Effects and mechanisms of Yin Yang 1 on the proliferation and migration of bladder cancer cells

JI Meng1 ，TU Sheng2，WANG Gang？，QIAN Kaiyu3，XIAO Yu3.4

（1.Department of Laboratory Medicine，2.Department of Urology，3.Department of Biological Repositories， Zhongnan Hospital of Wuhan University，Wuhan 430071；4.Human Genetic Resources Preservation Center of Hubei Province，Wuhan 430071，China）

ABSTRACT：ObjectiveTo explore the effects of Yin Yang 1（YYl）on the proliferationand migration of blader cancer cells and investigate the underlying mechanisms，soas toprovidereference forthe preventionandtreatmentof this disease. MethodsThe expression patterns of YY1 incommon genitourinary tumors and their asociations with the prognosis were analyzed using data from The Cancer Genome Atlas （TCGA）and the Gene Expression Omnibus （GEO）.The eficiency of YY1 knockdown and overexpresion in bladdercancercellines（T24and UM-UC-3）wasconfirmed withquantitativereverse transcription PCR（qRT-PCR）and Westernblotig.Cellproliferation andmigration wereasessedusing methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide（MTT）andTranswellasays.RNA sequencing followedbybioinformatics analyses，including GeneOntology（GO），Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes（KEGG），and Gene SetEnrichment Analysis （GSEA），was conducted to predict potential mechanisms.TheqRT-PCR and rescue experiments were performed to validate whether YY1 exerted its effects via theE2F1signaling pathway.ResultsYYl wassignificantlyoverexpresed in bladdercancer compared toother genitourinary tumors and was associated with higher tumorgradeand poorerprognosis（ Plt; 0.05）.Functional assys demonstratedthatYYlpromoted the proliferationandmigration of bladdercancer cels. Transcriptome analyses revealed that YYl might regulate these processs through the E2F signaling pathway.Moreover， overexpresionofE2Flpartiallyreversedthe inhibitory effectsofYY1knockdownon bladdercancercell proliferationand migration.ConclusionYYlis upregulated in bladdercancer and is closely assciated with tumor gradeandunfavorable prognosis.It may facilitate tumor cellproliferation and migration by modulating the E2F1 signaling pathway.

KEY WORDS： bladder cancer;Yin Yang 1；proliferation；migration

中圖分類號：R737.14 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2025.08.012

膀胱癌是最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一，根據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測，至2040年，膀胱癌的全球年新發(fā)病例預(yù)計將達(dá)到120萬例，給社會帶來巨大醫(yī)療負(fù)擔(dān)[1。根據(jù)腫瘤浸潤深度，膀胱癌可分為非肌層浸潤性膀胱 癌（non-muscle invasive bladder cancer，NMIBC）和肌層浸潤性膀胱癌（muscleinvasivebladdercancer，MIBC）。在初次就診時，約 3/4 的患者為NMIBC，其余為MIBC，NMIBC易復(fù)發(fā)或進展，5年復(fù)發(fā)率和進展率分別為 31%～78% 和 1%～ 45% ，而MIBC患者的5年生存率僅為 20%～ 40%^[2] 。膀胱癌治療方式的選擇主要依據(jù)病程及腫瘤進展情況，包括手術(shù)、放療、化療、免疫及靶向治療等[3]。不同患者對各類療法的響應(yīng)性和耐受性差異較大，療效不穩(wěn)定，且部分患者在治療后迅速復(fù)發(fā)?？ń槊纾╞acillecalmette-guérin，BCG）灌注是NMIBC的標(biāo)準(zhǔn)治療方案之一，但是在改善預(yù)后的前提下，可能會伴隨泌尿系統(tǒng)炎癥等不良反應(yīng)[4]。在順鉑-吉西他濱聯(lián)合的新輔助化療方案中，MIBC患者病理完全緩解率約為 38% ，但多數(shù)患者在后續(xù)治療過程中產(chǎn)生耐藥性，或出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)[5-6]。因此，探索膀胱癌發(fā)生發(fā)展新機制和精準(zhǔn)靶向治療新策略，對于提高膀胱癌治療效果具有重要意義。

在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，細(xì)胞增殖失控、侵襲性增強等特征與調(diào)控轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵分子密切相關(guān)[7]。陰陽蛋白1（Yin Yang1，YY1）是一種廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子，屬于GLI-Kruppel鋅指蛋白家族，因其N-末端存在激活結(jié)構(gòu)域、C-末端存在抑制結(jié)構(gòu)域而具有激活或抑制基因表達(dá)的雙重作用。YY1可通過轉(zhuǎn)錄激活Snail或抑制E-鈣黏蛋白來影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力[8]。既往報道證實，YY1在多種癌癥中高表達(dá)，如乳腺癌、卵巢癌、腦腫瘤、骨肉瘤、食管癌、胰腺癌等，并與腫瘤的進展密切相關(guān)[9-15]。

目前，YY1在膀胱癌中的表達(dá)及作用機制尚不明確。本研究利用公共數(shù)據(jù)庫膀胱癌測序數(shù)據(jù)，分析YY1與膀胱癌的臨床相關(guān)性。在膀胱癌細(xì)胞中敲低或過表達(dá)YY1，探究其對膀胱癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響。通過RNA測序（RNAsequencing，RNA-seq）分析、定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitativereversetranscriptionPCR，qRT-PCR）檢測及回補實驗，探究YY1調(diào)控膀胱癌細(xì)胞增殖和遷移的可能分子機制，以期助力未來開發(fā)更有效的膀胱癌臨床治療靶點。

1材料與方法

1.1數(shù)據(jù)庫生物信息分析癌癥組學(xué)數(shù)據(jù)庫（TheUniversity of Alabama at Birmingham Cancer DataAnalysis Portal，UALCAN;https：//ualcan. path.uab.edu）分析來自癌癥基因組圖譜（the cancer genomeatlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫（http：//cancergenome.nih.gov）中常見泌尿系統(tǒng)腫瘤（膀胱癌、前列腺癌、乳頭狀腎細(xì)胞癌、腎透明細(xì)胞癌）及相應(yīng)癌旁正常組織的測序數(shù)據(jù)，獲得YY1在常見泌尿系統(tǒng)腫瘤組織與癌旁正常組織（癌旁正常組織采集于距離腫瘤邊緣至少 2cm 和/或通過組織病理學(xué)檢查不含有腫瘤細(xì)胞[16）間的表達(dá)差異（TCGA數(shù)據(jù)庫樣本基本特征見表1）。通過基因表達(dá)譜交互式分析平臺（geneexpressionprofiling interactive analysis，GEPIA;http：//gepia.cancer-pku.cn）對YY1高表達(dá)和低表達(dá)的常見泌尿系統(tǒng)腫瘤患者進行無病生存期（disease-freesurvival，DFS）分析（DFS分析的隨訪時間通常從診斷日期到確定患者無病狀態(tài)后的首次新腫瘤進展事件日期的時間。如果患者在研究結(jié)束時仍然未復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，則以其最后一次隨訪時的結(jié)局作為終點[17]；由于數(shù)據(jù)采集過程的實際局限性，各疾病的隨訪時間可能不完全一致）。應(yīng)用TCGA數(shù)據(jù)庫膀胱癌測序數(shù)據(jù)、基因表達(dá)綜合（geneexpressionomnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）膀胱癌測序數(shù)據(jù)集（GSE13507）分析膀胱癌組織與癌旁正常組織間、高級別與低級別膀胱癌組織間YY1表達(dá)的變化情況。

表1TCGA數(shù)據(jù)庫常見泌尿系統(tǒng)腫瘤患者臨床信息（例）

TCGA：癌癥基因組圖譜；部分?jǐn)?shù)據(jù)記錄不全。

1.2實驗材料膀胱癌細(xì)胞系T24、UM-UC-3、5637、SCaBER、J82購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，細(xì)胞系經(jīng)中國典型培養(yǎng)物保藏中心認(rèn)證。培養(yǎng)基MEM、DMEM和RPMI-1640、胎牛血清（fetalbovineserum，F(xiàn)BS）、青霉素/鏈霉素溶液、體積分?jǐn)?shù) 0.25% 的Trypsin-EDTA、Opti-MEM？培養(yǎng)基等購自Gibco（美國）;LipofectamineTM3Ooo購自ThermoFisher（美國）;RNA提取試劑盒（雙柱型）購自Magen（中國）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TOYOBO（日本）；Transwell小室及細(xì)胞培養(yǎng)板購自Corning（美國）；二甲基亞砜（DimethylSulfoxide，DMSO）、蛋白酶抑制劑（PhenylmethylsulfonylFluoride，PMSF）購自Sigma（美國）; 40g/L 多聚甲醛和結(jié)晶紫分別購自Biosharp和國藥集團（中國）;RIPA裂解液購自碧云天（中國）;YY1si購自吉瑪基因（中國），si YY1-1序列 （5^′- 3^′ ） ：GGGAGCAGAAGCAGGUGCAGAUTT，siYY1-2 序列 （5^′-3^′） ： CGACGACUACAUUGAACAATT ; YY1 過表達(dá)質(zhì)粒及對照質(zhì)粒購買自淼靈質(zhì)粒平臺；qRT-PCR引物購自擎科生物，引物序列： β actin上游引物：GATCCACATCTGCTGGAAG， β actin下游引物：CAGCACAATGAAGATCAAGA;YY1 上游引物：ACGGCTTCGAGGATCAGATTC，YY1下游引物：TGACCAGCGTTTGTTCAATGT。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)SCaBER細(xì)胞使用DMEM培養(yǎng)基，UM-UC-3細(xì)胞使用MEM培養(yǎng)基，T24、5637、J82細(xì)胞使用RPMI-1640培養(yǎng)基，均添加體積分?jǐn)?shù)10% 的FBS和體積分?jǐn)?shù) 1% 的青霉素與鏈霉素配置成完全培養(yǎng)基。細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶、孔板或培養(yǎng)Ⅲ后，放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：溫度維持37^°C ， CO₂ 濃度維持 5% 。

1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染將細(xì)胞均勻接種于6孔板，待細(xì)胞分別培養(yǎng)至密度 30%～50% 或 70%～80% 后，進行siRNA或質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染。用移液槍（使用無酶槍頭）分別加入Opti-MEM？培養(yǎng)基 250μL ）、siRNA/siNC（20 （20μmol/L，5μL） 和 LipofectamineTN 或 Opti-MEM^°ledast 培養(yǎng)基 （ 250μL） 、目的基因質(zhì)粒（ 2μg） 》 P3000（5μL） 和LipofectamineTM 3000βμL ）至無酶 1.5mL EP管，離心 3～5 s后，置于 37^°C 恒溫培養(yǎng)箱中孵育 15～20min ，最后加至6孔板細(xì)胞培養(yǎng)皿中。將細(xì)胞置于恒溫培養(yǎng)箱中孵育 ^48h ，收集細(xì)胞開展后續(xù)實驗。

1.5噻唑藍(lán)（methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromide，MTT）實驗膀胱癌細(xì)胞UM-UC-3和T24經(jīng)不同siRNA或/和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 ^48h ，消化并離心收集細(xì)胞后用完全培養(yǎng)基重懸，計數(shù)后以1000個/孔接種于96孔板，各組6個復(fù)孔。 24h 后加人 20μL 5mg/mL MTT溶液， 37^°C 培養(yǎng) 后棄去培養(yǎng)液，加入 150μL DMSO，震蕩 15min 充分溶解紫色結(jié)晶后，于 570nm 檢測吸光度。連續(xù)測定5d，最后統(tǒng)計分析各組間吸光度變化，評估細(xì)胞增殖情況。

1.6Transwell遷移實驗膀胱癌細(xì)胞UM-UC-3和T24經(jīng)不同siRNA或/和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 48h ，經(jīng)消化、無血清培養(yǎng)基重懸后計數(shù)。分別按T24細(xì)胞 （3x） 10⁴ 個/孔）、UM-UC-3細(xì)胞（ 4×10⁴ 個/孔）接種于Transwell小室的上室，并加人無血清培養(yǎng)基共200μL ，下室加入完全培養(yǎng)基 600μL ，培養(yǎng) 24h 。吸凈培養(yǎng)基后， 40g/L 多聚甲醛固定細(xì)胞 2h ，再用體積分?jǐn)?shù) 0.1% 結(jié)晶紫染色 2h 。將小室置于通風(fēng)櫥晾干后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞并拍照，通過計算細(xì)胞遷移數(shù)目比較細(xì)胞遷移能力。

1.7qRT-PCR實驗膀胱癌細(xì)胞UM-UC-3和T24經(jīng)不同siRNA或/和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 48h ，消化并離心收集細(xì)胞，使用RNA抽提試劑盒提取各組細(xì)胞的總RNA，然后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。qRT-PCR反應(yīng)體系為： 0. 5_μL 引物、 1μL cDNA、3.5 μL 無RNA酶水和5 μL 2×SYBR Green mix。以 β actin為內(nèi)參，以siNC組處理下YY1的轉(zhuǎn)錄水平為基準(zhǔn) （100% ），計算并比較不同siYY1處理后基因轉(zhuǎn)錄水平的變化。

1.8蛋白免疫印跡（Westernblotting，WB）實驗膀胱癌細(xì)胞UM-UC-3和T24經(jīng)不同siRNA或/和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 ^48h ，消化并離心收集細(xì)胞。向收集的細(xì)胞中加入RIPA裂解液（含有磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑），于冰上裂解 40min 。離心 后，將上清液（含細(xì)胞總蛋白）轉(zhuǎn)移至新的EP管中。按照1：4 向樣品中加入 5×sps LoadingBuffer，加熱變性 10min 。選擇體積分?jǐn)?shù)為 10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白后，采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至聚偏氟乙烯（polyvinylidenefluoride，PVDF）膜，轉(zhuǎn)膜時恒定電流為 275mA ，時間為 105min 。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用體積分?jǐn)?shù) 5% 脫脂牛奶封閉，并選擇相應(yīng)一抗，于 4^°C 孵育至少 8h ，二抗室溫孵育 ¹h 。配制適量ECL化學(xué)發(fā)光顯影液，滴加于PVDF膜后，于凝膠成像系統(tǒng)進行顯影。使用ImageJ軟件計算蛋白灰度值，以甘油醛-3-磷酸 脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參，以 siNC組處理下YY1蛋白的表達(dá)水平為基準(zhǔn) （100% ），比較不同siRNA處理后YY1蛋白表達(dá)水平的變化。

1.9 RNA-seq分析 對敲低YY1的膀胱癌T24細(xì)胞及對照組細(xì)胞進行RNA-seq分析。原始數(shù)據(jù)已上傳至國家生物技術(shù)信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI）數(shù)據(jù)庫，編號為：GSE252007。對顯著差異基因進行GO功能富集和KEGG通路分析；根據(jù)基因排序和GSEA官網(wǎng)提供的基因特征數(shù)據(jù)集，應(yīng)用GSEA分析YY1對膀胱癌細(xì)胞內(nèi)不同生物學(xué)通路的潛在調(diào)控作用。

1.10統(tǒng)計學(xué)方法所有統(tǒng)計分析均在 SPSS20.0和GraphPadPrism9軟件中進行。若數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布且方差齊性，組間比較采用獨立樣本 Ψ_t 檢驗；非正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗，獨立樣本間用Mann-Whitney U 檢驗。3組及以上比較時，采用單因素或雙因素方差分析（ANOVA）。生存分析采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間差異通過log-rank檢驗評估。數(shù)據(jù)根據(jù)分布特征以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差或中位數(shù)（四分位間距）表示， n 表示每組生物學(xué)獨立樣本量，所有實驗重復(fù)進行3次。以 Plt;0. 05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1YY1在常見泌尿系腫瘤中的表達(dá)及與患者無病生存期的相關(guān)性利用UALCAN平臺分析TCGA數(shù)據(jù)庫中YY1在常見泌尿系統(tǒng)腫瘤中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與正常膀胱組織相比，膀胱癌組織中YY1的表達(dá)更高（ ?Plt;0. 01 ，圖1A）；前列腺癌組織與癌旁正常組織中YY1表達(dá)無明顯差異（ Pgt; 0.05，圖1B）；乳頭狀腎細(xì)胞癌組織（ ΔPlt;0. 01 ，圖1C）和腎透明細(xì)胞癌組織（ Plt;0. 05 ，圖1D）較相應(yīng)癌旁組織的YY1表達(dá)降低。

Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，YY1高表達(dá)的膀胱癌患者DFS相較低表達(dá)患者顯著縮短（ P= 0.0027，圖2A）；前列腺癌（圖2B）和腎乳頭細(xì)胞癌（圖2C）中YY1表達(dá)量與DFS長短無明顯相關(guān)性（ P gt;0.05） ；而腎透明細(xì)胞癌中YY1高表達(dá)組DFS較低表達(dá)組更長 ?P=0.006 3 ，圖2D）。

圖2常見泌尿系統(tǒng)腫瘤中不同YY1表達(dá)量患者的無病生存分析

分析GSE13507數(shù)據(jù)集發(fā)現(xiàn)，YY1在膀胱正常組織組中表達(dá)的平均水平為 12.50（12.27～12.70） ，在膀胱癌組織中表達(dá)的平均水平為 12.85（12.55～ 13.22），表明YY1表達(dá)量在膀胱癌組織中明顯增高（ Plt;0.0001 ，圖3A）。此外，TCGA數(shù)據(jù)庫膀胱癌測序數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示， YY1mRNA 表達(dá)的平均水平在高級別膀胱癌中為 5.463（5.154～5.754） ，而在低級別膀胱癌中為 5.059（4.858～5.507） ，高級別膀胱癌相較低級別膀胱癌的YY1mRNA表達(dá)水平顯著增加 （Plt;0.01 ，圖3B）。

應(yīng)用qRT-PCR 實驗檢測了T24、UM-UC-3、5637、SCaBER、J82等膀胱癌細(xì)胞系中YY1mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與其他膀胱癌細(xì)胞系相比，T24和UM-UC-3 細(xì)胞中YY1mRNA的相對表達(dá)水平更高 （Plt;0.001 ，圖3C）。

A：GSE13507數(shù)據(jù)庫中膀胱癌組織與正常膀胱組織中 YY1mRNA 的表達(dá)水平；B：TCGA數(shù)據(jù)庫中膀胱癌分級的YY1 mRNA的表達(dá)水平;C：膀胱癌細(xì)胞系（SCaBER、T24、UM-UC-3、5637、J82）中 YY1mRNA相對表達(dá)水平;組間差異由Mann-Whitney U 檢驗（圖A、B）、單因素方差分析（圖C）確定；ns： Pgt;0.05 ，* Plt; 0.05， ^**Plt;0.01 ， ^??Plt;0.001 ，**** Plt;0.000 1; YY1：陰陽蛋白1;TCGA：癌癥基因組圖譜。

圖3GSE13507數(shù)據(jù)集和TCGA數(shù)據(jù)庫膀胱癌測序數(shù)據(jù)分析YY1的表達(dá)

2.2 膀胱癌細(xì)胞中YY1敲低和過表達(dá)效率的驗證

為進一步探究YY1在膀胱癌中的生物學(xué)作用，分別在T24和UM-UC-3細(xì)胞中瞬時轉(zhuǎn)染2種靶向YY1的siRNA（siYY1-1和siYY1-2）以敲低YY1在膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)，并通過qRT-PCR實驗和WB實驗進行敲低效率的驗證。qRT-PCR實驗結(jié)果顯示，siYY1-1、siYY1-2組相較siNC組均可明顯降低膀胱癌細(xì)胞中YY1mRNA的相對表達(dá)水平（圖4A、D）。WB實驗也提示siYY1-1、siYY1-2組YY1蛋白表達(dá)水平相較siNC組明顯減少（圖 4B～C，E～F） 。

圖4T24與UM-UC-3膀胱癌細(xì)胞系中YY1敲低和過表達(dá)效率驗證

A：T24 細(xì)胞中YY1敲低qRT-PCR驗證;B、C：T24細(xì)胞中YY1敲低Western bloting 驗證（圖B）及統(tǒng)計圖（圖C）;D：UM-UC-3細(xì)胞中YY1敲低qRT-PCR驗證;E、F：UM-UC-3細(xì)胞中YY1敲低Western bloting驗證（圖E）及統(tǒng)計圖（圖F）;G：T24 細(xì)胞中YY1過表達(dá)qRT-PCR 驗證;H：T24 細(xì)胞中YY1過表達(dá) Western bloting 驗證;I：UM-UC-3 細(xì)胞中YYl過表達(dá)qRT-PCR驗證;J：UM-UC-3細(xì)胞中YY1過表達(dá)Western bloting 驗證;組間差異由單因素方差分析（圖A、C、D、F）、獨立樣本 Ψ_t 檢驗（圖G、D確定； ^*Plt;0.05 ，* ，*** Plt;0.001 ，**** Plt;0.000 1 。YY1：陰陽蛋白1;Vector：空載質(zhì)粒;GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶;qRT-PCR：定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);Western blotting：蛋白免疫印跡。

http：//jmurology. xjtu.edu.cn; zgmnwk.cug. top

在T24和UM-UC-3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染YY1過表達(dá)質(zhì)粒，qRT-PCR實驗和WB實驗驗證發(fā)現(xiàn)YY1質(zhì)粒組相較空載組（Vector組），YY1的mRNA和蛋白表達(dá)水平都明顯升高（圖 4G～J ）。

2.3YY1對膀胱癌細(xì)胞增殖能力的影響MTT實驗結(jié)果顯示，敲低YY1可顯著抑制T24細(xì)胞（siNC組與siYY1-1組相比， P 值：第1天為0.9954、第 2～ 5天均 lt;0.000 1 ;siNC組與siYY1-2組相比， P 值：第1天為0.9678、第 2～5 天均 lt;0.000 1 和UM-UC-3細(xì)胞的增殖能力（siNC組與siYY1-1組相比，P 值：第1天為0.1467、第2天為0.0001、第 3～5天均 lt;0.000 1 ;siNC與siYY1-2組相比， P 值：第1天為0.9980、第2天為0.0763、第3天為0.0260、第4天為0.0001、第5天為0.0002）（圖 5A～B） 。同樣，在上述細(xì)胞系中過表達(dá)YY1進行MTT實驗發(fā)現(xiàn)，提高YY1表達(dá)可以顯著增強T24細(xì)胞（Vector組與YY1組相比， P 值：第1天為0.9153、第2天為0.0037、第 3～5 天均 lt;0.000 1） 和UM-UC-3細(xì)胞（Vector組與YY1組相比， P 值：第1天為0.9969、第 2～5 天均 lt;0.000 1? 的增殖能力（圖5C～D） 。

A：T24細(xì)胞中siYY1敲低后增殖能力變化;B：UM-UC-3細(xì)胞中siYY1敲低后增殖能力變化；C：T24細(xì)胞中YY1過表達(dá)后增殖能力變化；D：UM-UC-3細(xì)胞中YY1過表達(dá)后增殖能力變化;組間差異由單因素方差分析（圖A、B）、獨立樣本 Ψ_t 檢驗（圖C、D）確定； ^*Plt;0.01 ，*** Plt;0.001 ，**** Plt;0. 000 1 ;YY1：陰陽蛋白1;Vector：空載質(zhì)粒。

圖5敲低或過表達(dá)YY1對膀胱癌細(xì)胞增殖能力的影響

2.4YY1對膀胱癌細(xì)胞遷移能力的影響Transwell實驗結(jié)果表明，siYY1-1組、siYY1-2組相較siNC組細(xì)胞的遷移能力明顯減少（圖 6A～D ，而轉(zhuǎn)染YY1過表達(dá)質(zhì)粒組細(xì)胞的遷移數(shù)量較Vector組明顯增多（圖 6E～H ）。

2.5RNA-seq分析YY1對膀胱癌影響的分子機制為了進一步揭示YY1對膀胱癌細(xì)胞影響的分子機制，應(yīng)用YY1敲低的膀胱癌T24細(xì)胞和對照T24細(xì)胞進行RNA-seq測序分析。首先對測序結(jié)果進行差異表達(dá)基因分析，在YY1敲低組中發(fā)現(xiàn)顯著上調(diào)的10個基因（PTGES3L-AARSD1、SNORD22、RPL36A-HNRNPH2、ZNF157、TNFSF18、CDK14、AC008982.1、ESM1、MIR1244-1、KRT34）和顯著下調(diào)的10個基因（CU638689.5、TMEM256-PLSCR3、ISY1-RAB43、TIGD1、KCNJ16、CDKN1C、KCNK3、Z83844.3、AC018521.1、DNAAF4-CCPG1）（圖7A）。對差異表達(dá)基因進行GO功能富集分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要在細(xì)胞周期、DNA復(fù)制和有絲分裂等關(guān)鍵生物學(xué)過程中富集（圖7B），KEGG通路分析進一步揭示YY1敲低可能影響與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的信號通路（圖7C）。最后通過GSEA發(fā)現(xiàn)，YY1敲低后顯著富集在E2F信號通路、G2M檢查點、干擾素γ反應(yīng)和MYC信號通路（圖7D）。

圖6敲低或過表達(dá)YY1對膀胱癌細(xì)胞遷移能力的影響

A、B：Transwell遷移實驗檢測YY1敲低對膀胱癌T24 細(xì)胞遷移能力的影響（圖A）和統(tǒng)計圖（圖B）;C、D：Transwell遷移實驗檢測YY1敲低對膀胱癌UM-UC-3細(xì)胞遷移能力的影響（圖C）和統(tǒng)計圖（圖D）;E、F：Transwell遷移實驗檢測YY1過表達(dá)對膀胱癌T24細(xì)胞遷移能力的影響（圖E）和統(tǒng)計圖（圖F）；G、H：Transwell遷移實驗檢測 YY1過表達(dá)對膀胱癌UM-UC-3 細(xì)胞遷移能力的影響（圖G）和統(tǒng)計圖（圖H）；組間差異由單因素方差分析（圖B、D）、獨立樣本 Ψ_t 檢驗（圖F、H）確定； ^***Plt;0.001 ，關(guān)醬* Plt;0.000 1 ;YY1：陰陽蛋白1;Vector：空載質(zhì)粒。

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A：差異表達(dá)基因（上調(diào)TOP10基因和下調(diào)TOP1O基因）熱圖;B：差異表達(dá)基因GO功能富集分析；C：差異表達(dá)基因 KEGG 通路分析;D：差異表達(dá)基因GSEA分析;YY1：陰陽蛋白1;GO：基因本體;KEGG：京都基因與基因組百科全書；GSEA：基因集富集分析。

圖7YY1敲低的膀胱癌T24細(xì)胞和對照細(xì)胞RNA測序分析

2.6YY1對E2F1及其下游靶基因表達(dá)的影響基于上述RNA-seq結(jié)果的GSEA分析發(fā)現(xiàn)，YY1敲低后顯著富集在E2F信號通路（圖7D），應(yīng)用qRT-PCR實驗檢測YY1敲低后E2F1及其下游靶基因mRNA的表達(dá)變化情況。結(jié)果顯示，在T24和UM-UC-3細(xì)胞中敲低YY1后，E2F1、MYC、ASF1A、CBX5、IPO7、JPT1等原癌基因的mRNA相對表達(dá)量明顯下調(diào)，而POLD3、UNG、UBR7、PSMC3IP、NOLC3等抑癌基因的mRNA相對表達(dá)量則明顯上調(diào)（圖8A、B。

圖8YY1敲低后E2F1及其下游部分靶基因mRNA表達(dá)變化情況

A：T24細(xì)胞中YY1敲低后E2F1及其下游部分靶基因mRNA表達(dá)量變化;B：UM-UC-3細(xì)胞中YY1敲低后E2F1及其下游部分靶基因mRNA相對表達(dá)量變化;組間差異由獨立樣本 Ψ_tΨ_t 檢驗確定； ^*Plt;0.05 ，** Plt; 0.01， ^***Plt;0.001 ， ^***Plt;0.000 1;Y^v Y1：陰陽蛋白1。

2.7過表達(dá)E2F1可部分恢復(fù)YY1敲低對膀胱癌細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用為了進一步探究YY1是否通過E2F1信號通路來發(fā)揮其抑制膀胱癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力的作用，在膀胱癌細(xì)胞中敲低YY1的同時表達(dá)E2F1，進行回補實驗，并分別應(yīng)用MTT和Transwell遷移實驗來檢測各組細(xì)胞增殖和遷移能力的變化情況。

MTT實驗結(jié)果顯示，相較敲低YY1組，在T24（siNC組與siYY1-1組相比， P 值：第1天 gt;0.999 9 、第 2～5 天均 lt;0.000 1 ;siYY1-1組與 siYY1-1聯(lián)合過表達(dá)E2F1組相比， P 值：第1天 gt;0.999 9 第2天為0.0097、第 3～5 天均 lt;0.000 1 以及UM-UC-3（siNC組與 siYY1-1組相比， P 值：第1天為0.9971、第 2～5 天均 lt;0.000 1 ;siYY1-1組與siYY1-1聯(lián)合過表達(dá)E2F1組相比， P 值：第1天0.9502、第 3～5 天均 lt;0.000 1） 細(xì)胞中敲低YY1聯(lián)合過表達(dá)E2F1能夠回復(fù)單獨敲低YY1對膀胱癌細(xì)胞的抑制作用（圖 gA～B; 。

A：T24細(xì)胞中過表達(dá)E2F1同時敲低YY1后增殖能力變化;B：UM-UC-3細(xì)胞中過表達(dá) E2F1同時敲低YY1后增殖能力變化;C、E：Transwell遷移實驗檢測過表達(dá) E2F1同時敲低YY1對膀胱癌 T24 細(xì)胞遷移能力的影響（圖C）和統(tǒng)計圖（圖E）;D、F：Transwell遷移實驗檢測過表達(dá) E2F1同時敲低YY1對膀胱癌UM-UC-3細(xì)胞遷移能力的影響（圖D）和統(tǒng)計圖（圖F）;組間差異由單因素方差分析（圖A、B、E、F）確定； ^***Plt;0.000 1;Y Y1：陰陽蛋白1。

圖9過表達(dá)E2F1對YY1敲低后不同膀胱癌細(xì)胞系增殖和遷移能力的影響

Transwell遷移實驗結(jié)果顯示，在T24和UM- 純敲低YY1組，膀胱癌細(xì)胞遷移能力明顯增強（圖UC-3細(xì)胞中敲低YY1聯(lián)合過表達(dá)E2F1組，相較單 gC～F' 。以上結(jié)果表明，YY1可能通過E2F1信號通路影響膀胱癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。

3討論

本研究通過對膀胱癌中YY1的表達(dá)及其生物學(xué)功能進行分析，揭示了YY1在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中的潛在作用。通過對TCGA數(shù)據(jù)庫中泌尿系統(tǒng)腫瘤測序數(shù)據(jù)和GSE13507數(shù)據(jù)集的分析發(fā)現(xiàn)，與其他常見泌尿系統(tǒng)腫瘤相比，YY1在膀胱癌中特異性高表達(dá)，并與患者不良預(yù)后相關(guān)；且與低級別膀胱癌相比，YY1在高級別膀胱癌中的表達(dá)水平明顯升高。這表明YY1可能可作為膀胱癌進展或預(yù)后的潛在標(biāo)志物。

既往報道中，YY1參與胰腺癌[18]、宮頸癌[19]等腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的調(diào)控。YY1通過調(diào)節(jié)SOX2OT-SOX2軸來抑制胰腺癌細(xì)胞增殖和腫瘤生長[20]，也可以通過與MYCT1啟動子區(qū)域結(jié)合并阻止其轉(zhuǎn)錄活動來抑制喉癌細(xì)胞凋亡[21]。在膀胱癌T24和UM-UC-3細(xì)胞中敲低或過表達(dá)YY1后，細(xì)胞的增殖和遷移能力明顯減弱或增強。為了系統(tǒng)剖析YY1影響膀胱癌細(xì)胞腫瘤生物學(xué)行為的具體分子機制，本研究進行了RNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)CDK14、ESM1等影響細(xì)胞周期和新生血管形成的基因在YY1敲低組明顯上調(diào)。此外，后續(xù)GSEA發(fā)現(xiàn)富集通路的首位是E2F信號通路。隨后通過qRT-PCR實驗檢測了敲低YY1后，E2F1及其下游靶基因的表達(dá)變化情況，并通過回補實驗證實YY1可能通過E2F1信號通路參與膀胱癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力的調(diào)控。

E2F信號通路是調(diào)控細(xì)胞周期、增殖、凋亡和分化的重要通路，主要由E2F轉(zhuǎn)錄因子家族及其調(diào)控蛋白組成。E2F家族包括多個成員（如E2F1～E2F8），其中E2F1是E2F信號通路中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，E2F1通過調(diào)控下游靶基因的表達(dá)，直接參與E2F信號通路的生物學(xué)功能。E2F的異常表達(dá)和功能改變會導(dǎo)致細(xì)胞不受控制地增殖，從而促進腫瘤形成。E2F1是E2F家族中最早被研究的成員之一，一方面，E2F1的高表達(dá)可能促進腫瘤細(xì)胞的增殖和存活；另一方面，其也可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來抑制腫瘤發(fā)展[22]，這些功能使E2F1成為腫瘤研究和治療的重要靶點。本課題組前期研究已證實DLGAP5可以通過E2F1依賴性機制促進膀胱癌的增殖和進展[23]，結(jié)合本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，E2F1在膀胱癌細(xì)胞中發(fā)揮著促癌作用。此外，E2F1家族其他成員，如E2F3也被報道其過表達(dá)可以促進膀胱癌細(xì)胞的增殖[24]。目前已有從噬菌體克隆中分離出來的滲透肽PEP可與E2F1啟動子共識序列緊密結(jié)合，用于治療接種小細(xì)胞肺癌腫瘤細(xì)胞的裸鼠，可使腫瘤消退且沒有顯著毒性[25]。

MYC作為E2F1下游的一個靶基因，已被證明是膀胱癌進展的重要調(diào)節(jié)劑，MYC高表達(dá)與膀胱癌組織學(xué)等級和TNM分期顯著相關(guān)。功能實驗表明，MYC是膀胱癌細(xì)胞中的致癌基因，參與其增殖、遷移等多種功能的調(diào)控[26]。有研究指出，GClnc1可通過部分激活MYC促進膀胱癌細(xì)胞增殖和遷移[27]。

然而，本研究仍存在一些局限性。盡管通過細(xì)胞實驗驗證了YY1在膀胱癌細(xì)胞中的作用，但更為復(fù)雜的體內(nèi)實驗以及臨床樣本的驗證仍然是未來研究的重點，YY1與富集到的關(guān)鍵信號通路間的調(diào)控機制仍有待進一步探究。

本研究系統(tǒng)性揭示了YY1在膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)模式及其功能機制，通過對RNA-seq結(jié)果的深入分析，也有助于后續(xù)探究YY1影響膀胱癌機制的可能方向，為理解膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展新機制提供了新的視角。未來的研究可以進一步探討YY1在膀胱癌中的具體分子機制，特別是其與E2F1和MYC信號通路間的調(diào)控作用。此外，針對YY1或者其下游E2F1信號通路的靶向治療策略的開發(fā)，可能為膀胱癌治療提供新的方向?？傊?，本研究不僅深化了YY1在膀胱癌細(xì)胞中作用機制的理解，也為未來的基礎(chǔ)或臨床轉(zhuǎn)化研究提供了重要的實驗依據(jù)和理論支持。

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（編輯 鐘嬌嬌）