研究有了一次質(zhì)的突破：從結(jié)構(gòu)基因組學(xué)開始過渡到功能基因組學(xué)。結(jié)構(gòu)基因組學(xué)(structural genomics)是通過基因作圖、核苷酸序列分析以確定基因組成、基因定位的一門科學(xué)。功能基因組學(xué)(functional genomics)代表基因組分析的新階段，被稱為后基因組學(xué)(post genomics)，旨在利用結(jié)構(gòu)基因組學(xué)豐富的信息資源，應(yīng)用高通量、大規(guī)模的實驗分析方法，結(jié)合統(tǒng)計和計算機分析來研究基因的表達、調(diào)控與功能，基因間、基因與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與底物、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用以及生物的生長、發(fā)育等規(guī)律[3]。

傳統(tǒng)的遺傳學(xué)的方法已不能適應(yīng)現(xiàn)在基因組學(xué)的發(fā)展，cDNA微陣列(cDNA micro-array)和基因芯片(gene chip)法、反向遺傳學(xué)、表達序列標簽(expressed sequence Tag，EST)、蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息學(xué)等方法相繼誕生，為基因組學(xué)的研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。

1cDNA微陣列與基因芯片法

cDNA微陣列和基因芯片都是基于Reverse Northern雜交以檢測基因表達差異的技術(shù)。二者的基本原理是利用光導(dǎo)化學(xué)合成、照相平板印刷以及固相表面化學(xué)合成等技術(shù)，在固相支持物上固定成千上萬個cDNA、EST或基因特異的寡核苷酸探針，并與放射性同位素或熒光標記的靶DNA進行雜交，然后用相應(yīng)的檢測系統(tǒng)進行檢測，根據(jù)雜交信號強弱及探針的位置和序列，即可確定靶DNA的表達情況以及突變和多態(tài)性的存在。該技術(shù)優(yōu)點在于可以同時對大量基因，甚至整個基因組基因的表達差異進行對比分析。

1.1基因表達水平的檢測及表達圖譜的構(gòu)建

基因芯片技術(shù)可以清楚地直接快速定量檢測出細胞內(nèi)幾個拷貝到幾個數(shù)量級拷貝的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，而且還可以檢測出外界因素誘導(dǎo)下基因表達水平變化[4]。由于微陣列技術(shù)可以同時在同一水平下大規(guī)模地、定量地檢測，因而可以檢測出目的基因在不同器官中的表達差異，也能檢測出同一器官在不同時期的表達差異，并在此基礎(chǔ)上繪制相關(guān)的表達圖譜，以找出基因型和表現(xiàn)型之間的關(guān)系，有助于全面了解基因的表達狀況[5]。

1.2功能相關(guān)基因的檢測及新基因的發(fā)現(xiàn)

通過對受檢樣品表達圖譜的成對比較，可以建立性狀與基因的可能聯(lián)系，鑒別目標性狀基因；也可識別特定生理或代謝途徑中相互作用的相關(guān)基因群。構(gòu)建cDNA文庫，對野生型和突變體的植株進行雜交篩選，發(fā)現(xiàn)其差異表達序列后，從文庫中找出相應(yīng)的克隆，以判斷它是否是新的基因[6]。

1.3轉(zhuǎn)基因的檢測

采用基因芯片技術(shù)對轉(zhuǎn)基因作物中常見的啟動子、終止子和選擇標記基因等多個外源基因進行檢測，可以建立快速、準確的轉(zhuǎn)基因作物篩選鑒定技術(shù)，可實現(xiàn)對DNA的準確、快速、大信息量的檢測。

2反向遺傳學(xué)(reverse genetics)

傳統(tǒng)的遺傳學(xué)或稱為正向遺傳學(xué)(forward genetics)主要研究自發(fā)或誘變突變體中某一突變性狀的遺傳行為。而反向遺傳學(xué)(reverse genetics)是相對正向遺傳學(xué)而言的，是在基因功能序列已知的基礎(chǔ)上分析研究基因功能，一般通過創(chuàng)造功能喪失突變體來研究突變所造成的表型效應(yīng)，并推測在生物體內(nèi)基因的作用。

2.1基因陷阱(Gene trap)

基因陷阱是新近發(fā)展起來的一種反向遺傳學(xué)方法，它主要依靠報道基因的隨機插入來產(chǎn)生融合轉(zhuǎn)錄物或融合蛋白，通過檢測報道基因而推知基因及其功能。目前已發(fā)展了3種不同的陷阱系統(tǒng)，即增強子陷阱、啟動子陷阱和基因陷阱。它們之間最大的不同體現(xiàn)在報道基因重組體的組成和所插入基因組的位置上?；蛳葳宓膬?yōu)勢在于它只在表達水平上定位基因，細胞基因本身的轉(zhuǎn)錄和表達不受影響，所以可檢測功能上多余的基因，也可檢測在基因表達多個水平上都有作用的基因，或低水平表達的重要基因，而以前的功能基因組學(xué)的方法對這些基因都是無法確定的。

2.2TILLING技術(shù)

TILLING(Targeting Induced Local Lesions In Genomes)即定向誘變基因組局部突變技術(shù)，其基本原理是：誘變實驗對象并提取DNA，把多個待測樣品的DNA混合在一起進行PCR，通過變性和復(fù)性過程得到異源雙鏈。如果樣品發(fā)生突變，那么形成的異源雙鏈中必定含有錯配堿基。利用特異性的內(nèi)切核酸酶識別攜帶了錯配堿基的異源雙鏈，并在錯配處切開雙鏈，最后進行電泳檢測試驗結(jié)果。TILLING作為一種全新的反向遺傳學(xué)研究方法已經(jīng)用于多種植物及作物中，如擬南芥、玉米、水稻等。以美國為首的北美實驗室借助TILLING技術(shù)，聯(lián)合啟動了擬南芥菜TILLING項目，直接推動了擬南芥功能基因組學(xué)項目的建立。該項目在立項的第1年就為擬南芥研究者們提供了超過100個基因上的1 000多個突變位點。隨著各種生物基因組計劃的深入研究，相信TILLING技術(shù)將會得到更加廣泛的應(yīng)用。

2.3RNA干涉技術(shù)(RNAi)

RNA干涉是指細胞內(nèi)的RNAi被內(nèi)、外源雙鏈RNA(dsRNA)激活，高度特異地抑制同源基因表達的現(xiàn)象，是真菌、動物、植物等大多數(shù)真核生物中普遍存在的一種防御反應(yīng)。RNAi已成功地應(yīng)用于單個基因和基因家族中的多個成員的沉默，植物中運用轉(zhuǎn)基因所形成的RNAi可以遺傳到下一代，產(chǎn)生基因表達效應(yīng)較低的轉(zhuǎn)基因植物，導(dǎo)致植物表現(xiàn)出相應(yīng)的缺失表型。因此，RNAi技術(shù)具有高度的序列專一性和有效的干擾活力，可以特異地使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低的突變體，已成為功能基因組學(xué)的一種強有力的研究工具。

3表達序列標簽(EST)

表達序列標簽(EST)是指從不同組織來源的cDNA文庫中隨機挑取克隆，對其進行大規(guī)模測序所獲得的部分cDNA的5′或３′ 序列，一個EST對應(yīng)于某一種mRNA的cDNA克隆的一段序列，長度一般為300～500bp。近幾年來，EST已經(jīng)成為分離與克隆新基因及基因功能研究的一個行之有效的手段。然而只有少數(shù)模式植物測定了基因組序列，在大基因組的植物無法進行全序列測定的情況下，EST已經(jīng)成為一種進行基因序列比較，發(fā)現(xiàn)和鑒定表達基因的最快的途徑[7]。由于EST代表著一段表達的基因序列，可與公共數(shù)據(jù)庫中的基因進行“電子雜交”(electric hybridization)，進而可以從理論上推測其所代表的基因的功能，因此可部分替代基因組成為科學(xué)研究的資源或作為全基因組研究的補充[8，9]。功能基因在進化過程中具有保守性，根據(jù)序列同源性可由數(shù)據(jù)庫中大量已知EST的功能來推測未知EST的功能。

4蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)

蛋白質(zhì)組學(xué)表示基因組編碼的蛋白質(zhì)的全部集合?；虮磉_的產(chǎn)物是蛋白質(zhì)，但基因和蛋白質(zhì)之間也不是一一對應(yīng)的關(guān)系，蛋白質(zhì)翻譯后還要經(jīng)過修飾、加工、細胞定位或與其他蛋白質(zhì)相互作用才具有生物功能，因而隨著后基因組學(xué)時代的到來，對蛋白質(zhì)功能的研究必將會從對特定蛋白質(zhì)的研究上升到對生物體全部蛋白質(zhì)的表達模式及功能模式的研究，即蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。近幾年來，蛋白質(zhì)芯片技術(shù)(protein chip)的出現(xiàn)給蛋白質(zhì)組學(xué)研究帶來了新思路。這種技術(shù)在體外條件下進行操作，并直接檢測目標蛋白質(zhì)，不需要酵母作為中介，突破了酵母雙雜交系統(tǒng)技術(shù)的局限性，因此必將成為全新的研究蛋白質(zhì)相互作用的理想工具。

5展望

綜上所述，植物功能基因組學(xué)已經(jīng)取得了一定進展，上述研究方法也只是功能基因組學(xué)研究中的一部分，各種方法都各有側(cè)重點也有各自的優(yōu)缺點，可以相互輔助?；蚪M研究的深入和國際合作的加強，現(xiàn)有的研究手段將會不斷完善和加強，也將會不斷研發(fā)出新的研究技術(shù)，數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)也將會更趨豐富和共享度會更高，最終研究清楚植物基因組的結(jié)構(gòu)及功能。目前利用功能基因組學(xué)的方法進行植物體發(fā)育過程中基因功能的研究，植物體內(nèi)致病基因和程序性死亡有關(guān)基因的研究等還很少，這也為植物功能基因組的研究提供了更為廣闊的應(yīng)用空間。相信植物功能基因組研究方法的應(yīng)用將會大大促進疾病治療的研究，植物抗病毒研究的發(fā)展，也相信植物功能基因組研究方法在各研究領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用將為其轉(zhuǎn)化成生產(chǎn)力打下堅實的基礎(chǔ)，為農(nóng)業(yè)發(fā)展做出更大的貢獻。

6參考文獻

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