張　輝　李玉虎

【摘要】 目的 研究中藥復(fù)方促使T淋巴細胞增殖。方法 從SD大鼠血液里分離淋巴細胞，進行體外培養(yǎng)。設(shè)正常細胞對照組、陽性藥物對照組、轉(zhuǎn)移因子組、復(fù)方中藥高劑量組、中劑量組、低劑量組。培養(yǎng)1 d后把藥加入培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)2 d，加Am-Blue細胞增殖與活性檢測試劑，避光培養(yǎng)4 h后，通過酶標(biāo)儀檢測，分析淋巴細胞的增值情況。結(jié)果 中藥復(fù)方高、中、低劑量組OD值均明顯增高，與空白組比較P＜0.01；與陽性藥物對照組比較，P＜0.01；高劑量組與中、低劑量組比較P＜0.01；轉(zhuǎn)移因子組與空白組比較P＜0.01。結(jié)論 中藥復(fù)方能促使T淋巴細胞增殖，且與劑量有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 中藥復(fù)方；T淋巴細胞；增殖

Study on compound traditional chinese medicine promote toT-lymphocyte proliferation experiment

ZHANG Hui, LI Yu-hu. Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

Shanghai201203,China

【Abstract】Objective Study of compound traditional Chinese medicine can promote to T-lymphocyte proliferation. Methods Separate T-lymphocyte from blood of SD rat, culture in vitro. Install normal cell control group, active-drug control group, transfer factor group, compound traditional Chinese medicinehigh dose group、middle dose group，low dose group. Give the medicine to culture medium after culture one day. Continue to culture 2 days and take Am-Blue into 96 orifice plate, culture 4 hours in dark. Use enzyme-labelling measuring instrument to measure after three days. Analyse proliferation of T-lymphocyte. Results OD of compound traditional Chinese medicine high dose group、middle dose group、low dose groupcan improve obviously. Theirs compare to blank control group P＜0.01; theirs compare to Active-drug control group P＜0.01; compound traditional Chinese medicinehigh dose group compare to middle dose group、low dose group P＜0.01. transfer factor group compare to blank control group P＜0.01. Conclusion Compound traditional Chinese medicine can promote to T-lymphocyte proliferation, and relation to dosage.

【Key words】Compound traditional Chinese medicine; T-lymphocyte; Proliferation

轉(zhuǎn)移因子(Transfer factor TF)是從致敏動物的白細胞或脾臟、淋巴結(jié)等免疫器官中提取的一種低分子量多肽—核苷酸復(fù)合物，因其能將供體某種特定的細胞免疫功能特異地轉(zhuǎn)移給受體，故稱為轉(zhuǎn)移因子。目前對轉(zhuǎn)移因子的研究很多，本研究通過轉(zhuǎn)移因子與中藥的復(fù)方來研究中藥復(fù)方對體外培養(yǎng)的大鼠淋巴細胞的影響作用，分析復(fù)方轉(zhuǎn)移因子各種組別對細胞增殖的影響及與劑量的關(guān)系，為后續(xù)的體內(nèi)試驗提供參考依據(jù)，探討復(fù)方中藥免疫增強作用和對復(fù)方轉(zhuǎn)移因子的臨床應(yīng)用開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物SD大鼠，雄性，體質(zhì)量（180±10）g，清潔級動物，中科院上海實驗動物中心提供。

1.1.2實驗室氣象條件溫度22℃～25℃，濕度40%～70%。

1.1.3試劑與儀器

1.1.3.1試劑 淋巴細胞分離液（Sigma公司）、RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清（FCS）、Am-Blue細胞增殖與活性檢測試劑（SunBioTM公司）、PHA（植物凝集素）、IL-2（Sigma公司）；復(fù)方轉(zhuǎn)移因子，本實驗室制備。健康豬脾，用超濾儀超濾，得轉(zhuǎn)移因子溶液（10 mg/ml左右）。中藥（ 紫花地丁、野菊花、甘草等）煎煮2次，濃縮后加食用酒精提取。二者按一定的比例混合，得復(fù)方中藥。復(fù)方中藥中的轉(zhuǎn)移因子含量為0.05g/10ml和中藥生藥含量為5 g/10 ml。

1.1.3.2 儀器 CO2培養(yǎng)箱（RSBiotech公司））、Elx800酶標(biāo)儀（美國BIO-TEK公司）。

1.2方法

1.2.1 采血

每次試驗均先麻醉SD大鼠，用5 ml注射器（預(yù)先抽取0.2 ml肝素）從大鼠腹主動脈抽血

3 ml。

1.2.2分離

將血液緩慢加入預(yù)先已加入淋巴細胞分離液的離心管中，血液與分離液的比例為1∶1。以

4℃、2000 r/min 離心20 min，液相分為三層，上層為自體血清層，中層為淋巴細胞層（乳白色云霧狀），下層為分離液和紅細胞層。用微量進樣器抽取淋巴細胞放入無菌的離心管中。

1.2.3 洗滌

將收集到的淋巴細胞集中于一支離心管中用PBS洗滌2次，均以2000r/min離心10 min，棄上清。

1.2.4 培養(yǎng)

洗滌后得到的淋巴細胞團用少量RPIM1640培養(yǎng)液(含10％血清)打散，用血細胞計數(shù)板統(tǒng)計調(diào)節(jié)細胞初始濃度至1×105，取160 μl轉(zhuǎn)入96孔培養(yǎng)板，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，條件為37℃、5％CO2、飽和濕度。

1.2.5 分組

在96孔板中設(shè)置正常細胞組，陽性藥物對照組（含ＰＨＡ和ＩＬ－２），轉(zhuǎn)移因子組（TF組）復(fù)方中藥高劑量組、中劑量組、低劑量組，同時設(shè)置空白對照孔（含培養(yǎng)液和Am-Blue試劑）。

1.2.6 加藥

培養(yǎng)一天后在正常細胞組中加入40 μl無菌生理鹽水，在陽性藥物對照組中加入40 μl PHA（100μg/ml）和IL-2，在TF組中加入40 μl TF，在復(fù)方中藥高劑量組中加入40 μl藥物，中劑量組中加入20 μl藥物和20 μl生理鹽水，低劑量組中加入5 μl藥物和35 μl生理鹽水。培養(yǎng)72 h后加入Am-Blue檢測試劑20 μl/孔。

1.2.7 檢測

培養(yǎng)4 h后，可見無熒光的靛青藍變?yōu)橛袩晒獾姆奂t色，上酶標(biāo)儀檢測。以570 nm波長檢測各孔OD值。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差( ±s)表示,用統(tǒng)計軟件SPSS13.0 進行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計方法用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 藥物組與正常細胞組比較對淋巴細胞增值的影響（見表1）。

由表1可知，陽性藥物對照組，轉(zhuǎn)移因子組，復(fù)方中藥高、中、低劑量組均極顯著地促進淋巴細胞的增值，P＜0.01。6個藥物組促進淋巴細胞增殖的強弱順序依次為復(fù)方中藥高劑量組＞復(fù)方中藥中劑量組＞復(fù)方中藥低劑量組＞TF組＞陽性藥物對照組。

2.2 復(fù)方中藥組、TF組與陽性藥物組比較對淋巴細胞增殖的影響（見表1）

由表1可知，復(fù)方中藥高、中、低劑量組與陽性藥物組比較P＜0.01；TF組與陽性藥物組比較P＜0.01。

2.3復(fù)方中藥組高、中、低劑量組比較對淋巴細胞增殖的影響（見表1）

由表1可知，復(fù)方中藥高、中劑量組與低劑量組比較P＜0.01。 可見復(fù)方中藥對淋巴細胞的增值作用與劑量關(guān)系密切。

3 討論

機體免疫系統(tǒng)中淋巴細胞增殖是機體對非己抗原刺激產(chǎn)生免疫應(yīng)答過程中的重要事件。淋巴細胞增殖結(jié)果表現(xiàn)為產(chǎn)生效應(yīng)淋巴細胞。清除非己抗原，維護機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。T細胞活化是細胞免疫應(yīng)答早期的重要變[1],化淋巴細胞增殖效果決定效應(yīng)淋巴細胞的數(shù)量，決定了機體免疫應(yīng)答反應(yīng)的強度，反映機體的細胞免疫狀態(tài)[2]。因此，淋巴細胞增殖實驗的結(jié)果是細胞免疫的一個測定指標(biāo)。

轉(zhuǎn)移因子(Transfer factor，TF)是存在于人和動物免疫淋巴細胞內(nèi)的可透析的小分子物質(zhì)，屬于多肽和多核苷酸類，分子質(zhì)量大約為3～15 ku。TF成分復(fù)雜，它能夠特異性將供體細胞免疫力傳遞到受體細胞內(nèi)，特異性地增強受體免疫功能，是一種新型免疫激發(fā)劑，且具有傳遞免疫信息、激發(fā)免疫細胞活性、調(diào)節(jié)免疫功能、增強機體非特異性細胞免疫功能等作用，被譽為T細胞活性的觸發(fā)劑，細胞免疫的增強劑、細胞免疫調(diào)節(jié)劑及干擾素產(chǎn)生啟動劑[3]。轉(zhuǎn)移因子自1953被Sherwood Lawrence[4]發(fā)現(xiàn)以來,作為具有特異和非特異性免疫活性的細胞調(diào)節(jié)因子,免疫增強劑已顯示出其廣闊的應(yīng)用前景,也吸引著大批國內(nèi)外科學(xué)工作者從事轉(zhuǎn)移因子實驗及臨床研究。轉(zhuǎn)移因子對各類疾病的治療機理的報道也日趨增多。目前很多學(xué)者將TF應(yīng)用于特種經(jīng)濟動物傳染病的治療，取得較大的進展[5]。

PHA和IL-2能促使體外淋巴細胞增殖，IL-2是淋巴細胞體外增殖的必備條件。本實驗PHA和IL-２的用量分別是100 μg/ml、100 μg/ml。本實驗使用Am-Blue 細胞增殖與活性檢測試劑來替換MTT。Am- Blue 細胞增殖與活性檢測試劑是一種能簡便、迅速、可靠地定量檢測多種動物細胞系、細菌、真菌增值與活性的試劑。與MTT相比有以下優(yōu)點：1，操作簡捷，一步到位；2，無細胞毒，后續(xù)可用；3，應(yīng)用廣泛，用途多樣；4，雙色檢測，靈敏度高；兼容性強，穩(wěn)定性好。如今在國外使用頻繁。

本實驗結(jié)果顯示，8個組均能不同程度低促進淋巴細胞的增值，復(fù)方中藥組明顯優(yōu)于其他組，尤以復(fù)方中藥組促進淋巴細胞增值的作用最佳，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。提示復(fù)方中藥可以促進淋巴細胞的增值，且效果明顯，中藥與轉(zhuǎn)移因子組成的復(fù)方不是簡單的相加，它們在發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能時具有協(xié)同促進作用。這為進一步探討復(fù)方中藥的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

參考文獻

[1] 侯會娜,曾耀英，等. 金銀花提取物對小鼠淋巴細胞體外活化與增殖的影響.免疫學(xué)雜志，2008，24（2）：183.

[2] 趙潔，王曦鳴，李繼祥. MTT法檢測淋巴細胞增殖能力的影響因素.畜禽業(yè)，2008，226（2）：28.

[3]孫衛(wèi)民，王惠琴．細胞因子研究方法學(xué).人民衛(wèi)生出版社，2001.

[4] Lawrence HS. The transfer in humans of delayed skin sensitivity to Streptococcial M

substances and to tuberculin with disrupted leukocytes. J Clin Invest，1955，34:219-

230.

[5] 常建軍. 轉(zhuǎn)移因子的研究現(xiàn)狀及臨床應(yīng)用進展.青海大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2007，25(2):34-35.