中圖分類號：S858.31 文獻標識碼：A文章編號：1673-1085（2025）07-0017-07

鴨坦布蘇病毒病（Duck Tembusu virusdisease，DTMU）是由鴨坦布蘇病毒（DuckTembusuvirus，DTMUV）引起的一種以蛋鴨產(chǎn)蛋大幅下降，雛鴨和育成鴨出現(xiàn)頭頸震顫、四肢麻痹等神經(jīng)癥狀為主要特征的急性、熱性傳染性疾病[1]。雛鴨、育成鴨感染后，以病毒性腦炎為特征，患病鴨表現(xiàn)為頭頸震顫，體溫升高，精神沉郁，癱瘓，站立困難，行走時雙腳向外叉開呈“八字型”，倒翻掙扎，腹瀉、脫水、糞便粘污肛門羽毛；病情嚴重的病鴨表現(xiàn)采食困難，共濟失調(diào)，最后衰竭死亡。

產(chǎn)蛋鴨發(fā)病迅速，臨床主要表現(xiàn)是產(chǎn)蛋量驟然下降，畸形蛋比例增高。1995年，該病在我國河北等地首次出現(xiàn)，病鴨臨床表現(xiàn)為產(chǎn)蛋下降和神經(jīng)癥狀，其病原被稱為病毒性腦炎病毒。2010年4月，該病在我國部分東南沿海省份大規(guī)模暴發(fā)，隨后在、河南等地區(qū)相繼出現(xiàn)。本病發(fā)病急、傳播快、發(fā)病率高，臨床一旦發(fā)現(xiàn)鴨群中出現(xiàn)病鴨，極易在短時間內(nèi)迅速蔓延至整個鴨群，發(fā)病率可達 100% 。近年來，坦布蘇病毒病在我國沿海地區(qū)的報告病例數(shù)量持續(xù)上升，其快速蔓延給我國及東南亞地區(qū)的養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。鴨對該病最易感，其他禽類以及小鼠等哺乳類動物也可能有不同程度的感染。病鴨和帶毒鴨是主要傳染源。DTMUV為蟲媒病毒，從鴨場內(nèi)的蚊子、飛鳥體內(nèi)均檢測到該病毒，這表明蚊和鳥類是其貯存宿主和傳播媒介[2]。TMUV在卵泡囊膜的檢出率最高，表明該病毒能經(jīng)卵垂直傳播。此外，TMUV可經(jīng)糞便排出體外，污染環(huán)境、飼料、飲水、器具以及運輸工具等[3]，從而導致易感鴨感染發(fā)病。帶毒鴨或被污染的運輸工具跨區(qū)域活動，能進一步促進該病的傳播。目前，DTMUV檢出率約為 40% ，其感染嚴重威脅著我國養(yǎng)鴨業(yè)的健康發(fā)展。為有效遏制TMUV的流行，降低傳播風險，除了改善養(yǎng)殖場環(huán)境、提升飼養(yǎng)管理水平等預防措施外，接種疫苗也是重要的防控手段。然而，目前使用的弱毒疫苗和滅活疫苗雖安全性較高，但存在疫苗品種有限、免疫保護水平低等問題[4]。

DTMUV屬于黃病毒科黃病毒屬的RNA病毒，有三種基因型，分別為TMUV1（TMUV1a、TMUV1b和TMUV1c）、TMUV2（TMUV2a、TMUV2b）和TMUV 3^[5] 。病毒粒子呈球形，直徑約 50nm ，有囊膜，不能凝集雞、鴨、鵝和鴿的紅細胞[。基因組為單股正鏈不分節(jié)段RNA，長度為 10990bp ，編碼一個大的多聚蛋白[，該多聚蛋白在蛋白酶的作用下水解成10種病毒蛋白，分別為3種結(jié)構(gòu)蛋白和7種非結(jié)構(gòu)蛋白[8]。由E基因編碼的囊膜蛋白是TMUV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，與病毒吸附、膜融、組裝和侵入密切相關(guān)，決定著病毒的親嗜性、毒力和致病性[9。E基因編碼的囊膜蛋白是病毒的主要毒力蛋白，介導識別受體、膜融、裝配、釋放病毒粒子[1]。此外，E蛋白含有多個特異性抗原表位，能夠誘導機體的保護性免疫應(yīng)答并產(chǎn)生保護性中和抗體[11]。因此以E蛋白為靶點進行TMUV新型疫苗的研發(fā)尤為關(guān)鍵。本研究擬通過構(gòu)建pET28a-TMUV-E原核表達重組載體，在體外表達并純化TMUVE蛋白，為鴨坦布蘇病毒新型疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1菌株與載體質(zhì)粒pET28a-TMUV-E原核表達質(zhì)粒、 pET-28a（+） 載體、目的基因模板質(zhì)粒pUC57-TMUV-E-Ecoli購自HonorGene有限公司；DH5 a 克隆菌株、BL21（DE3）表達菌株購自康為世紀生物科技股份有限公司。

1.1.2試劑Prime STAR MaxDNAPolymerase、T4DNALigase為TAKARA公司產(chǎn)品，核酸內(nèi)切酶、DNAPolymerase為寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，His標簽蛋白純化試劑盒與質(zhì)粒小提試劑盒為碧云天生物有限公司產(chǎn)品。DNAMarker、ProteinMarker為寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小提試劑盒為碧云天生物有限公司產(chǎn)品；His標簽蛋白純化試劑盒為碧云天生物有限公司產(chǎn)品；10% ExpressCastPAGE彩色凝膠快速試劑盒為蘇州新賽美公司產(chǎn)品；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒為北京索萊寶公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1模板質(zhì)粒的構(gòu)建以NCBIGenBank 提供的鴨坦布蘇病毒E基因片段原始序列為基礎(chǔ)，針對大腸桿菌種屬進行密碼子優(yōu)化，在5’端和3'端分別加上NdeI、BamHI酶切位點，通過全基因合成獲得所需要的目的基因片段。目的基因模板質(zhì)粒pUC57-TMUV-E-Ecoli，購自HonorGene公司。

1.2.2pET28a-TMUV-E質(zhì)粒構(gòu)建用NdeI、BamHI分別對pUC57-TMUV-E-Ecoli模板質(zhì)粒和 pET-28a（+） 載體雙酶切， 恒溫反應(yīng) 。酶切反應(yīng)結(jié)束后，將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收相應(yīng)的基因片段條帶和載體條帶。使用T4DNA連接酶將酶切后的基因片段和載體片段進行連接， 過夜。次日將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至 DH5α 感受態(tài)細胞中，37℃過夜培養(yǎng)。從轉(zhuǎn)化平板上挑取若干個克隆進行PCR鑒定，鑒定為陽性的克隆菌落擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，并用ApaI、XhoI限制性內(nèi)切酶進行酶切鑒定，對酶切鑒定正確的質(zhì)粒，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序鑒定，將測序正確的質(zhì)粒冷凍保存。1.2.3重組原核載體的表達與鑒定將1.2.2 陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細胞中，操作步驟同1.2.2，同時進行擴大培養(yǎng)與鑒定。取鑒定正確的菌液，接種到 5mL 含卡那霉素的LB培養(yǎng)液中， 培養(yǎng) 16h ；取 3mL 菌液接種到 300mL 的LB培養(yǎng)液（預熱至 ，含卡那霉素）， 培養(yǎng)至菌液 OD₆₀₀ 達0.6；加入IPTG至終濃度為 Ω_1mM ，誘導 4.5h ；取出培養(yǎng)物 4mL ，離心 10000rpm ，3min ，倒掉上清，用 100μL1×SDS 上樣緩沖液，重懸沉淀；剩余培養(yǎng)物離心 5000rpm ， 10min ，倒掉上清，用PBS重懸沉淀后超聲波破碎，取上清液與沉淀液分別加入 1×SDS 上樣緩沖液重懸。1.2.4SDS-PAGE 電泳 取菌液 40mL ， 4‰ 、離心 12 000rpm ， 5min ，倒掉上清；PBS洗滌菌體3次。PBS重懸沉淀，超聲破碎，設(shè)置為：工作 4s ，間歇 3s ，電壓 220V ， 15min 。超聲完成后，取 40μL 菌體與 10μL5×SDS 蛋白上樣緩沖液混勻，沸水浴 10min ，冷卻。配膠：使用新賽美 10% ExpressCastPAGE彩色凝膠快速試劑盒配制向制膠板內(nèi)倒入溶液，插入梳子，放至37℃培養(yǎng)箱內(nèi)，待上層膠凝固。上樣：安裝電泳裝置，槽中加滿 1× Tris-Glycine SDS 電泳緩沖液，沒過梳子，拔出梳子后，孔內(nèi)加入樣品，設(shè)定電壓 150V ， ；電泳結(jié)束后將凝膠塊放入考馬斯亮藍染色液中染色，時間 2h ，取出膠塊脫色 10h ，直至呈現(xiàn)清晰條帶，使用凝膠成像系統(tǒng)呈現(xiàn)圖像，拍照保存。1.2.5融合蛋白的Ni柱親和純化目的蛋白誘導表達后離心，向菌液沉淀中加入 5mL 裂解液，重懸細菌；冰上超聲裂解細菌，離心，取上清；將BeyoGold TM His-tagPurification Resin 裝柱， 2mL 裂解液平衡純化柱3次，收集穿流液并重復上柱

5次，以充分結(jié)合His標簽蛋白。 1mL 裂解液洗滌6次后， 1mL 洗滌液洗柱6次； 0.5mL 洗脫液洗脫8次，收集洗脫液；將收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用PBS透析過夜；蛋白加入緩沖液煮沸后進行SDS-PAGE分析，檢測蛋白純化效果。分別以BSA標準品與收集的蛋白溶液進行SDS-PAGE電泳檢測純化蛋白質(zhì)量。

2試驗結(jié)果

2.1重組pET28a-TMUV-E質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果分析重組載體經(jīng)ApaI和XhoI限制性內(nèi)切酶雙酶切后出現(xiàn) 4393bp 和 2679bp 兩條電泳條帶，同預期相符，見圖1。

2.2重組pET28a-TMUV-E質(zhì)粒測序鑒定結(jié)果分析重組載體核苷酸序列同預期一致，測序比較結(jié)果見圖2；重組載體pET28a-TMUV-E構(gòu)建成功，質(zhì)粒圖譜見圖3。

2.3重組原核表達載體SDS-PAGE分析結(jié)果 2.4純化蛋白 SDS-PAGE分析結(jié)果

將 pET28a（+） 誘導空載、未誘導菌液、誘導后菌液、誘導破碎后上清、誘導破碎后沉淀處理后分別進行SDS-PAGE電泳，經(jīng)考馬斯亮藍染色、脫色后分析。

結(jié)果顯示在 54.58kD 位置出現(xiàn)明顯的蛋白條帶，同預期相符合，表示蛋白成功表達。目的蛋白主要在誘導破碎后的上清液中，SDS-PAGE結(jié)果見圖4。

融合蛋白的Ni柱親和純化SDS-PAGE結(jié)果，見圖5，由此可見目的蛋白全部結(jié)合到層析柱，純化效果較好。

2.5蛋白質(zhì)檢分析

將 0.5mg/mL BSA標準品蛋白與純化后的目的蛋白同時進行SDS-PAGE電泳，經(jīng)考馬斯亮藍染色、脫色后，目的蛋白在 54.58kD 處出現(xiàn)明顯條帶，質(zhì)檢合格，結(jié)果見圖6。

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3討論與結(jié)論

鴨坦布蘇病毒病是由TMUV引起的以蛋鴨產(chǎn)蛋量驟降和雛鴨及育成鴨病毒性腦炎為主要特征的急性傳染病，目前該病在全國多個水禽養(yǎng)殖地區(qū)廣泛流行，給我國養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[12]，并對公眾健康造成潛在威脅[13]

E蛋白作為外膜蛋白參與鴨坦布蘇病毒的融合和穿入，能刺激機體產(chǎn)生中和抗體，是主要的免疫原性蛋白，其所含的大量抗原表位與病毒入侵宿主細胞以及病毒致病性密切相關(guān)[14]。本研究通過構(gòu)建pET28a-TMUV-E原核表達重組載體，成功地在原核表達系統(tǒng)中表達了TMUVE蛋白。王鈺等[15]通過原核表達系統(tǒng)對截短的E蛋白進行表達，發(fā)現(xiàn)其含有能夠精準識別鴨坦布蘇病毒的特異性抗原表位。這一發(fā)現(xiàn)為以E蛋白為關(guān)鍵靶點進行TMUV新型疫苗研發(fā)，提供了重要理論依據(jù)與技術(shù)支撐。

pET系列載體是目前最常用的重組表達載體，也是大腸桿菌表達系統(tǒng)的首選載體。本研究采用的 pET-28a（+） 原核表達載體，在大腸桿菌表達系統(tǒng)中，基礎(chǔ)表達水平極低，表達能力強大。在對外源目的基因進行原核表達的過程中，需要根據(jù)目的蛋白的下游應(yīng)用選擇合適的表達系統(tǒng)。為了方便純化，本研究采用的是大腸桿菌表達系統(tǒng)，具有易培養(yǎng)、易操作、成本低和表達水平高的特點。姬希文等[通過優(yōu)化誘導條件和插入片段的長度等方法解決了E蛋白表達量始終偏低的問題。針對在SDS-PAGE電泳過程中存在電泳條帶過粗和電泳分辨率不高的問題，本研究采取增加濃縮膠的長度和降低電壓的方法解決了電泳條帶過粗的問題；并通過將凝膠置于室溫凝固放置一段時間后再使用的方法，使聚丙烯酰胺充分聚合，提高了凝膠的分辨率。在目的蛋白純化過程中，發(fā)現(xiàn)HIS標簽蛋白洗脫后有雜帶，這種情況是由雜質(zhì)與標簽蛋白結(jié)合引起，可以通過在超聲破碎細胞之前添加去垢劑，增加去垢劑濃度，逐步優(yōu)化咪唑濃度，有效減少了雜質(zhì)的產(chǎn)生，提高了蛋白純度。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了原核表達重組載體pET28a-TMUV-E，且E蛋白可在大腸桿菌中正確表達。

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Prokaryotic Expression ofE protein ofDuck Tembusu Virus

WANG Jiayu1，ZHANG Chi¹ ，WANG Lin² ，ZHANG Zhenpeng3，DIAO Youjiang1 （1.ShandongAgricultureand EngineeringUniversity，Jinan25010o，China; 2.JinanYiminAnimalPharmaceutical C0. ，Ltd.，Jinan 50100，China; 3.ShandongLugangFuyouPharmaceutical co. ，Ltd.，Jinan，China）

Abstract：E protein is the major antigen of Tembusu virus （TMUV），and to express this antigenusing the prokaryotic expression system，inthis study，we referred to the published E gene sequence of duck Tembusu virus in GenBank，and ligated the E gene into the cloning vector by gene synthesis; On this basis，we used homologous recombination to recombine the E gene with the prokaryotic expression vector pET -28a（+） ；therecombinant plasmid pET28a-TMUV-Ewas constructed by transforming the pET28a-TMUV-E plasmid into BL21（DE3） expressing strain. On this basis，the E gene was recombined with the prokaryotic expression vector pET-28a（+） by homologous recombination technology to construct the recombinant plasmid pET28aTMUV-E; the pET28a-TMUV-E plasmid was transformed into BL21（DE3） expression strain，and the recombinant protein was expressed under the induced culture of IPTG.SDS-PAGE showed that the molecular weight of the expressed recombinant protein was 54.58kDa ，which was basically the same as the expected size of the protein bands;the recombinant protein was expressed in a purified form to be suitable for the applicationof the protein.Inorder to obtain a purer target protein for downstream experiments，this study also carried out Ni-columnaffinity purification of the fusion protein obtained from the expression of the E protein; the purification results showed that the target protein was allbound to the chromatographic column，and the SDSPAGE showed that the target protein was purified with good eficiency and no heterogeneous bands.In conclusion，the prokaryotic expression recombinant vector pET28a-TMUV-E was successfully constructed in this study，and the E protein could be correctly expressed in E .coli.

Keywords：Duck Tembusu virus;E protein;Prokaryotic expression; Purification