[摘要］目的探討RAD51蛋白對(duì)卵巢癌新輔助化療（NACT）敏感性的影響。方法取2017年6月—2019年6月于青島大學(xué)附屬醫(yī)院婦科行NACT + 中間型腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)治療的47例晚期高級(jí)別漿液性卵巢癌（HG-SOC）患者 NACT前腫瘤穿刺組織，采用免疫組化法檢測(cè)腫瘤組織中RAD51蛋白表達(dá)水平，并分析其表達(dá)水平與患者NACT敏感性的關(guān)系。將SKOV3細(xì)胞（分為 a～f 組）和SKOV3-順鉑（DDP）耐藥細(xì)胞（分為 A～F 組）中 b～ f組和 B～F 組分別轉(zhuǎn)染 NC-siRNA、siRNA-RAD51-264、siRNA-RAD51-416、siRNA-RAD51-608、siRNA-RAD51-807，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)SKOV3細(xì)胞和 SKOV3-DDP 耐藥細(xì)胞中 表達(dá)水平。將SKOV3-DDP耐藥細(xì)胞分為 SKOV3-Control 組（對(duì)照組）、SKOV3-DDP-Control 組（DDP 對(duì)照組）、SKOV3-DDP-NC-siRNA 組（轉(zhuǎn)染 NC-siRNA）、SKOV3-DDP-siRNA-RAD51 組（轉(zhuǎn)染 siRNA-RAD51），Western blotting 方法檢測(cè)各組細(xì)胞中RAD51蛋白表達(dá)水平。將 SKOV3-DDP耐藥細(xì)胞分為NC-siRNA 組（轉(zhuǎn)染NC-siRNA）和 siRNA-RAD51組（轉(zhuǎn)染siRNA-RAD51-264），分別加入 0.39，0.78，1.56，3.12，6.25，12.50，25.00mg/L 濃度的DDP處理^48h ，CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè) SKOV3-DDP耐藥細(xì)胞轉(zhuǎn)染后細(xì)胞活力。將 SKOV3-DDP耐藥細(xì)胞分為Control組（對(duì)照組）、NC-siRNA 組（轉(zhuǎn)染 NC-siRNA）、siRNA-RAD51 組（轉(zhuǎn)染 siRNA-RAD51）、siRNA-RAD51 + DDP組（轉(zhuǎn)染siR-NA-RAD51十DDP 處理），流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) SKOV3-DDP 耐藥細(xì)胞周期的變化和細(xì)胞凋亡率。結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示，卵巢癌組織中RAD51蛋白高表達(dá)組和低表達(dá)組患者的年齡、FIGO分期（Ⅲ期或N期）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腹水情況及首次血清CA125水平比較差異無(wú)顯著性（ Pgt;0.05 ，化療敏感組和不敏感組患者腫瘤組織中RAD51蛋白表達(dá)水平比較差異有顯著性 （Υ²=10.85，Plt;0.05） 。RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，SKOV3-DDP細(xì)胞中RAD51mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著高于SKOV3細(xì)胞 （t=6.73，Plt;0.05），c/C 組細(xì)胞中 水平較 a/A 組顯著降低 （F=7.81，6.58，Plt;0.05），d/D，e/E，f/F 組與 a/A 組比較差異無(wú)顯著性 （Pgt;0.05） ;Westernblotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與A組比較，B組細(xì)胞內(nèi)RAD51蛋白表達(dá)水平顯著升高；與A組和B組比較，D組細(xì)胞內(nèi)RAD51蛋白水平顯著降低 （F=10.56，Plt;0.05） ）。CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，與NC-siRNA組比較，siRNA-RAD51-264組細(xì)胞活力在DDP濃度為 3.12，6.25，12.50，25.00mg/L 時(shí)明顯下降 （t=3.72～63.90，Plt;0.05） 。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與Control組和NC-siRNA組比較，siRNA-RAD51組和 siRNA-RAD51 + DDP組細(xì)胞的 G₀/G₁ 期細(xì)胞比例顯著增加;與siRNA-RAD51 組比較，siRNA-RAD51+DDP 組細(xì)胞的 G₀/G₁ 期細(xì)胞比例顯著增加 （F=23.29，Plt;0.05） ：與Control組和NC-siRNA組比較，siRNA-RAD51+DDP 組細(xì)胞的S期細(xì)胞比例顯著減少 （F=12.95，Plt;0.05） ：與Control 組和 NC-siRNA組比較，siRNA-RAD51組和 siRNA-RAD51+DDP 組的細(xì)胞凋亡率均顯著性升高（ F= 16.34，Plt;0.05） 。結(jié)論卵巢癌組織中RAD51蛋白高表達(dá)患者對(duì) NACT敏感性更差;敲降 SKOV3-DDP 耐藥細(xì)胞RAD51基因表達(dá)可有效逆轉(zhuǎn)該細(xì)胞對(duì)DDP的耐藥性，提高化療的敏感性。

[中圖分類(lèi)號(hào)] R737.31 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

The impact of RAD51 protein on the sensitivity of ovarian cancer to neoadjuvant chemotherapy LIU

Hui，CHENYunqing，QIHuiyang，SUNXin，LOUYanui（DepartmentofGynecology，TheAfiliatedHospitalofQingdac University，Qingdao 266003，China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the impact of RAD51 protein on the sensitivity of ovarian cancer to neoadjuvant chemotherapy（NACT）.MethodsTumor biopsytissue samples werecolected before NACT from47 patients with advanced high-grade serous ovariancancer（HGSOC）whounderwentNACTand intermediate tumorcellreductionsurgery in Departmentof Gynecology，The AffiatedHospitalofQingdao University，from June2O17to June 2O19.Immunohistochemistry wasusedto measuretheexpresionlevelofRAD5lproteinintumor isue，andthecorrelationbetweenitsexpressonlevelandthesesitivity to NACT was analyzed. SKOV3 cells were divided into groups a-f ，and cisplatin （DDP）-resistant SKOV3 cells were divided into groups A-F；the cells in groups b-f or groups B-F were transfected with NC-siRNA，siRNA-RAD51-264，siRNA-RAD51-416， siRNA-AD51-608，and siRNA-RAD51-807，respectively，and then quantitative real-time PCR wasused to measure the mRNA expression levelsof RAD51 in each groupofSKOV3cellsand DDPresistant SKOV3 cells.TheDDP-resistant SKOV3cellswere divided into SKOV3-Control group（control group），SKOV3-DDP-Control group （DDP control group）， SKOV3-DDP-NC-siRNA group （transfected with NC-siRNA），and SKOV3-DDP-siRNA-RAD51 group（transfectedwith siRNA-RAD51），and Western blotting was usedto measuretheexpressonlevelofRAD51protein ineach groupofcells.TheDDP-resistant SKOV3cellsweredivided into NC-siRNA group （transfected with NC-siRNA）andsiRNA-RAD51 group（transfected with siRNA-RAD51-264），and DDP at various concentrations（0.39，0.78，1.56，3.12，6.25，12.50，and 25.00mg/L ）wasadded for culture for ^48h ; CCK-8 assay was used tomeasuretheviabilityofDDP-resistantSKOV3celsaftertransfection.TheDDP-resistantSKOV3cellsweredividedintoControl group，NC-siRNA group（（transfected with NC-siRNA），siRNA-RAD51 group（transfected with siRNA-RAD51），and siRNARAD51+DDP group（transfected with siRNA-RAD51and subsequently treated with DDP），and flow cytometry wasused to observecellcclealterationsandapoptosisateinDD-resistantSKOV3cels.ResultsImmunohistochemistryshowedthatthere werenosignificantdiferencesinage，F(xiàn)IGOstage（stageIorIV），lymphnodemetasasisascitesandinitialserumCA25level between the patients with high RAD5l expression and those with low expression （ （Pgt;0.05） ，and there was a significant difference intheexpressonlevelofRAD51 protein intumor tisse between thechemotherapy-sensitivegroupand theinsensitive group X²= 10.85，Plt;0.05 ）.RT-qPCR showed that the relative mRNA expression level of RAD51 in SKOV3-DDP cells was significantly higher than that in SKOV3 cells （t=6.73，Plt;0.05 ），and the mRNA expression level of RAD51 in group c/C was significantly lower than that in group a/A （ F=7.81，6.58，Plt;0.05） ；there was no significant difference in the mRNA expression level of RAD51 between groups d/D e/E ， f/F and group a/A（ Pgt;0.05' . Western bloting showed that compared with group A，group B hadasignificant increaseintheproteinexpresionlevelofRAD5lincells，andcomparedwith groups AandB，groupDhadasignificant reduction in the protein expression level of RAD51 （ F=10.56，Plt;0.05） . CCK-8 assay showed that compared with the NCsiRNA group，thesiRNA-RAD51-264 grouphadasignificantreductionincellviabilityatDDPconcentrationsof3.12，6.25，12.50， and 25.00mg/L ？ t=3.72-63.90，Plt;0.05） . Flow cytometry showed that compared with the Control group and the NC-siRNA group，the siRNA-RAD51 group and the siRNA-RAD5 1+ DDP group had a significant increase in the proportion of cells in the G₀ / G₁ phase，and compared with the siRNA-RAD5l group，the siRNA-RAD51+DDP group hada significant increase in the proportion of cells in the G₀/G₁ phase ΔF=23.29，PΔlt;0.05Δ ；compared with the Control group and the NC-siRNA group，the siRNARAD51+DDP group had a significant reduction in the proportion of cells in the S phase （ F=12.95，Plt;0.05） .Compared with the Control group and the NC-siRNA group，both the siRNA-RAD51 group and the siRNA-RAD51+DDP group had a significant increase in apoptosis rate F=16.34，Plt;0.05 .ConclusionPatients with a high expression level of RAD51 protein in ovarian cancer tissue tend to have poorer sensitivity to NACT，and knocking down the expression of RAD51 gene in DDP-resistant SKOV3 cells can effectively reverse the resistance of these cels to DDP and enhance the sensitivity to chemotherapy.

[KEY WORDs]Cystadenocarcinoma，serous；Ovarian neoplasms; Chemotherapy，adjuvant； Rad51 recombinase； Drug resistance，neoplasm;Cisplatin

高級(jí)別漿液性卵巢癌（high-grade serous ova-riancancer，HGSOC）是婦科惡性腫瘤中致死率最高的類(lèi)型，對(duì)于晚期不適合初始腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)的患者，新輔助化療（NACT）能夠降低手術(shù)難度，并減少圍術(shù)期患者并發(fā)癥發(fā)生率及死亡率[1-2]。然而，由于卵巢癌的高度異質(zhì)性以及化療前腫瘤負(fù)荷較大，NACT可能誘使鉑類(lèi)藥物耐藥性進(jìn)一步加重[3-4]因此，在開(kāi)始治療前識(shí)別可能出現(xiàn)耐藥的卵巢癌患者具有重要意義。

近年來(lái)，CA125清除速率常數(shù)K（KELIM）值被用作卵巢癌CA125高表達(dá)患者化療敏感性的預(yù)測(cè)指標(biāo)。研究顯示，KELIM值 ?1 的晚期卵巢癌患者對(duì)鉑類(lèi)化療反應(yīng)率較KELIM值 lt;1 的患者高，是后續(xù)鉑類(lèi)耐藥風(fēng)險(xiǎn)和生存率的獨(dú)立和主要預(yù)測(cè)因子[5-8]。然而，KELIM值無(wú)法在化療開(kāi)始前對(duì)原發(fā)性鉑耐藥患者進(jìn)行篩選和識(shí)別。因此，目前尚缺乏有效的化療前預(yù)測(cè)指標(biāo)。

RAD51是同源重組（HR）修復(fù)過(guò)程中的核心蛋白，是DNA雙鏈斷裂（DSBs）修復(fù)的重要因子[9]，在維持基因組完整性和穩(wěn)定性中起關(guān)鍵作用，其過(guò)表達(dá)可顯著增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)鉑類(lèi)藥物的耐受性[10-11]，并降低了患者術(shù)后對(duì)鉑類(lèi)藥物的化療反應(yīng)性，縮短了患者的無(wú)進(jìn)展生存期[12]。但有關(guān)RAD51蛋白與術(shù)前NACT化療敏感性的研究尚鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究基于KELIM值將接受NACT的HGSOC患者分為化療敏感組和不敏感組，分析兩組患者RAD51蛋白表達(dá)差異及其與化療敏感性的關(guān)系；同時(shí)在體外培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞，構(gòu)建RAD51敲降模型，進(jìn)一步探討RAD51蛋白與卵巢癌細(xì)胞鉑類(lèi)藥物化療敏感性的關(guān)系，為逆轉(zhuǎn)化療耐藥提供新的研究靶點(diǎn)。

1對(duì)象與方法

1.1 臨床研究對(duì)象的數(shù)據(jù)收集和相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

1.1.1研究對(duì)象選取2017年6月—2019年6月在婦科行 NACT+ 中間型腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)治療的晚期HGSOC患者47例，年齡45～76 歲，平均 （57.72±8.28） 歲。納入標(biāo)準(zhǔn)： ① 術(shù)前均接受了 3～4 療程的NACT，化療方案為紫杉醇 + 卡鉑靜脈化療或順鉑（DDP）腹腔灌注者； ② 手術(shù)均達(dá)到理想腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)且術(shù)后經(jīng)病理確診為I～N 期HGSOC者； ③ 無(wú)嚴(yán)重心腦血管疾病、無(wú)影響免疫組化結(jié)果的合并癥（如免疫系統(tǒng)疾?。┱撸虎?術(shù)后未使用貝伐珠單抗和（或）PARP抑制劑維持治療者。收集所有HGSOC患者NACT前的腫瘤活檢組織，經(jīng) 10% 甲醛固定以及石蠟包埋后切片，切片厚度為 4μm 。

1.1.2 免疫組化法檢測(cè)腫瘤組織中RAD51蛋白表達(dá)量 取患者腫瘤組織切片標(biāo)本，烤片機(jī) 65^°C 烤片30min ，后脫蠟至水，進(jìn)行抗原修復(fù)后用 3% 過(guò)氧化氫消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，一抗 （1：1 000 稀釋?zhuān)? 下孵育 2～3h ，PBS清洗3次，二抗室溫下孵育 40min ，顯色后蘇木素復(fù)染，乙醇脫水后中性樹(shù)膠封片，置于熒光顯微鏡下觀察免疫組化染色結(jié)果。以細(xì)胞核或細(xì)胞漿中有淡黃色至棕褐色顆粒判斷為RAD51蛋白染色陽(yáng)性，每張切片隨機(jī)選5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野中計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，分別對(duì)于胞質(zhì)或者胞槳染色強(qiáng)度以及陽(yáng)性染色細(xì)胞占比進(jìn)行評(píng)分，將兩者評(píng)分的乘積作為最終得分[13]，得分 lt;8 為RAD51低表達(dá)組， 8? 得分 ?12 者納入RAD51高表達(dá)組。結(jié)果的判讀由兩位醫(yī)師獨(dú)立完成，當(dāng)結(jié)果不一致時(shí)，取兩位醫(yī)師評(píng)分的平均值作為最終的結(jié)果。

1.1.3患者的臨床病理特征收集及其KELIM值計(jì)算收集所有患者的臨床病理特征資料，包括年齡、FIGO分期、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否腹水、首次血清CA125水平。收集所有患者每個(gè)NACT周期的首日日期和NACT100d內(nèi)的前3次血清CA125水平及相應(yīng)的檢查日期，輸人https：//www.biomar-ker-kinetics.org網(wǎng)站，進(jìn)而計(jì)算KELIM值。根據(jù)KELIM值將所有患者進(jìn)行分組[5]，KELIM值 ?1 者設(shè)為化療敏感組，KELIM值 lt;1 者設(shè)為化療不敏感組。

1.2 細(xì)胞株及主要試劑

卵巢癌細(xì)胞系SKOV3細(xì)胞及SKOV3-DDP耐藥細(xì)胞購(gòu)自南京萬(wàn)木春生物有限公司，RAD51siR-NA購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，Anti-RAD51Antibody購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，DDP購(gòu)自上海陶術(shù)生物科技有限公司，CCK-8檢測(cè)試劑盒購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司，Trizol裂解液購(gòu)自美國(guó)AppliedBiosystems公司，蛋白質(zhì)抽提試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 SKOV3細(xì)胞和SKOV3-DDP耐藥細(xì)胞的培 養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

將SKOV3細(xì)胞和SKOV3-DDP耐藥細(xì)胞置于含 10% 胎牛血清和 1% 青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基）中，于 、含體積分?jǐn)?shù) 0.05CO₂ 的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，其中SKOV3-DDP耐藥細(xì)胞培養(yǎng)液中添加 0.5mg/L DDP維持細(xì)胞耐藥性。待培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá) 60%～70% 時(shí)，分別將SKOV3細(xì)胞和SKOV3-DDP細(xì)胞分為 a～f 組和 A～F 組。b～f 組以及 B～F 組分別轉(zhuǎn)染NC-siRNA、siRNA-RAD51-264、siRNA-RAD51-416、siRNA-RAD51-608、siRNA-RAD51-807，操作嚴(yán)格按照細(xì)胞轉(zhuǎn)染說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，a組和轉(zhuǎn)染后的 b～f 組均于完全培養(yǎng)基中培養(yǎng) ^48h ，A組和轉(zhuǎn)染后的 B～F 組均于含有0.5mg/L DDP的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng) ^48h 。

1.4RT-qPCR檢測(cè) SKOV3 和 SKOV3-DDP耐藥細(xì)胞中 表達(dá)水平

在SKOV3細(xì)胞和SKOV3-DDP細(xì)胞中，以及上述處理結(jié)束后各組細(xì)胞中，分別加入Trizol裂解液提取各組細(xì)胞總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件設(shè)置為： 95^°C，30s ;然后 95^°C，10s，60^°C 30 s，共40 個(gè)循環(huán)。采用 2^-ΔΔCT 法計(jì)算各組細(xì)胞中mRNA相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.5Western blotting方法檢測(cè)各組 SKOV3-DDP耐藥細(xì)胞中RAD51蛋白表達(dá)水平

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3-DDP耐藥細(xì)胞，以每孔約 6×10⁵ 個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá) 60%～70% 時(shí)，將其分為SKOV3-Control組、SKOV3-DDP-Control組、SKOV3-DDP-NC-siRNA組、SKOV3-DDP-siRNA-RAD51組。SKOV3-Con-trol組和SKOV3-DDP-Control組分別于完全培養(yǎng)基和含有 0.5mg/L DDP完全培養(yǎng)基中培養(yǎng) ^48h SKOV3-DDP-NC-siRNA 組 和 SKOV3-DDP-siR-NA-RAD51組分別轉(zhuǎn)染NC-siRNA以及siRNA-RAD51-264后，于含 0.5mg/L DDP完全培養(yǎng)基中培養(yǎng) ^48h 。處理結(jié)束后，以RIPA蛋白裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度，各蛋白樣品取 20μg 行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，TBST洗膜3次，浸入RAD51一抗過(guò)夜孵育。再次TBST洗膜3次，浸入二抗，搖床室溫孵育 。ECL發(fā)光液A和B按 1：1 比例等體積混勻，取適量均勻滴于目的條帶位置，于化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)曝光，使用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值，以 β -actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.6CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SKOV3-DDP耐藥細(xì)胞的細(xì)胞活力

將融合度達(dá) 60%～70% 的SKOV3-DDP耐藥細(xì)胞分為NC-siRNA組和siRNA-RAD51組，分別轉(zhuǎn)染NC-siRNA和siRNA-RAD51-264。兩組細(xì)胞培養(yǎng) ^48h 后，分別加人0.39、0.78、1.56、3.12、6.25、12.50，25.00mg/L 濃度的DDP，繼續(xù)培養(yǎng) ^48h 以后每孔加入 10μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng) ^2h 。采用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng) 450nm 處的吸光度值，并計(jì)算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力 （實(shí)驗(yàn)組吸光度值一空白組吸光度值）/（對(duì)照組吸光度值一空白組吸光度值） x 100% 。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。計(jì)算DDP抑制SKOV3-DDP耐藥細(xì)胞活力的 IC₅₀ ，后續(xù)實(shí)驗(yàn)的DDP濃度為 IC₅₀ 的 50% 。

1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SKOV3-DDP耐藥細(xì)胞的細(xì)胞周期

將細(xì)胞融合度達(dá) 60%～70% 的 SKOV3-DDP耐藥細(xì)胞分為Control組、NC-siRNA組、siRNA-RAD51組、siRNA-RAI ）51+DDP 組。Control組細(xì)胞在含有 0.5mg/L DDP的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)^48h ;NC-siRNA組、siRNA-RAD51組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染了NC-siRNA和siRNA-RAD51-264以后在含有0.5mg/L DDP完全培養(yǎng)基當(dāng)中培養(yǎng) ^48h ; siRNA-RAD51+DDP 組細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-RAD51-264后在含有 0.5mg/L DDP完全培養(yǎng)基中培養(yǎng) 24h 后，再加入濃度為 7.30mg/L 的DDP溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h 。胰酶消化各組細(xì)胞后轉(zhuǎn)移至 15mL 離心管中， 1380r/min 離心 5min 。棄上清液，加入預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞沉淀 2～3 次，以 -20°C 預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)0.75乙醇重懸細(xì)胞，后置于一 20°C 冰箱固定過(guò)夜。次日 1380r/min 離心 5min 收集細(xì)胞，加入500μL 預(yù)冷的PBS，調(diào)整細(xì)胞密度至 1×10⁸ 個(gè)/L，加入碘化丙啶（PI）染色液以及RNA酶室溫染色10min 。以流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組SKOV3-DDP耐藥細(xì)胞的細(xì)胞周期情況，使用FlowJo軟件計(jì)算處于 G₀/G₁ 期和S期的細(xì)胞比例。

1.8流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組SKOV3-DDP耐藥細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率

將處理結(jié)束的Control組、NC-siRNA組、siR-NA-RAD51組、 Δ.siRNA–RAD51+DDP 組細(xì)胞，胰酶消化后調(diào)整細(xì)胞密度至 1×10⁹ 個(gè)/L;加入 4^°C 預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次以 1380r/min 離心3min ；用 300μL 預(yù)冷的BindingBuffer重懸細(xì)胞后，每管加入 2μL Annexin V-FITC和 5μL PI，室溫下避光孵育 10min ;每管再加入 200μL 預(yù)冷的BindingBuffer，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡的情況，使用FlowJo軟件計(jì)算細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS27.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。計(jì)數(shù)資料以例（率）表示，組間比較采用 χ² 檢驗(yàn)。計(jì)量資料以 x±s 表示，兩組間比較采用 Ψ_tΨ_Ψ 檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Bonferroni法；不同濃度、不同組別的比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析。以 Plt;0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1RAD51蛋白在HGSOC患者腫瘤組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系

免疫組化法染色結(jié)果顯示，RAD51蛋白主要在腫瘤組織的細(xì)胞核中表達(dá)（圖1），細(xì)胞槳中部分表達(dá)。47例HGSOC患者當(dāng)中，RAD51高表達(dá)組19例，RAD51低表達(dá)組28例。RAD51高、低表達(dá)組患者的年齡、FIGO分期（Ⅲ期或Ⅳ期）、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否腹水及首次血清CA125水平比較差異無(wú)顯著性 （Pgt;0.05） 。見(jiàn)表2。

A、B分別為RAD51蛋白在HGSOC患者腫瘤組織的細(xì)胞核中高、低表達(dá)；免疫組化染色，200倍

2.2HGSOC患者腫瘤組織中RAD51蛋白表達(dá)與NACT敏感性的關(guān)系

47例患者中，化療敏感組26例，其中腫瘤組織中RAD51蛋白高表達(dá)患者5例，RAD51蛋白低表達(dá)者21例；化療不敏感組21例，其中腫瘤組織中RAD51蛋白高表達(dá)者14例，低表達(dá)者7例，兩組患者的腫瘤組織中RAD51蛋白表達(dá)水平比較差異具有顯著性 （Υ²=10.85，Plt;0.05） 。

2.3敲降SKOV3 和SKOV3-DDP細(xì)胞RAD51基因后其 及蛋白表達(dá)情況

RT-qPCR結(jié)果顯示，SKOV3細(xì)胞和SKOV3-DDP細(xì)胞中 相對(duì)表達(dá)水平分別為1.00±0.00，1.19±0.05 ，兩者比較差異具有顯著性0 ?t=6.73，Plt;0.05） 。 a～f 組 相對(duì)表達(dá)水平分別為 1.00±0.00，1.08±0.32，0.31± 0.07，0.81±0.21，0.94±0.14，0.65±0.10 ，各組間比較差異有顯著性 （F=7.81，Plt;0.05） ，其中c組與a、b組比較顯著降低 （Plt;0.05），d，e，f 組分別與a、b組相比較差異無(wú)顯著意義 （Pgt;0.05） 。 A～F 組 相對(duì)表達(dá)水平分別為 1.00±0.00 、1.14±0.21，0.50±0.10，0.87±0.27，0.95±0.12. 0.63±0.12 ，各組之間比較具有顯著差異（ F=6.58 .Plt;0.05^? ，其中C組與A組、B組比較顯著降低（ ΔPlt;0.05Δ ，D、E、F組分別與 A，B 組比較差異無(wú)顯著性（ ）。因此選用siRNA-RAD51-264用于后續(xù)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。

Westernblotting方法檢測(cè)結(jié)果顯示， A～D 組細(xì)胞中RAD51蛋白表達(dá)水平分別為 0.68±0.14 、1.04±0.13，0.87±0.20，0.39±0.57 ，各組間比較差異有顯著性 （F=10.56，Plt;0.05） ；其中B組較A組比較顯著升高，D組較A、B組比較顯著降低（ Plt; 0.05）。見(jiàn)圖2。

2.4不同濃度DDP對(duì)SKOV3-DDP耐藥細(xì)胞活力的影響

CCK-8方法檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)0.39、0.78、1.56、3.12.6.25.12.50.25.00mg/L 濃度的DDP處理后，NC-siRNA組細(xì)胞的細(xì)胞活力分別為 2.53±0.08 、2.58±0.08，2.69±0.09，2.75±0.02，2.84±0.23， 2.81±0.02，2.24±0.35 ，siRNA-RAD51-264組的細(xì)胞活力分別為 2.45±0.07，2.62±0.04，2.62±0.07 2.49±0.04，2.24±0.16，1.55±0.03，0.47±0.04， 。重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析結(jié)果顯示，分組、濃度、分組和濃度交互作用對(duì)細(xì)胞活力均有顯著影響 （F_//f= 389.58，F(xiàn)_???=70.95，F(xiàn)_??=38.84，Plt;0.05） ；單獨(dú)效應(yīng)的分析結(jié)果顯示，隨著DDP濃度升高，siRNA-RAD51-264組細(xì)胞活力明顯下降（ F=338.17，Plt; 0.05），NC-siRNA組細(xì)胞活力無(wú)顯著性差異（ Pgt; 0.05）；在DDP濃度為 3.12.6.25.12.50.25.00mg/L 時(shí)，siRNA-RAD51-264組的細(xì)胞活力較NC-siRNA組顯著降低 （t=3.72～63.90，Plt;0.05） 。

2.5敲降SKOV3-DDP耐藥細(xì)胞中RAD51基因?qū)ζ浼?xì)胞周期的影響

Control組、NC-siRNA組、siRNA-RAD51組、siRNA-RAD51+DDP組細(xì)胞阻滯于 G₀/G₁ 期的細(xì)胞比例分別為 （53.73±2.98）% ： （50.53±4.56）% （ 60.73±1.70）% 、 （69.30±1.78）% ，各組間比較差異有顯著性 （F=23.29，Plt;0.05） ，除了Control組與NC-siRNA組比較無(wú)顯著差異外，其他幾組各組間兩兩比較均有顯著差異 （Plt;0.05） 。Control組、NC-siRNA組、siRNA-RAD51組、siRNA-RAD51十DDP組中S期細(xì)胞的比例分別為 （21.27±0.76）% 、（2 （21.97±2.02）% 服 （18.33±3.23）% 、（ 12.50± 1.44）% ，各組間比較差異有顯著性 （F=12.95，Plt; 0.05），其中 siRNA-RAD51+DDP 組與Control組、NC-siRNA組比較差異有顯著性 （Plt;0.05） 。見(jiàn)圖3。

2.6敲降SKOV3-DDP耐藥細(xì)胞中RAD51基因?qū)ζ浼?xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的結(jié)果顯示，Control組、NC-siRNA組、siRNA-RAD51組以及siRNA-RAD ⁵¹⁺DDP組的細(xì)胞調(diào)亡率分別為 （10.18±5.52）% 、（8.70±1.32）% 、 16.02±2.18）% 、（ ?19.97± 3.31）% ，各組間比較差異有顯著性 （F=16.34，Plt; 0.05），其中siRNA-RAD51組、siRNA-RAD51 +DDP組分別與Control組、NC-siRNA組相比，細(xì)胞凋亡率顯著升高 （Plt;0.05 。見(jiàn)圖4。

3討論

近年來(lái)，對(duì)于無(wú)法實(shí)現(xiàn)理想腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)的晚期卵巢癌患者，常需要先進(jìn)行 3～4 次NACT，以降低腫瘤負(fù)荷后再行中間型腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)治療[14]。對(duì)于一些化療耐藥的原發(fā)性患者，NACT不僅達(dá)不到理想的化療效果，而且在化療過(guò)程中積累的細(xì)胞毒性或細(xì)胞突變可能會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)腫瘤的耐藥性[15]。因此，有效篩選適合NACT的患者，提高初治后鉑類(lèi)藥物的化療反應(yīng)性，對(duì)于延長(zhǎng)患者生存期非常重要。DSBs是鉑類(lèi)化療藥物致腫瘤細(xì)胞死亡的重要環(huán)節(jié)，抑制鉑類(lèi)化療藥物誘導(dǎo)的DNA損傷的關(guān)鍵修復(fù)途徑是 HR^[16-17] 。RAD51蛋白過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)HR修復(fù)能力，改變重組途徑及增加基因組的不穩(wěn)定性，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)放療和化療耐受性增強(qiáng)[18-20]。HOPPE等[21]研究也發(fā)現(xiàn)，RAD51高表達(dá)卵巢癌患者的原發(fā)性鉑耐藥風(fēng)險(xiǎn)更高。

本研究顯示，RAD51蛋白主要在腫瘤組織的細(xì)胞核中表達(dá)，而且RAD51蛋白高表達(dá)者較RAD51蛋白低表達(dá)者對(duì)NACT敏感性更差?？赡苣[瘤組織中高表達(dá)的RAD51可及時(shí)修復(fù)損傷的DNA，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞耐藥性，進(jìn)而降低其化療敏感性。研究顯示，在乳腺浸潤(rùn)癌和結(jié)腸腺癌患者中，化療不敏感組的RAD51表達(dá)要高于敏感組[22]；RAD51高表達(dá)卵巢癌患者對(duì)鉑、紫杉烷和PARP抑制劑的耐藥性增加，鉑類(lèi)耐藥患者腫瘤組織中RAD51表達(dá)水平顯著升高[23]。為進(jìn)一步驗(yàn)證RAD51蛋白表達(dá)與卵巢癌細(xì)胞鉑類(lèi)藥物化療敏感性的關(guān)系，本研究在體外培養(yǎng)卵巢癌SKOV3細(xì)胞和SKOV3-DDP耐藥細(xì)胞，對(duì)兩種細(xì)胞RAD51mRNA和蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。研究結(jié)果顯示，SKOV3-DDP耐藥細(xì)胞中RAD51mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平較SKOV3細(xì)胞顯著升高。隨后篩選出轉(zhuǎn)染效果最佳的siR-NA-RAD51-264用于后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

本研究進(jìn)一步的結(jié)果顯示，隨著DDP濃度升高，siRNA-RAD51-264組細(xì)胞活力顯著下降；同一濃度之下，siRNA-RAD51-264組細(xì)胞的活力較NC-siRNA組也顯著下降。提示敲降RAD51基因后，SKOV3-DDP耐藥細(xì)胞對(duì)DDP的耐藥性降低，敏感性增加，DDP的抗腫瘤活性增強(qiáng)。本研究的細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示，敲降SKOV3-DDP耐藥細(xì)胞中RAD51基因后，細(xì)胞阻滯于 G₀/G₁ 期，S期細(xì)胞比例下降，同時(shí)敲降RAD51基因后再行DDP處理，阻滯于 G₀/G₁ 期的細(xì)胞比例進(jìn)一步增加，提示細(xì)胞增殖受到抑制。RAD51基因敲降后，DSBs修復(fù)能力下降，激活A(yù)TM-CHK1/CHK2信號(hào)通路，觸發(fā)細(xì)胞 G₁/S 檢查點(diǎn)，使腫瘤細(xì)胞阻滯于 G₀/G₁ 期而不能進(jìn)入S期。鉑類(lèi)藥物作用于腫瘤細(xì)胞后形成DNA 鏈交聯(lián)，導(dǎo)致DSBs[24-25]，此時(shí)再加人DDP，進(jìn)一步加劇了DDP對(duì)SKOV3-DDP耐藥細(xì)胞的損傷作用。綜合以上研究結(jié)果，敲降RAD51基因后，SKOV3-DDP耐藥細(xì)胞對(duì)DDP敏感性增加，耐藥性下降，DDP抗腫瘤細(xì)胞作用增強(qiáng)。ZHANG等[26]研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍和DDP聯(lián)合應(yīng)用后，二甲雙胍抑制了DDP引起的ATM/CHK2信號(hào)通路的激活，同時(shí)上調(diào)卵巢癌細(xì)胞中RAD51修復(fù)蛋白，導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞對(duì)DDP的耐藥性增強(qiáng)。本研究的細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)也顯示，敲降SKOV3-DDP耐藥細(xì)胞中的RAD51基因后，細(xì)胞凋亡率顯著升高。提示SK-OV3-DDP耐藥細(xì)胞可能因?yàn)樽铚?G₀/G₁ 期，無(wú)法進(jìn)行復(fù)制，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

鉑類(lèi)藥物耐藥性通常與HR修復(fù)能力增強(qiáng)有關(guān)，HR修復(fù)能力增強(qiáng)可使癌細(xì)胞更有效地修復(fù)鉑類(lèi)藥物造成的 DSBs^[17，27] 。而通過(guò)敲降或者抑制RAD51來(lái)抑制HR修復(fù)能力，也是逆轉(zhuǎn)耐藥性、增強(qiáng)化療敏感性的有效策略[28]。既往研究報(bào)道，用RAD51小分子抑制劑作用于食管腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞系后，鉑類(lèi)化療藥物的細(xì)胞毒性增強(qiáng)，腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性增加[29]。綜上可見(jiàn)，通過(guò)敲降RAD51或者開(kāi)發(fā)RAD51抑制劑，可以有效逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)DDP的耐藥性，提高化療敏感性，為逆轉(zhuǎn)卵巢癌鉑類(lèi)耐藥提供新的研究靶點(diǎn)。

綜上所述，卵巢腫瘤組織中RAD51蛋白高表達(dá)患者對(duì)NACT敏感性差，腫瘤組織中RAD51蛋白表達(dá)水平有望成為卵巢癌患者NACT敏感性指標(biāo)，敲降RAD51可有效逆轉(zhuǎn)SKOV3-DDP耐藥細(xì)胞對(duì)DDP的耐藥性，提高化療敏感性。期待通過(guò)靶向RAD51開(kāi)發(fā)新的治療藥物，通過(guò)下調(diào)RAD51表達(dá)來(lái)增強(qiáng)化療敏感性，以改善卵巢癌患者生存預(yù)后，為逆轉(zhuǎn)卵巢癌鉑類(lèi)藥物耐藥性提供新的研究靶點(diǎn)。

倫理批準(zhǔn)和知情同意：本研究涉及的所有試驗(yàn)均已通過(guò)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)（文件號(hào)QYFYWZLL29813）。所有試驗(yàn)過(guò)程均遵照《醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)》的條例進(jìn)行。受試對(duì)象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書(shū)。作者聲明：婁艷輝、劉慧、陳云慶參與了研究設(shè)計(jì)；劉慧、戚慧陽(yáng)、孫欣、婁艷輝參與了論文的寫(xiě)作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯耿波）