張德雙 張鳳蘭 徐家炳

（北京蔬菜研究中心，100097）

蕓薹屬異源六倍體CGMCC No.2553多類型再生植株的獲得

張德雙 張鳳蘭 徐家炳

（北京蔬菜研究中心，100097）

應用游離小孢子培養(yǎng)技術對兼具有A，B，C染色體組的蕓薹屬異源六倍體CGMCC No.2553（AABBCC，n= 27）材料進行游離小孢子培養(yǎng)。結果表明，供試材料具有胚胎發(fā)生能力，并獲得DH再生植株。220份馴化后的再生植株定植于日光溫室中自交留種，其中12株獲得自交種子。分別將DH植株與3份大白菜品種正、反交授粉雜交，得到4份雜交種F1代。經田間植物學鑒定，獲得的雜交種為真正的雜種。目前，4份雜交種的染色體組成、倍性、育性等正在研究中。所獲得的DH植株為今后構建遺傳圖譜，標記和定位重要的基因等后續(xù)研究奠定了基礎。

蕓薹屬異源六倍體CGMCC No.2553 游離小孢子培養(yǎng) 再生株 大白菜 雜種一代

在蕓薹屬作物中，3個二倍體基本種 （或原始種）分別是:蕓薹（Brassica campestris，2n=20，AA）、甘藍（Brassica oleracea，2n=18，CC）、黑芥（Brassica nigra，2n=16，BB）。由3個基本種衍生的3個異源四倍體（雙二倍體）復合種(或次生種)分別是：甘藍型 油 菜 （Brassica napus，2n=38，AACC）、 芥 菜（Brassica junceae，2n=36，AABB）和埃塞俄比亞芥（Brassica carinata，2n=34，BBCC）。蕓薹屬作物3個二倍體基本種和3個異源四倍體復合種之間的遺傳關系已經研究得非常清楚。早在1935年，日本科學家就提出禹氏三角（U’triangle）表示它們之間的關系[1]。正確理解蕓薹屬不同種各單染色體組之間的關系，不僅有助于解釋蕓薹屬各個種之間的進化關系，而且將加快蕓薹屬種間的基因轉移，創(chuàng)造蕓薹屬的新資源。研究表明，A，C基因組來源于相同或相似的基因型，B基因組可能來自另一個地理生境，因此，A，C基因組間的親緣關系要比它們與B基因組的關系密切[2～5]。Attia等[2]研究不同雙單倍體雜種中染色體配對和交叉頻率，發(fā)現A和C基因組染色體之間的配對情況遠好于A，B和B，C，這說明A和C基因組之間可能具有較近的親緣關系。但是，白菜與甘藍無法通過常規(guī)育種手段直接雜交獲得雜交后代，通常采用體細胞雜交或原生質體融合和胚拯救等技術獲得二者種間雜種，而白菜（Brassica campestrisL.ssp.pekinensis，2n=20，AA）與甘藍型油菜（Brassica napus，2n=38，AACC）極易雜交，這些都表明A，B，C染色體組間既存在相似性，又存在復雜性。

北京蔬菜研究中心引進了一份蕓薹屬異源六倍體復合種CGMCC No.2553材料，該材料兼具有A，B和C染色體基因組。研究表明，應用常規(guī)的方法，蕓薹屬異源六倍體復合種CGMCC No.2553可以與大白菜雜交，但結實率極低。由于蕓薹屬異源六倍體基因組組成較為復雜，所以先采用游離小孢子培養(yǎng)技術快速純合重要性狀，創(chuàng)造更多能與大白菜雜交的蕓薹屬新種質，將獲得的多類型DH單株與大白菜品種雜交，獲得二者的雜交后代。

游離小孢子培養(yǎng)技術已廣泛應用于蕓薹屬作物中，國內已成功將甘藍型油菜、大白菜等作物的小孢子培養(yǎng)技術應用于育種實踐中，并選育出品種。利用小孢子培養(yǎng)獲得的DH再生植株不僅可以縮短常規(guī)育種周期，而且應用DH永久群體構建的遺傳圖譜可以用來標記重要性狀，定位、克隆重要基因等。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蕓薹屬異源六倍體CGMCC No.2553（AABBCC，n=27）兼具有A，B和C染色體基因組，雖為同一株采收的種子，但蕓薹屬異源六倍體CGMCCNo.2553個體間差異較大。表現為：有的植株葉片有缺刻，有的植株葉片為板葉；花色有黃花和白花等；莖部有紫色，淺紫色，淺綠色帶蠟粉等。蕓薹屬異源六倍體苗期照片如圖1，抽薹、現蕾期照片如圖2。

1.2 試驗方法

①游離小孢子培養(yǎng) 10月中旬，將蕓薹屬異源六倍體CGMCC No.2553萌動種子放于4℃冰箱中人工春化15～20 d，11月初播種于日光溫室，待長到一定苗齡后定植到日光溫室。在第2年盛花期取材，參考已發(fā)表的綠菜花游離小孢子培養(yǎng)方法[6]，對供試材料進行游離小孢子培養(yǎng)。

②DH再生植株的獲得、留種暗培養(yǎng)20 d后，小孢子胚發(fā)育到子葉期，將子葉胚轉接到裝有B5固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，然后再轉移根、莖、葉分化良好的幼苗到三角瓶中，多次繼代后獲得發(fā)育健壯的再生苗，馴化后，定植于日光溫室中，人工蕾期自交留種。

③DH再生植株與大白菜雜交種的獲得、鑒定 在DH再生植株自交留種的同時，取DH再生植株的花粉分別涂抹到3份大白菜品種柱頭上或取大白菜的花粉涂抹到DH再生植株上，獲得二者間的雜交種子。播種收獲的種子，通過田間性狀觀察的方法，鑒定雜種的真實性。

2 結果與分析

2.1 DH再生植株的獲得

圖1 蕓薹屬異源六倍體的苗期

圖2 蕓薹屬異源六倍體抽薹、現蕾期

圖3 蕓薹屬異源六倍體的子葉胚和胚誘導成苗

圖4 蕓薹屬異源六倍體的再生苗

圖5 蕓薹屬異源六倍體再生植株的不同類型

圖6 蕓薹屬異源六倍體的再生植株群體（抽薹、開花）

蕓薹屬異源六倍體CGMCC No.2553材料具有胚胎發(fā)生能力，可以獲得胚狀體和再生植株。圖3為獲得的子葉胚、子葉胚轉移到培養(yǎng)皿中誘導成苗。由圖3可見，一次培養(yǎng)獲得的胚狀體數量不多，說明基因型明顯影響胚胎發(fā)生能力。轉移健壯的幼苗到三角瓶中繼續(xù)生長、分化，形成再生苗（圖4）。圖4為定植前的再生植株。試驗中發(fā)現一個有趣的現象，供試材料的子葉胚極易分化出多個再生苗或再生植株，表現為“一胚多苗”的現象，這不僅有利于獲得同一基因型的多個再生植株，而且提高了再生株定植成活率。圖5為蕓薹屬異源六倍體再生植株的不同表現。由圖5可見，再生植株主要表現為葉片缺刻的深、淺，紫色的有無等區(qū)別。圖6為蕓薹屬異源六倍體再生植株群體。由圖6可見，DH植株花期長勢旺，植株高，分枝多。圖7為蕓薹屬異源六倍體再生植株的花。由圖7可見，花瓣顏色有黃色、白色，雄蕊有的可育，有的不育，雄蕊的長短不同等。圖8為蕓薹屬異源六倍體再生植株的花穗、結實。由圖8可見，DH再生植株的花較大，結實性好，但每莢中種子數量較少。圖9為蕓薹屬異源六倍體的再生植株的分枝和根部狀況。由圖9可見，由根部萌發(fā)的主枝較多，最多可以達到3～4個。DH再生植株經過一定的低溫處理，可以獲得一些葉片皺縮突變體（圖10）。圖11為再生植株與大白菜的雜交種。由圖11可見，雜交種表現為中間類型，性狀更偏向于大白菜。

圖7 蕓薹屬異源六倍體不同再生植株的花

圖8 蕓薹屬異源六倍體的再生植株花穗、結實

綜上所述，獲得的DH再生植株性狀差異較大，表現為類型多樣、性狀各異等。性狀主要表現為：花色有黃色、白色和淺黃色；花粉有的多，有的少，有的全無；同一朵花的雄蕊有的可育，有的不育，6個雄蕊的長短也不同等?？梢?，對蕓薹屬異源六倍體CGMCC No.2553進行游離小孢子培養(yǎng)，可以獲得多種類型的中間材料，而且也可以獲得與大白菜雜交的中間類型材料。

2.2 DH再生植株的自交結實

2007-2008年，在日光溫室中共定植220株DH再生植株。在蕾期，采用人工剝蕾的方法自交留種。目前僅獲得12株DH再生植株的自交種子，其余208株再生株因為前期無花粉、花粉少，染色體基因型不配對等內在原因，自交后沒有得到種子。但是，在208株DH再生植株中，部分沒有套袋的枝條可以獲得若干種子，這些種子是自交種子還是雜交種子還有待進一步鑒定。另外，有的DH再生植株初花期花粉量較多，后期逐漸減少，而且多次重復授粉很難得到自交種子，其原因有待于進一步研究。

圖9 蕓薹屬異源六倍體再生植株的分枝和根部狀況

圖10 再生植株葉片皺縮突變體

更有意義的是，將再生植株置于4～5℃低溫條件下處理15～20 d或自然慢慢通過低溫處理30～40 d后，定植到日光溫室中生長，在生育后期可以獲得一些葉片皺縮突變體 （圖10）。試驗證明，2007-2008年，采用上述方法重復進行試驗，每次都能獲得一定數量的葉片皺縮突變體。

2.3 大白菜與DH再生株雜交F1代的獲得及鑒定

采用3份大白菜 （08-784，08-786和08-916）分別與DH再生株正反交雜交，部分雜交可以正常結實，目前，已經得到4份雜交F1代種子，并獲得了幼苗。通過田間植物學性狀鑒定，認為是真正雜種。同時，正在采用SSR等分子標記技術鑒定雜交種的真?zhèn)涡浴?/p>

3 小結與討論

3.1 游離小孢子培養(yǎng)

蕓薹屬異源六倍體CGMCC No.2553的游離小孢子培養(yǎng)技術規(guī)程與綠菜花的培養(yǎng)技術相似，熱激處理溫度為32.5℃1 d，蔗糖濃度以10%為宜。因蕓薹屬異源六倍體CGMCC No.2553花蕾較大，取材時健康花蕾長度在2.0～3.5 mm為宜。蕓薹屬異源六倍體的胚胎發(fā)生率較低，因為沒有詳細地研究影響供試材料胚胎發(fā)生的各種因素，從而優(yōu)化培養(yǎng)條件，因此，沒有獲得較高的胚胎發(fā)生率。供試材料單個胚的成苗率較高，一般一個胚可以分化成3株或更多的再生苗，這種現象在大白菜品種的游離小孢子培養(yǎng)中很少發(fā)現?！耙慌叨嗝纭钡膬?yōu)點首先是能夠提高DH再生株的成活率，其次有利于獲得基因型相同而某些性狀不同的突變型和野生型材料，如本研究中獲得的葉片皺縮突變體。由于它們只在葉片皺縮單一性狀上表現差異，而其他的遺傳性狀完全一致，因此它們是很好的野生型和突變型材料，為研究葉片皺縮的遺傳規(guī)律，定位、克隆和分離葉片皺縮基因，并探討葉片皺縮性狀在育種中作為標記性狀的應用等提供了可能。

3.2 再生株自交結實

在游離小孢子培養(yǎng)過程中，蕓薹屬異源六倍體CGMCC No.2553的染色體會發(fā)生隨機重組、交換等，出現A，B，C染色體間的多種組合，隨后有的自然加倍，成為二倍體、異源四倍體或其他多種倍性，因此，DH再生株會出現許多類型，表現在葉片缺刻、莖部顏色、花瓣顏色、花藥多少、育性、倍性等性狀的不同。在盛花期，有的DH植株由于無花粉、花粉干或花粉不穩(wěn)定、染色體不配對等，導致自交不結實，在本研究中，220株再生植株僅獲得12株再生株的自交種子。

3.3 大白菜與DH再生植株雜交種的獲得

所獲得的DH單株可以與3份大白菜正反交雜交的F1部分雜交結實正常。目前，已經驗證了獲得的F1代為真正的雜交種?？梢姡允|薹屬異源六倍體CGMCC No.2553為材料進行游離小孢子培養(yǎng)，不僅拓寬了蕓薹屬的種質資源，而且獲得的部分DH再生株可以與大白菜品種雜交，為今后獲得大白菜DH永久作圖群體，構建遺傳圖譜，開展相關基因的研究奠定了基礎，也為研究蕓薹屬A，B和C染色體的共線性提供了依據。

[1]U N.Genome analysis inBrassicawith special reference to the experimental formation ofB.napusand its peculiar mode of fertilization[J].Jap J Bot,1935,7:389-452.

[2]Attia T,R?bbelen G.Cytogenetic relationship within cultivatedBrassicaanalyzed in amphidiploid from the three diploid ancestors[J].Can J Genet Cytol,1986，28:323-329.

[3]栗茂騰，張椿雨，劉列釗，等.蕓薹屬A，B和C基因組之間關系研究進展[J].遺傳，2005，24（7）：671-676.

[4]孟金陵.蕓薹屬植物遠緣雜交不親和性的研究進展[J].中國油料，1987（4）：71-77.

[5]馮午，陳耀華.甘藍與白菜種間雜交的雙二倍體后代[J].園藝學報，1981，8（2）：37-40.

[6]張德雙，曹鳴慶，秦智偉.綠菜花游離小孢子培養(yǎng)、胚胎發(fā)生和植株再生[J].華北農學報，1998，13（3）：102-106.

Regeneration of Plant with Multiple Types from Allohexaploid CGMCC No.2553 in Brassica

ZHANG Deshuang,ZHANG Fenglan,XU Jiabing
(Beijing Vegetable Research Center,Beijing 100097)

Crossing with Chinese cabbage (Brassica campestrisL.ssp.Pekinensis),Brassicaallohexaploid CGMCC No. 2553 (AABBCC,n=27),which owns A,B and C chromosomes simultaneously,was used for isolated microspore culture. The results showed that it could form embryoid and could get regenerated plants.220 regenerated plants were grown at the greenhouse without heating apparatus.12 DH plants got seeds by self-pollination.Through crossing DH lines with 3 Chinese cabbage pure lines,4 F1hybrids were obtained.These hybrids were genuine hybrids by field checkup.They will be used for linkage map construction,locating and cloning the important genes in the future.

Brassicaallohexaploid CGMCC No.2553;Isolated microspore culture;Regeneration of plants;Chinese cabbage;Hybrid F1

10.3865/j.issn.1001-3547(x).2009.06.005

北京市農林科學院青年基金資助

張德雙（1969－），男，博士，副研究員，主要從事大白菜育種等研究工作，電話:010-51503038

2008-12-15