楊國志 張明方 顧掌根 緱艷霞

（1.浙江嘉興市農(nóng)科院，314016；2.浙江大學(xué)園藝系；3.呼和浩特職業(yè)技術(shù)學(xué)院）

NaN3處理?xiàng)l件下西瓜直接再生試驗(yàn)體系研究

楊國志1張明方2顧掌根1緱艷霞3

（1.浙江嘉興市農(nóng)科院，314016；2.浙江大學(xué)園藝系；3.呼和浩特職業(yè)技術(shù)學(xué)院）

以西瓜純種自交系伊選為材料，研究了化學(xué)誘變劑NaN3對西瓜直接再生試驗(yàn)體系的影響。研究發(fā)現(xiàn)，隨著疊氮化鈉濃度的升高，顯著的延遲了種子萌發(fā)、胚根發(fā)生、子葉開展、不定芽分化、伸長以及生根的時(shí)間，降低了芽分化頻率和每個(gè)外植體分化的不定芽數(shù)。1.5 mmol/L的NaN3振蕩處理1.5 h為最佳的誘變處理，使外植體再生頻率降低到40.0%，不定芽數(shù)/外植體降低到4.3，符合抗冷突變體半致死劑量的要求。

化學(xué)誘變 NaN3不定芽分化 半致死劑量

利用化學(xué)誘變劑，能誘導(dǎo)無性系的高頻率變異，通過一定的選擇壓力，可以篩選到一些有益的突變性狀和性狀優(yōu)良的突變體。本試驗(yàn)以西瓜自交系純種伊選為材料，采用化學(xué)誘變和植物組織培養(yǎng)相結(jié)合的方法，誘導(dǎo)和篩選西瓜抗冷突變體，建立在化學(xué)誘變劑處理?xiàng)l件下的西瓜直接再生試驗(yàn)體系，確定西瓜子葉生長、不定芽分化的最佳誘變濃度以及最適培養(yǎng)條件，確定抗冷突變體的半致死劑量；并對種子的發(fā)芽率、分化的不定芽數(shù)等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和形態(tài)觀察。為以后化學(xué)誘變劑存在條件下的西瓜體細(xì)胞無性系變異、基因轉(zhuǎn)化和突變體后代遺傳鑒定分析等方面的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所選用的材料為優(yōu)質(zhì)自交系純種伊選（‘YiXuan’YX-04），以子葉剛剛展開的無菌苗的下胚軸與子葉之間再生能力強(qiáng)的部位作外植體，用來分化不定芽。

培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件為發(fā)芽培養(yǎng)基：MS＋20 g/L蔗糖＋7 g/L瓊脂；芽分化培養(yǎng)基：MS+5 mg/L BA+ 0.1 mg/L IAA，芽伸長培養(yǎng)基：MS＋0.1 mg/L KT；生根培養(yǎng)基：MS+0.1 mg/L NAA。上述培養(yǎng)基均用1 mol/L的NaOH或HCL將pH值調(diào)至5.8，121℃恒溫滅菌20 min[1]。

1.2 試驗(yàn)處理

NaN3濃度用0.1 mol/L，pH值3.0的磷酸緩沖液配制NaN3溶液，過濾滅菌，設(shè)4個(gè)誘變濃度處理分別為 0.5，1.0，1.5，2.0 mmol/L。以磷酸緩沖液（CK2：0.1 mol/L磷酸緩沖液處理種子1.5 h）和不加磷酸緩沖液與疊氮化鈉（CK1：沒有做任何處理）處理為對照。

1.3 試驗(yàn)方法

①將成熟、飽滿一致的伊選種子在30℃的蒸餾水中浸泡5～6 h，小心去殼后浸入10%次氯酸鈉溶液中，置搖床上振蕩消毒10 min。用無菌水沖洗消毒后的種子3～4次，然后將其接種到發(fā)芽培養(yǎng)基上。先在黑暗條件下28℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待90%以上種子胚根露出0.5～3 mm以后，將其轉(zhuǎn)移到25℃，35～40 μmol·（m2·s）-1光照培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)，直至子葉展開，用于分化不定芽。

②將成熟、飽滿一致的伊選種子在30℃的蒸餾水中浸泡5～6 h，小心去殼后用0.1 mol/L，pH值3的磷酸緩沖液振蕩處理（180 r/min，25℃）1.5 h。再用自來水沖洗3～4 h，浸入10%次氯酸鈉溶液中，置搖床上振蕩消毒10 min。用無菌水多次沖洗消毒，然后將其接種到發(fā)芽培養(yǎng)基上。以下步驟同①。

③選取成熟、飽滿一致的伊選種子浸泡5～6 h，小心去殼后用0.1 mol/L，pH值3的磷酸緩沖液配制的規(guī)定濃度的NaN3振蕩處理（180 r／min，25℃ ）1.5 h。NaN3濃 度 分別為0.5，1.0，1.5，2.0 mmol/L。種子經(jīng)誘變劑處理后，用自來水沖洗3～4 h，再浸入10%次氯酸鈉溶液中，置搖床上振蕩消毒10 min。然后將用無菌水多次沖洗消毒后的種子接種到發(fā)芽培養(yǎng)基上。以下步驟同①。

④芽分化、伸長和生根培養(yǎng)。每個(gè)處理接種30粒種子，設(shè)3次重復(fù)。待種子發(fā)芽后，統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽率、胚根伸長量和子葉開展與時(shí)間的關(guān)系。以剛剛開展的子葉為外植體，將展開子葉的近軸端（帶1 mm左右的下胚軸）外植體接種到誘導(dǎo)不定芽分化培養(yǎng)基上 （MS+30 g蔗糖＋7 g瓊脂＋BA 5 mg/L+IAA 0.1 mg/L，本研究后面所用培養(yǎng)基均加30 g蔗糖和7 g瓊脂，pH值均調(diào)至5.8）。每個(gè)處理接種5個(gè)外植體，設(shè)3次重復(fù)。直至不定芽長至0.5～1.0 cm時(shí)。統(tǒng)計(jì)芽分化時(shí)間、植株再生頻率和平均芽數(shù)。

將分化后的不定芽（芽長0.5～1.0 cm）轉(zhuǎn)到芽伸長培養(yǎng)基上進(jìn)行伸長培養(yǎng)（CK1和CK2直接接種到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)生根所需天數(shù)），待不定芽在伸長培養(yǎng)基上長至1.5～2.0 cm后，對不定芽進(jìn)行形態(tài)觀察并統(tǒng)計(jì)伸長時(shí)間。

將不定芽自基部切下，轉(zhuǎn)到MS＋0.1 mg/L NAA的生根培養(yǎng)基上生根培養(yǎng)20 d左右，待根生長到2～3 cm時(shí)，對不定芽進(jìn)行形態(tài)觀察并統(tǒng)計(jì)生根時(shí)間。生根幼苗在5℃低溫處理2 d，0℃低溫處理1 d后，轉(zhuǎn)到培養(yǎng)室繼續(xù)正常培養(yǎng)1周，然后開瓶煉苗2 d，洗掉根部的培養(yǎng)基后移栽到裝有蛭石的營養(yǎng)缽中。用塑料薄膜遮蓋以保濕，并保持適當(dāng)通風(fēng)透氣，期間澆灌1/2的MS營養(yǎng)液。4 d后揭去薄膜，在有散射光的室內(nèi)培養(yǎng)5 d，然后移栽到溫室培養(yǎng)。

⑤半致死劑量及相關(guān)關(guān)系的確定。半致死劑量是誘變育種適宜誘變劑量的參考，以不同濃度疊氮化鈉處理產(chǎn)生的不定芽的再生頻率計(jì)算其半致死劑量，即以不同誘變劑量x為自變量，不同劑量下的不定芽的再生頻率y為因變量，利用直線回歸方程y=a+bx和下列公式來計(jì)算誘變育種適宜的半致死劑量。式中，b為回歸系數(shù)；a為常數(shù)；x為所求半致死劑量。

相關(guān)系數(shù)反應(yīng)了不同的不定芽的再生頻率與誘變劑量的相關(guān)性質(zhì)及其緊密程度。相關(guān)系數(shù)為：

2 結(jié)果與分析

2.1 NaN3處理對西瓜發(fā)芽率和成苗率的影響

從表1可以看出，磷酸緩沖液對照處理和未做任何處理的對照之間對西瓜的發(fā)芽率和成苗率的影響沒有區(qū)別。但隨著NaN3濃度的增加，伊選的發(fā)芽率和成苗率呈逐漸下降的趨勢，當(dāng)NaN3濃度為1.0 mmol/L時(shí)，發(fā)芽率和成苗率分別為66.7%和60.0%；當(dāng)NaN3濃度為1.5 mmol/L時(shí)，發(fā)芽率和成苗率還保持在55.0%左右，但當(dāng)NaN3濃度變?yōu)?.0 mmol/L時(shí)，伊選的發(fā)芽率和成苗率則分別驟降到30.0%和33.3%。相對1.5 mmol/L時(shí)，發(fā)芽率和成苗率同比分別下降了47.1%和70%。伴隨著NaN3濃度的升高，幼苗畸形的比例也相應(yīng)增加，主要表現(xiàn)為幼苗矮化，胚根變細(xì)，子葉葉面積變小，子葉上部發(fā)白或發(fā)黃，子葉變硬等。

表1 NaN3處理對西瓜子葉伸展和西瓜不定芽直接再生的影響

2.2 NaN3處理對西瓜胚根伸長的影響

低濃度的NaN3處理對胚根的伸長影響較小，0.5 mmol/L濃度處理的種子在第3 d胚根就伸長到2.0 mm左右。1.0 mmol/L濃度處理的種子胚根伸長趨勢和0.5 mmol/L濃度處理的種子相似。但高濃度的NaN3處理則顯著的抑制了胚根的伸長，當(dāng)NaN3濃度達(dá)到1.5 mmol/L時(shí)，明顯的抑制了胚根的伸長生長，在第3 d胚根才伸長到0.5 mm，第6 d胚根才僅僅2.0 mm。當(dāng)NaN3濃度為2.0 mmol/L時(shí)，胚根在前4 d基本沒有伸長，到第6 d時(shí)也只有1.5 mm長。而2個(gè)對照之間胚根的伸長幾乎沒有差別，都在第2 d的時(shí)候達(dá)到5 mm左右。

2.3 NaN3處理對西瓜子葉伸展的影響

將在黑暗條件下28℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)的種子轉(zhuǎn)到光照培養(yǎng)室繼續(xù)培養(yǎng)，觀察子葉伸展的情況，統(tǒng)計(jì)從黑暗條件下培養(yǎng)到光下培養(yǎng)，子葉剛剛開展所需要的時(shí)間。

從表1可以看出，低濃度的NaN3處理對子葉伸展所需時(shí)間基本無影響，0.5 mmol/L濃度處理和1.0 mmol/L濃度處理在第4 d的時(shí)候子葉開展；而高濃度的NaN3處理則明顯延長了子葉伸展的時(shí)間，隨著NaN3濃度的增大，子葉伸展時(shí)間最多的延遲了5 d。磷酸緩沖液對照處理和未做任何處理的對照對子葉的伸展影響一致，子葉都在第3 d的時(shí)候展開。

2.4 NaN3處理對西瓜不定芽分化的影響

①NaN3處理對不定芽生長的影響 將展開子葉的近軸端（帶1 mm左右的下胚軸）外植體接種到誘導(dǎo)不定芽培養(yǎng)基上。直至不定芽長至0.5～1.0 cm。統(tǒng)計(jì)芽分化時(shí)間、植株再生頻率和平均不定芽數(shù)/外植體。磷酸緩沖液對照處理和未做任何處理的對照之間不定芽的分化情況基本一致，都在10 d左右出現(xiàn)，在15 d左右不定芽伸長到6～7 mm。低濃度的NaN3處理對不定芽分化影響較小，中等濃度和高濃度的NaN3處理對不定芽分化影響較大，不僅延遲了芽分化的時(shí)間，而且分化出的不定芽葉片比沒有經(jīng)過處理的葉片細(xì)，出現(xiàn)皺縮，生長緩慢，外植體邊緣有輕度黃化現(xiàn)象。如2.0 mmol/L濃度處理在16 d時(shí)才有不定芽產(chǎn)生，在25 d時(shí)不定芽的伸長也僅僅有5 mm。

②NaN3處理對不定芽直接再生的影響 試驗(yàn)結(jié)果表明，高濃度的NaN3溶液處理對西瓜直接再生不定芽的再生頻率、不定芽數(shù)都有顯著影響。從表1可以看出，1.0 mmol/L和1.5 mmol/L處理無論對再生頻率還是不定芽數(shù)的影響都比較適中，既能保證獲得一定數(shù)量的不定芽，又能達(dá)到一定的選擇效果，基本上符合半致死處理?xiàng)l件。求得的直線回歸方程為y=-0.253x+0.8，誘變的半致死劑量為1.18 mmol/L，相關(guān)系數(shù)為0.93。1.5 mmol/L處理和2.0 mmol/L處理，分別使再生頻率降低到40.0%和33.3%，每個(gè)外植體分化的平均不定芽數(shù)分別降低到4.3個(gè)和3.4個(gè)。與對照CK1和CK2的再生頻率100%和平均芽數(shù)7.8個(gè)相比，差異極顯著。1.0 mmol/L和1.5 mmol/L處理再生頻率間差異不顯著?？紤]到突變頻率的提高和突變體植株發(fā)生數(shù)量的關(guān)系，直接再生途徑NaN3處理誘導(dǎo)體細(xì)胞無性系變異試驗(yàn)中，采用1.5 mmol/L濃度處理誘導(dǎo)子葉外植體不定芽的發(fā)生較好，既能得到較高的突變頻率，又能保證得到一定數(shù)量的突變體植株。

③NaN3對不定芽伸長的影響 CK1和CK2在芽分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 d后，將再生芽自芽基部切下插入生根培養(yǎng)基直接生根培養(yǎng)。而NaN3處理過的種子分化的不定芽在分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，則接種到伸長培養(yǎng)基上繼續(xù)伸長培養(yǎng)。0.5 mmol/L處理的不定芽生長較快，不定芽10 d左右就伸長到2.0～2.5 cm，1.0 mmol/L處理的不定芽生長趨勢和0.5 mmol/L處理的不定芽生長趨勢一致，在15 d左右達(dá)到最大的伸長量2.5 cm。1.5 mmol/L處理和2.0 mmol/L處理的不定芽生長比較緩慢，分別在20 d和25 d的時(shí)候達(dá)到各自的最大伸長量2.5 cm和2.0 cm。

2.5 NaN3處理對西瓜生根的影響

不定芽在伸長培養(yǎng)基上伸長培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)生根培養(yǎng)所需時(shí)間。低濃度的NaN3處理對根的生長有輕微的抑制作用，高濃度的NaN3處理不僅延長了生根時(shí)間，而且也抑制了根的伸長，如1.5 mmol/L處理和2.0 mmol/L處理在第 25 d時(shí)根長分別是 2.5 cm和 2.0 cm。而 0.5 mmol/L處理和1.0 mmol/L處理根的伸長量分別在19 d和22 d的時(shí)候已達(dá)到3.5 cm。

3 小結(jié)與討論

磷酸緩沖液對伊選的胚根伸長、子葉開展、不定芽分化和生根所需時(shí)間以及幼苗的形態(tài)建成基本沒有影響，經(jīng)過磷酸緩沖液處理后產(chǎn)生的幼苗、分化的不定芽以及生根后的幼苗在生理形態(tài)上和未做任何處理的對照基本一致，兩者之間不存在顯著差異。鄭蔚虹等[2]用7．5 mmol/L，pH值5．8的磷酸緩沖液浸番茄種子5 h，結(jié)果促進(jìn)了番茄種子萌發(fā)和幼苗生長，而且幼苗在受低溫脅迫[（5±1）℃，48 h]時(shí)，磷酸緩沖液能有效地降低相對電導(dǎo)率、減緩MDA的積累，減輕膜質(zhì)過氧化作用，穩(wěn)定膜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能，促進(jìn)脯氨酸積累，從而提高番茄幼苗的抗冷性。然而在本試驗(yàn)中，磷酸緩沖液浸種對西瓜種子萌發(fā)和幼苗生長基本沒有影響，和未作任何處理的對照之間差異不顯著。

0.5 mmol/L的NaN3溶液處理對胚根的伸長、子葉的開展、不定芽的分化、不定芽/外植體數(shù)、不定芽的伸長和生根影響輕微，與對照CK1和CK2沒有顯著性差異。1.0 mmol/L和1.5 mmol/L的NaN3溶液處理對胚根伸長、子葉開展、不定芽分化、不定芽/外植體數(shù)、不定芽伸長和生根影響顯著，顯著的延遲了胚根發(fā)生、子葉開展、不定芽分化、伸長以及生根的時(shí)間，降低了芽分化的頻率和不定芽/外植體數(shù)，如1.0 mmol/L處理和1.5 mmol/L處理，分別使再生頻率降低到46.7%和40.0%，不定芽數(shù)/外植體分別降低到4.7和4.3。2.0 mmol/L NaN3處理對芽分化、芽伸長和生根都有很強(qiáng)的抑制作用，芽分化時(shí)間變長，外植體分化頻率降低，每個(gè)外植體芽分化個(gè)數(shù)減少，褐化和玻璃化的外植體個(gè)數(shù)增加，分化的不定芽較矮小和緊湊，分化的不定芽在伸長和生根培養(yǎng)基上生長不良，表現(xiàn)為葉皺縮，變細(xì)，分枝增多，生長緩慢或停滯等。

張?zhí)m等[3]用疊氮化鈉對蘋果葉片進(jìn)行誘變處理，研究發(fā)現(xiàn)疊氮化鈉對葉片再生有明顯影響，其存活率、再生率和再生芽數(shù)均比對照有所下降。張超美[4]的研究也表明，疊氮化鈉對小麥幼苗生長有抑制作用，在萌發(fā)初期主要表現(xiàn)為對種子啟始萌發(fā)的延滯效應(yīng)，且延滯時(shí)間隨處理濃度升高而相應(yīng)延長；且隨著溶液濃度遞增，發(fā)芽勢和出苗率也依次下降，并明顯的抑制了幼苗生長。本試驗(yàn)中，我們也觀察到了類似的現(xiàn)象，隨著疊氮化鈉濃度的升高，西瓜種子萌發(fā)時(shí)間明顯延遲，2個(gè)對照在第2 d時(shí)胚根已有5 mm左右，而當(dāng)NaN3濃度為2.0 mmol/L時(shí)，胚根在前4 d基本沒有伸長，到第6 d時(shí)胚根伸長也僅僅只有1.5 mm。當(dāng)NaN3濃度變?yōu)?.0 mmol/L時(shí)，伊選的發(fā)芽率和成苗率則分別驟降到30.0%和33.3%。相對1.5 mmol/L，發(fā)芽率和成苗率同比分別下降47.1%和70%，其發(fā)芽時(shí)間和子葉開展時(shí)間也相應(yīng)延后。1.5 mmol/L處理和2.0 mmol/L處理，分別使再生頻率降低到40.0%和33.3%，每個(gè)外植體平均分化的不定芽數(shù)分別降低到4.3個(gè)和3.4個(gè)。與對照CK1和CK2的再生頻率100%和每個(gè)外植體平均分化的不定芽數(shù)7.8個(gè)相比，差異極顯著。

[1]張全美.西瓜高效植株再生體系建立及四倍體離體誘導(dǎo)研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2004.

[2]鄭蔚虹，張東向，張曉兵，等.磷酸緩沖液浸種對番茄幼苗抗冷性的影響[J].齊齊哈爾師范學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，1997，17（3）：53－55.

[3]張?zhí)m，孫建設(shè)，劉國榮.NaN3在蘋果砧木組培苗誘變耐鹽篩選中的應(yīng)用[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002（25）：108-110.

[4]張超美.疊氮化鈉對小麥的誘變效應(yīng)[J].湖北農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1994，14（3）：56－60．

Study on the Direct Regeneration System of Watermelon under the Treatment of NaN3

YANG Guozhi1,ZHANG Mingfang2,GU Zhanggen1,GOU Yanxia3
(1.Jiaxing Academy of Agricultural Sciences,Zhejiang 314016;2.Department of Horticulture,Zhejiang University; 3.Huhehaote Vocational Technical College)

Pure watermelon inbred line"Yixuan"was used in this experiment,the effects of NaN3on the direct regeneration system of watermelon was studied.The results showed that with the increase of NaN3concentration,the time of germination,radicle elongation,cotyledon extending,adventitious bud differentiation and elongation,and root regeneration was deferred distinctly;the percentage of adventitious bud differentiation and the ratio of adventitious bud differentiation per explant was lowered too.The best concentration for inducing chilling resistant mutant in"Yixuan"was 1.5 mmol/L,which decreased the frequency of explant regeneration to 40.0%,and the adventitious buds per explant to 4.3.It is accorded with the requirement ofLD50for chilling resistant mutant.

Chemical mutagenesis;NaN3;Adventitious bud differentiation;LD50

10.3865/j.issn.1001-3547(x).2009.06.004

楊國志（1979-），男，碩士，主要從事西瓜、甜瓜育種研究，電話：13957346489。E-mail:gzhyang99@126.com

2009-02-03