張兆偉,秦妮娜,陳 鍇,鄒雨霞

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院 麻醉科,陜西 延安716000)

嗎啡、芬太尼等傳統(tǒng)阿片類藥物，多是μ阿片受體的選擇性激動劑。然而，μ阿片受體的激活，常常會誘發(fā)耐受、便秘、呼吸抑制等副作用，致使其應(yīng)用和推廣受到極大限制[1,2]。近期研究發(fā)現(xiàn)，阿片受體之間可能存在一定的協(xié)同調(diào)節(jié)(增強鎮(zhèn)痛且減少副作用)，阿片受體的多功能配體受到廣泛關(guān)注[3-5]。阿片樣肽hemorphin-4(Tyr-Pro-Trp-Thr)，是牛血紅蛋白β鏈的四肽片段，對μ、δ、κ阿片受體都有較高的親和性[6]。側(cè)腦室注射hemorphin-4(25-75 μg)，在小鼠溫水浴甩尾實驗中表現(xiàn)出顯著的鎮(zhèn)痛作用，而50 μg的hemorphin-4對小鼠的胃腸推進沒有任何影響，意味著hemorphin-4在發(fā)揮顯著鎮(zhèn)痛時不會誘發(fā)胃腸動力障礙[7]。因此，本實驗通過熱板模型和排便實驗，更進一步地評價hemorphin-4在中樞上水平對熱痛和排便的調(diào)節(jié)。

1 材料與方法

1.1材料

昆明系小鼠購自成都達碩生物科技有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2013-24。Hemorphin-4通過固相多肽合成法合成，RT-HPLC進行分析純化。Naloxone購于Tocris公司。戊巴比妥鈉購于Sigma公司。

1.2給藥方式

側(cè)腦室埋管參考之前的報道[8]。腹腔注射戊巴比妥鈉(70 mg/kg)麻醉小鼠，并置于腦立體定位儀，以Bregma點為參考(后移0.6 mm、側(cè)移1.2 mm、深1.7 mm)，將26 G不銹鋼套管固定于腦顱骨。單只單籠飼養(yǎng)5-7天后，進行后續(xù)實驗。利用微量進樣泵注射(3 μL/2 min)，留針1 min防止回流。實驗結(jié)束后，注射藍墨水檢測埋管位置。

1.3熱板模型

因雄性小鼠的睪丸易受熱下垂致其跳躍，我們選擇雌性小鼠，并記錄其“舔后爪”的潛伏時間?；谇捌陬A(yù)備工作，55.5 ℃的熱板使得大多數(shù)小鼠在5-10 s出現(xiàn)舔后足，剔除過于敏感或遲鈍的小鼠。為避免組織燙傷，將截至?xí)r間定為30 s。本實驗，以3次給藥前痛閾值的平均數(shù)為該只小鼠的基礎(chǔ)痛閾值，以側(cè)腦室給藥后5 min、10 min、20 min、40 min時的潛伏時間為給藥后痛閾值，參考下述公式計算最大鎮(zhèn)痛效應(yīng)百分率(MPE %)：MPE %=(給藥后痛閾值-基礎(chǔ)痛閾值)/(30-基礎(chǔ)痛閾值)×100 %。

1.4排便實驗

排便實驗，可以更好地反映便秘癥狀。參考之前的報道[9]，以給藥后30 min內(nèi)糞便顆粒數(shù)和總干重來評價藥物對排便的調(diào)節(jié)。實驗的關(guān)鍵在于，在埋管小鼠的恢復(fù)期，務(wù)必讓小鼠充分適應(yīng)實驗員，以避免捉拿以及側(cè)腦室注射刺激小鼠排便。

1.5數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用單因素方差分析中的Bonferroni法進行組間比較，P<0.05表示差異具有顯著性。每個實驗組至少5-7只小鼠。

2 結(jié)果

2.1Hemorphin-4在熱板模型中的鎮(zhèn)痛作用

如圖1所示，在熱板模型中，側(cè)腦室注射hemorphin-4(3-30 μg)表現(xiàn)出顯著的劑量和時間依賴性的鎮(zhèn)痛作用，而且在10 min時出現(xiàn)了鎮(zhèn)痛的峰值。因此，我們選擇10 min時的鎮(zhèn)痛效果為代表，更詳細(xì)地比較給藥前后小鼠痛閾值的變化(表1)。相較于基礎(chǔ)痛閾值，側(cè)腦室注射生理鹽水對舔后足潛伏期沒有影響。與之相比，即使小劑量的hemorphin-4(3 μg)也可以顯著地延遲小鼠的舔后足潛伏期，而在10 μg和30 μg的劑量時，小鼠的舔后足潛伏期甚至延遲了2-3倍，呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。

圖1側(cè)腦室注射hemorphin-4(3-30μg)調(diào)節(jié)熱板致痛小鼠的舔足潛伏期。每組至少6只小鼠，數(shù)據(jù)以最大鎮(zhèn)痛效應(yīng)百分率(MPE%)的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。***P<0.001，**P<0.01，表明hemorphin-4與生理鹽水具有統(tǒng)計學(xué)意義上的差異。

表1 Hemorphin-4對熱板致痛小鼠的鎮(zhèn)痛(T=10 min)

2.2Naloxone對hemorphin-4鎮(zhèn)痛的影響

為探究hemorphin-4的鎮(zhèn)痛機制，我們提前10 min皮下注射阿片受體的非選擇性拮抗劑naloxone(2 mg/kg)。如表2所示，與“生理鹽水+生理鹽水”組相比，naloxone預(yù)處理對中樞注射生理鹽水的痛閾值沒有影響，卻能夠非常顯著地阻斷30 μg hemorphin-4所引起的鎮(zhèn)痛。

2.3Hemorphin-4對小鼠排便的調(diào)節(jié)

由表3可以看出，與生理鹽水組相比，30 μg 的hemorphin-4對糞便顆粒數(shù)量及干重沒有影響，而只有高劑量的hemorphin-4(100 μg)才能夠有效地抑制小鼠的正常排便。

表2 Naloxone對hemorphin-4(30 μg)鎮(zhèn)痛的影響

#，表示與“生理鹽水+生理鹽水”相比$，表示與“生理鹽水+Hemorphin-4”相比

表3 側(cè)腦室注射hemorphin-4對小鼠排便的調(diào)節(jié)

3 討論

甩尾反應(yīng)屬于脊髓調(diào)節(jié)的條件反射，而舔后足行為則有延髓等高位中樞的參與，這是甩尾模型與熱板模型的本質(zhì)區(qū)別。有文獻報道顯示，阿片類化合物PZM21對小鼠甩尾潛伏期沒有影響，卻顯著且持久地延遲小鼠舔后足的潛伏期[9]。因此，基于hemorphin-4在甩尾模型中顯著的鎮(zhèn)痛作用，本實驗拓展鎮(zhèn)痛模型，探究hemorphin-4在中樞上水平對熱板致痛小鼠的痛閾調(diào)節(jié)。

由表1可知，側(cè)腦室注射hemorphin-4(3-30 μg)能夠劑量依賴地延遲熱板致痛小鼠舔后足的潛伏期。該鎮(zhèn)痛作用幾乎被naloxone完全阻斷(表2)，表明hemorphin-4可能是通過阿片受體的激活發(fā)揮鎮(zhèn)痛，這一結(jié)果與hemorphin-4關(guān)于受體親和及甩尾鎮(zhèn)痛的報道一致[6,7]。比較hemorphin-4在熱板和甩尾兩個模型中的鎮(zhèn)痛活性，我們發(fā)現(xiàn)，10 μg hemorphin-4在熱板模型中的鎮(zhèn)痛效果略低于甩尾模型中50 μg hemorphin-4所產(chǎn)生的鎮(zhèn)痛作用[7]。Hemorphin-4在熱板模型中表現(xiàn)出更高的鎮(zhèn)痛活性，雖然可能是小鼠的種系差別或性別差異等，但更關(guān)鍵的原因或許可歸因為阿片受體在高位中樞有更集中的分布[2]。相較于hemorphin-4在熱板模型中的顯著鎮(zhèn)痛，同等劑量的hemorphin-4(30 μg)對小鼠的正常排便沒有影響，意味著hemorphin-4在發(fā)揮有效鎮(zhèn)痛時不會誘發(fā)便秘，這或許與hemorphin-4的三重配體活性(μ、δ、κ阿片受體)有關(guān)。有關(guān)hemorphin-4在術(shù)后痛、神經(jīng)痛等經(jīng)典模型中的痛調(diào)節(jié)，及其對依賴、耐受、呼吸抑制等典型阿片副作用的調(diào)節(jié)，值得更進一步的探索。

總而言之，本研究結(jié)果顯示，hemorphin-4在熱板模型中表現(xiàn)出比甩尾模型更高的鎮(zhèn)痛活性，在發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用時不會誘發(fā)便秘。