摘要: 為了從細(xì)胞學(xué)角度研究大蔥雄性不育的機(jī)理， 利用石蠟切片法對大蔥雄性不育系及保持系花藥與花粉發(fā)育過程進(jìn)行比較研究。觀察結(jié)果表明: 大蔥雄性不育系和保持系的小孢子母細(xì)胞都能正常進(jìn)行減數(shù)分裂， 四分體可以釋放出小孢子。雄性不育系的花粉敗育發(fā)生于單核小孢子時期， 具有單核敗育的特征。觀察發(fā)現(xiàn)大蔥雄性不育系的小孢子有2 種敗育類型: ( 1) 絨氈層細(xì)胞正常發(fā)育， 但中層細(xì)胞發(fā)生了延遲解體的現(xiàn)象， 小孢子時期仍然存在， 與逐漸縮小的藥室一起擠壓小孢子細(xì)胞成一染色極深的團(tuán)塊狀物質(zhì); ( 2) 絨氈層提前解體， 不能提供小孢子發(fā)育所需的營養(yǎng)， 小孢子的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核逐漸解體， 僅剩下內(nèi)空的花粉粒?；ǚ蹟∮粌H與絨氈層有關(guān)， 還與中層細(xì)胞密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞: 大蔥; 雄性不育; 小孢子發(fā)育

大蔥(Allium fistulosum L.) 是我國栽培的重要蔥蒜類蔬菜之一。目前， 利用雄性不育系是生產(chǎn)大蔥雜交種的唯一途徑。20 世紀(jì)70 年代張啟沛等[1]在大蔥自然群體中發(fā)現(xiàn)了雄性不育株， 并認(rèn)為在我國大蔥地方品種中雄性不育廣泛存在。山東農(nóng)業(yè)大學(xué)和山東省章丘市農(nóng)業(yè)局以章丘大蔥中發(fā)現(xiàn)的雄性不育株為不育源， 育成雄性不育系， 不育株率在95% 以上， 并利用雄性不育系配制了一些雜交組合[2]。有關(guān)細(xì)胞質(zhì)雄性不育的細(xì)胞學(xué)機(jī)理研究在擬南芥、大豆、水稻、油菜等作物上已有報道[3- 6]， 但國內(nèi)外對大蔥雄性不育研究較少， 對其不育機(jī)理尚不十分清楚， 本試驗以1 份大蔥雄性不育系及其保持系為試材， 采用石蠟切片技術(shù)， 觀察雄性不育系和相應(yīng)可育保持系小孢子的發(fā)育過程， 探索大蔥雄性不育系花粉敗育的時期和方式， 以了解大蔥的雄性不育細(xì)胞學(xué)特征及雄性不育機(jī)理， 為大蔥雄性不育系的研究和應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

本試驗以1 份大蔥雄性不育系及其相應(yīng)保持系( 從章丘大蔥中選育而成) 花蕾作為研究材料， 于2005 年7 月24 日取不同生長發(fā)育期的花蕾按大小分級后迅速用50% 的FAA 固定液固定24 h， 逐級酒精脫水， 石蠟包埋， 采用常規(guī)石蠟切片法制片， 切片厚度10 !m， 番紅固綠染色法染色， 用加拿大樹膠封片。最后用Olympus BH- 2 型攝像生物顯微鏡和全色膠卷照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蔥可育系花藥和小孢子發(fā)育過程的細(xì)胞學(xué)觀察

正?？捎笫[的花藥有4 個花粉囊， 呈蝶形， 花蕾橫切面呈三角形， 每一花蕾含有6 個花藥， 每一花藥4 室。一般將花藥發(fā)育過程分為造孢細(xì)胞期、小孢子母細(xì)胞期、四分體期、單核小孢子期、花粉粒成熟期。觀察表明， 大蔥同一花內(nèi)的不同花藥或同一花藥的不同藥室， 小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂多不同步，可分別處于減數(shù)分裂各期或四分體期。同一藥室，小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂多為同步。

2.1.1 造孢細(xì)胞期花藥壁由4 種組織細(xì)胞層構(gòu)成， 由外向內(nèi)分別為表皮、藥室內(nèi)壁、中層、絨氈層，其中絨氈層細(xì)胞核大， 細(xì)胞質(zhì)濃， 著色深( 圖版1) 。

2.1.2 小孢子母細(xì)胞期早期花粉母細(xì)胞為多邊形， 細(xì)胞核大， 具有1 個明顯的大核仁且被染色較深， 初生壁上已產(chǎn)生胼胝質(zhì)壁。隨著花粉母細(xì)胞逐步進(jìn)入減數(shù)分裂， 其間的孢間層逐漸溶解， 細(xì)胞相互分開， 變成圓球形。此期的絨氈層細(xì)胞較大， 呈四邊形且狹長， 成圈狀規(guī)則排列在小孢子母細(xì)胞周圍， 有一些細(xì)胞為二核， 核大， 著色深且多核仁( 圖版2) 。此時中層細(xì)胞扁平， 多數(shù)中層細(xì)胞已解體斷裂。

2.1.3 四分體期減數(shù)分裂形成的四分小孢子由胼胝質(zhì)所包圍， 形成左右對稱及十字交叉形的立體結(jié)構(gòu)， 著色深( 圖版3) 。

2.1.4 單核小孢子期減數(shù)分裂后， 包裹著四分小孢子的胼胝質(zhì)壁解體， 釋放出單個的小孢子。四分體小孢子分開時， 絨氈層細(xì)胞體積達(dá)最大。剛釋放出來的小孢子細(xì)胞壁很薄， 細(xì)胞核位居細(xì)胞中央( 圖版4) 。單核晚期， 花粉粒壁逐漸加厚且逐漸趨于圓球形， 著色較深， 分散于花粉囊中。此期， 絨氈層細(xì)胞開始自我解體。

2.1.5 花粉粒成熟期小孢子變圓， 絨氈層細(xì)胞消失， 成熟花藥的藥壁由表皮及具條紋加厚壁的藥室內(nèi)壁組成( 圖版5) 。成熟后期， 花藥在抗拉力弱的僅由薄壁細(xì)胞組成的藥室內(nèi)壁處縱向開裂， 使同側(cè)的2 個花粉囊相連通， 花粉沿裂縫散出。

2.2 大蔥不育系花藥和小孢子發(fā)育過程的細(xì)胞學(xué)觀察

大蔥雄性不育系小孢子母細(xì)胞的形態(tài)與減數(shù)分裂活動正常， 能形成正常的小孢子細(xì)胞， 而且絨氈層的活動在此期也沒有發(fā)生異常， 與可育系的絨氈層相似( 圖版6) 。但絕大多數(shù)小孢子不能進(jìn)一步發(fā)育成雄配子體而開始敗育， 極少數(shù)可發(fā)育到二孢花粉初期或中期而敗育。小孢子敗育方式可分為以下2種類型:

2.2.1 敗育Ⅰ型花藥發(fā)育到單核小孢子時期， 組成花藥藥室的絨氈層像可育系一樣正常發(fā)育， 適時解體， 在成熟花粉粒時期完全解體。但中層細(xì)胞則存在延遲解體的現(xiàn)象， 在單核小孢子時期仍然存在，在小孢子外圍成1 圈。大部分的花藥壁極度收縮和解體的絨氈層融合在一起， 與中層細(xì)胞一起壓迫小孢子， 使之形成一染色極深的團(tuán)塊狀物質(zhì)( 圖版7) 。開花時， 藥室內(nèi)壁細(xì)胞排列緊密不能像可育系一樣藥室開裂散放花粉， 使團(tuán)塊狀小孢子存留在藥室內(nèi)部。最終花藥癟縮變形， 各藥室扭曲極為嚴(yán)重。

2.2.2 敗育Ⅱ型在單核小孢子期以前， 絨氈層與正常花藥組織無異， 在四分體后期分泌出胼胝質(zhì)酶來溶解包裹著減數(shù)分裂四分體的一層胼胝質(zhì)壁， 釋放出單倍體小孢子。但在單核小孢子早期， 絨氈層提前解體， 不能持續(xù)提供小孢子發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)。從四分體中釋放出來的單核小孢子， 在早期即形成了明顯的花粉壁結(jié)構(gòu)， 晚期單核小孢子得不到正常發(fā)育所需的足夠營養(yǎng)物質(zhì)， 致使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核相繼降解， 細(xì)胞質(zhì)染色淡， 核仁很小， 到成熟時核仁消失， 僅剩下內(nèi)空的花粉壁外殼。此時， 成熟花藥的藥壁由表皮及具條紋加厚壁的藥室內(nèi)壁組成( 圖版8) 。在花粉粒成熟晚期， 花藥與可育系一樣在藥室內(nèi)壁處縱向開裂， 花粉沿裂縫散出或者附著在花藥內(nèi)壁上， 只是散出的花粉為內(nèi)空的無生命活力的花粉粒( 圖版9) 。

3 討論

3.1 大蔥雄性不育系小孢子的敗育時期

Laser 等[7]在總結(jié)前人研究的基礎(chǔ)上提出: 植物雄性不育花藥的敗育可以發(fā)生在小孢子發(fā)育的每個時期， 雄性不育可能涉及不止一個機(jī)制; 單子葉植物花藥敗育多數(shù)在單核至雙核期， 雙子葉植物中大多數(shù)發(fā)生在四分體和小孢子形成期。席湘媛[8]曾報道大蔥的花粉敗育發(fā)生在具液泡的單核小孢子期早期， 這與本試驗的觀察結(jié)果有所差異。筆者觀察發(fā)現(xiàn)大蔥小孢子敗育多發(fā)生在單核小孢子晚期， 這也許是不同敗育類型之間有所差異。綜合前人研究和本試驗結(jié)果可以看出， 不同作物的雄性不育系小孢子敗育時期不同， 即使同一種作物， 其不同類型、不同來源的雄性不育系小孢子敗育時期也不盡相同，可能受外界環(huán)境的影響比較大。但是， 正如Laser 所說， 敗育發(fā)生在花粉發(fā)育的所有階段， 只是有些差異明顯， 有些差異不明顯， 不易觀察到。

3.2 有關(guān)花粉敗育原因的探討

關(guān)于植物雄性不育系小孢子的敗育原因， 許多學(xué)者從解剖學(xué)、細(xì)胞學(xué)與代謝角度， 通過小孢子發(fā)育的營養(yǎng)供給途徑等方面進(jìn)行了探討， 大多數(shù)將其敗育歸因于絨氈層的異常[9- 12]。

植物絨氈層的已知功能至少有3 個[13]: ( 1) 給產(chǎn)生小孢子的組織及小孢子提供營養(yǎng); ( 2) 分泌出胼胝質(zhì)酶溶解包裹著減數(shù)分裂四分體的一層胼胝質(zhì)壁，釋放出單倍體小孢子， 胼胝質(zhì)酶的適時分泌在花粉發(fā)育中起著關(guān)鍵性的作用; ( 3) 產(chǎn)生生物合成花粉外壁的前體物。從本試驗觀察結(jié)果可以看出， 大蔥可育的正?；ㄋ幇l(fā)育過程中， 在四分體形成期的絨氈層細(xì)胞質(zhì)有濃縮的趨向， 染色最深， 核有時被覆蓋，這時多數(shù)為雙核。因此可得出結(jié)論， 四分體時期是積累營養(yǎng)的最佳時期， 這與席湘媛的研究結(jié)果一致14]。在單核小孢子時期， 絨氈層細(xì)胞適時解體， 及時提供花粉發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)并為花粉粒體積激增提供空間。而在大蔥雄性不育系花藥的發(fā)育過程中， 絨氈層細(xì)胞出現(xiàn)了提前或延遲解體的現(xiàn)象。

絨氈層細(xì)胞提早凋亡現(xiàn)象可能是由于絨氈層細(xì)胞的程序性死亡或細(xì)胞凋亡引起的[14]。這種程序化死亡過程如果紊亂， 會發(fā)生絨氈層細(xì)胞提早降解的現(xiàn)象， 最終導(dǎo)致小孢子在發(fā)育過程中不能從絨氈層獲得足夠的營養(yǎng)物質(zhì)， 最后小孢子敗育; 但也可能是由于不育基因在小孢子發(fā)育成熟前， 通過調(diào)控絨氈層細(xì)胞行為， 使其提前降解， 并產(chǎn)生了一些信號物質(zhì)， 使未成熟小孢子中的一些致死基因表達(dá)， 引起小孢子發(fā)育異常， 導(dǎo)致花粉敗育。但最終是不育相關(guān)基因致使絨氈層差異表達(dá)引起小孢子不能完成正常發(fā)育， 還是不育相關(guān)基因直接作用于小孢子， 引起其發(fā)育異常導(dǎo)致敗育， 還有待于進(jìn)一步研究。

Chauhan[9]觀察到多種植物雄性可育系的藥室內(nèi)壁的條紋狀加厚壁， 是在絨氈層細(xì)胞的原生質(zhì)體徹底解體時發(fā)生的， 他支持De Fossard[15]關(guān)于絨氈層細(xì)胞內(nèi)存在某種抑制藥室內(nèi)壁形成條紋加厚壁的觀點(diǎn)。一些相應(yīng)的雄性不育系及化學(xué)殺雄植物， 其絨氈層異常者， 藥室內(nèi)壁均不產(chǎn)生條紋加厚壁， 他認(rèn)為條紋加厚壁的形成， 受絨氈層的調(diào)控。本試驗觀察顯示， 敗育Ⅰ型花藥中， 絨氈層細(xì)胞未解體時藥室內(nèi)壁也產(chǎn)生了條紋加厚壁， 這與De Fossard 及Chauhan的觀點(diǎn)有所不同。

在可育系花藥的發(fā)育過程中， 中層細(xì)胞內(nèi)貯藏的物質(zhì)漸漸被其消耗而減少， 同時由于受到花粉囊內(nèi)部細(xì)胞增殖和長大所產(chǎn)生的擠壓， 中層細(xì)胞在四分體時期就解體而被吸收。而在本試驗中， 可觀察到一些雄性不育系花藥的中層細(xì)胞有延遲退化的現(xiàn)象， 在單核小孢子期仍然存在一起， 與內(nèi)縮的藥壁組織壓迫小孢子成一團(tuán)塊狀。而且存留的中層細(xì)胞可能阻隔了小孢子細(xì)胞與藥壁組織間的物質(zhì)和信息交流， 導(dǎo)致小孢子敗育。關(guān)于小孢子敗育與絨氈層細(xì)胞的異常發(fā)育有緊密的聯(lián)系在許多文獻(xiàn)中都有報道， 但和中層細(xì)胞延遲解體有關(guān)系的則很少有報道。

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