方淑桂 曾小玲 陳文輝 陳銑

（福州市蔬菜科學(xué)研究所，福建福州350012）

大白菜雜交種中熟5號(hào)純度的RAPD鑒定

方淑桂 曾小玲 陳文輝 陳銑

（福州市蔬菜科學(xué)研究所，福建福州350012）

利用RAPD-PCR分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)大白菜品種中熟5號(hào)及其親本的DNA指紋進(jìn)行了分析研究，從200個(gè)隨機(jī)引物中篩選出互補(bǔ)帶明顯的引物S33，構(gòu)建了相應(yīng)的DNA指紋圖譜。通過(guò)對(duì)100株中熟5號(hào)進(jìn)行純度鑒定，結(jié)果只有2個(gè)有母本特異帶，與大田檢測(cè)的結(jié)果完全一致，雜交率達(dá)98%。

大白菜 中熟5號(hào) RAPD-PCR 種子純度

種質(zhì)和新品種鑒定是農(nóng)作物新品種開發(fā)利用及知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)的依據(jù)，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)農(nóng)作物品種仍以形態(tài)指標(biāo)鑒定為主，其特點(diǎn)是準(zhǔn)確可靠，但檢測(cè)周期長(zhǎng)，不能滿足當(dāng)年用種需要。為縮短鑒定周期，同工酶技術(shù)已應(yīng)用于十字花科蔬菜雜種純度鑒定，但同工酶多態(tài)性不夠豐富，同時(shí)有組織和器官特異性，大大降低了鑒定的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，DNA分子標(biāo)記技術(shù)得到全面發(fā)展，以PCR為基礎(chǔ)的DNA分子標(biāo)記技術(shù)，如RAPD，SCAR，SSR，ISSR等得以發(fā)展與應(yīng)用。而RAPD分子標(biāo)記技術(shù)具有簡(jiǎn)單易行、DNA需要量少、檢測(cè)效率高、試驗(yàn)周期短、隨機(jī)引物選擇不受種屬的限制等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于多種作物的種子鑒定[1～5]。

本研究以中熟5號(hào)[6]及其親本為材料，采用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)，建立中熟5號(hào)品種及其親本的DNA指紋圖譜，為其純度鑒定和知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大白菜品種中熟5號(hào)及其親本均由福州市蔬菜科學(xué)研究所大白菜課題組提供，采用穴盤育苗，待幼苗長(zhǎng)至2片真葉時(shí)取嫩葉供試驗(yàn)用。RAPD引物購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)有限公司。

表1 不同引物擴(kuò)增多態(tài)性情況

1.2 試驗(yàn)方法

①DNA提取 隨機(jī)抽取大白菜品種中熟5號(hào)及其父母本各15株，剪取剛展開的健康嫩葉，液氮研磨，采用改良的CTAB法[7]提取總DNA，用紫外分光光度計(jì)在260 nm和280 nm下測(cè)定OD值，檢測(cè)DNA的質(zhì)量和濃度，并稀釋到30 ng/μL作為PCR擴(kuò)增的模板。

②RAPD分析 大白菜RAPD-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化為25 μL，其中含2.5 μL 10×PCR buffer，250 μmol/L dNTP，0.5 μmol/L引物，2.5 mmol/μL MgCl2，30 ng模板DNA，1 U的Taq酶。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PCR儀上進(jìn)行，PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性 4 min；92℃ 60 s，37℃ 90 s，72℃120 s，40個(gè)循環(huán)；72℃7 min；4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物在含有0.5 μg/mL EB的1.4%瓊脂糖凝膠中電泳2 h，用捷達(dá)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照分析。

圖1 混合中熟5號(hào)品種和父母本基因組DNA的RAPD-PCR擴(kuò)增

圖2 S33擴(kuò)增F1及其親本的DNA圖譜

2 結(jié)果與分析

2.1 特征引物的篩選

用生工S1～S200共200個(gè)隨機(jī)引物，隨機(jī)提取父本、母本及雜交種15株，建立混合池，進(jìn)行RAPDPCR引物篩選。結(jié)果有40個(gè)引物擴(kuò)增出1～4條帶，121個(gè)引物擴(kuò)增出5～10條帶，18個(gè)引物擴(kuò)增出10條以上條帶（圖1）。

選取擴(kuò)增帶譜清晰，模糊帶和雜帶少，主帶突出的70個(gè)引物分別擴(kuò)增大白菜早熟5號(hào)雜交種和父母本的基因組DNA。結(jié)果顯示，有10個(gè)引物擴(kuò)增出多態(tài)性帶（表1）。其中有4條引物擴(kuò)增的雜種譜帶與父本有差異；有2條引物擴(kuò)增的雜種譜帶與母本有差異；有4條引物擴(kuò)增的雜種譜帶與父母本有差異，分別是引物S4，S33，S155和S170。其中引物S155擴(kuò)增的與父本的特異帶譜比較模糊；引物S170擴(kuò)增的與其父母本相比，缺失1條父本特異帶和2條母本特異帶；引物S4擴(kuò)增的與其父母本相比，缺失1條母本特異帶。經(jīng)多次反復(fù)試驗(yàn)，篩選出1個(gè)特征引物S33，能同時(shí)擴(kuò)增出早熟5號(hào)的雜種及其父母本的多態(tài)性條帶，其擴(kuò)增產(chǎn)物具有高度的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

2.2 指紋圖譜的建立

從圖2可以看出，用引物S33擴(kuò)增中熟5號(hào)雜交種及其親本基因組DNA，母本有一條明顯特異帶S33-1500，父本有一條明顯的特異帶S33-550，雜交種同時(shí)有這兩條明顯的特異帶。

2.3 雜種純度的鑒定

將中熟5號(hào)雜交種種植于大田中，待幼苗長(zhǎng)至2片真葉時(shí)，隨機(jī)抽取100個(gè)單株編號(hào)，按上述方法提取DNA，選用引物S33進(jìn)行RAPD的分子鑒定。檢出2個(gè)單株無(wú)父本特異帶，說(shuō)明2株是母本苗，雜交種的純度為98%。成株期鑒定生物學(xué)性狀，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2株與母本性狀一樣，植株矮小、結(jié)球松，其余的均結(jié)球大而緊實(shí)，雜交率為98%。

3 小結(jié)

本試驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化DNA提取程序，嚴(yán)格控制DNA模板質(zhì)量，優(yōu)化反應(yīng)體系，多次重復(fù)篩選，獲得多態(tài)性穩(wěn)定且互補(bǔ)帶明顯的特征引物S33，建立了中熟5號(hào)大白菜DNA指紋圖譜。在生產(chǎn)田中隨機(jī)抽取單株并編號(hào)，苗期提取DNA進(jìn)行RAPD分子鑒定，與成株期形態(tài)鑒定結(jié)果相對(duì)應(yīng)，植株矮小結(jié)球松散的與分子標(biāo)記缺失父本帶的一致，這樣更準(zhǔn)確地鑒定中熟5號(hào)雜交種純度，說(shuō)明利用DNA指紋圖譜進(jìn)行大白菜品種鑒定是可行的。

[1]賈繼增.分子標(biāo)記種質(zhì)資源鑒定和分子標(biāo)記育種[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，1999，29（4）：1-10.

[2]李莉，邵登魁，鐘啟文.RAPD技術(shù)在蔬菜種質(zhì)資源研究中的應(yīng)用[J].青海大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007，25（5）：58-61.

[3]郝風(fēng)，李成瓊，宋明，等.西園四號(hào)甘藍(lán)純度的RAPD鑒定及其在雜交制種中的應(yīng)用[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006，22（5）：43-45.

[4]戴修純，王佛嬌，謝偉平，等.利用RAPD技術(shù)快速鑒定番茄種子純度[J].中國(guó)蔬菜，2006（8）：23-24.

[5]Ballester J G.Determination of hybrid seed purity inpepper using PCR-based markers[J].Euphytica，1998（3）：212-219.

[6]方淑桂，陳文輝，曾小玲.大白菜新品種中熟5號(hào)的選育[J].中國(guó)蔬菜，2001（6）：32-33.

[7]王關(guān)林，方宏筠.植物基因工程[M].北京：科學(xué)出版社，2002：742-744.

Identification of Seed Purity of Hybrid Chinese Cabbage Zhongshu No.5 by RAPD Markers

FANG Shugui,ZENG Xiaoling,CHEN Wenhui,CHEN Xian
(Fuzhou Institute of Vegetable Science,Fuzhou 350012)

Using the RAPD-PCR molecular marker technology,the DNA fingerprints of Chinese cabbage Zhongshu No.5 and their parents were analyzed.A characteristic primer S33 showed complementary type bands of their parents was screened from 200 random primers.The DNA fingerprinting of Chinese cabbage Zhongshu No.5 was constructed,which adopted to identify the seed purity of Chinese cabbage Zhongshu No.5.Using the purity identification method,two plants showed female parent bands in 100 Zhongshu No.5 plants,which was exactly the same with the field testing.The hybrid rate was 98%.

Chinese cabbage;Zhongshu No.5;RAPD-PCR;Seed purity

10.3865/j.issn.1001-3547(x).2009.06.006

科技部成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目（02EFN213500309）；福建省科技成果轉(zhuǎn)化重點(diǎn)項(xiàng)目（2006T0030）

方淑桂（1956-），女，大專，研究員，研究方向?yàn)槭卟诉z傳育種和生物技術(shù)，電話：13720836739。E-mail：fangshugui@126.com

2008-10-17