摘要：【目的】金桔（Fortunella crassifolia Swingle）是全果食用型柑橘，營(yíng)養(yǎng)豐富，且具有藥用價(jià)值。廣西是中國(guó)最大的金桔產(chǎn)區(qū)，但主栽品種滑皮金桔、脆蜜金桔、油桔的果皮高值化利用率不高。本研究擬通過(guò)開(kāi)展金桔成熟果實(shí)果皮提取物對(duì)不同發(fā)育時(shí)段斑馬魚(yú)幼魚(yú)的特異性安全評(píng)價(jià)，為金桔果皮功能性食品開(kāi)發(fā)和副產(chǎn)物高值化利用提供技術(shù)支撐?！痉椒ā恳曰そ鸾郏℉P）、脆蜜金桔（CM）、油桔（YJ）的成熟果實(shí)為研究材料，采用微波提取法獲得其果皮乙醇提取物。利用轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模型[ T_g （fabpla：dsRed；ela3l：GFP）]建立動(dòng)態(tài)發(fā)育毒性評(píng)價(jià)體系，將受精后 48h 、 ^72h 、 96h 、 120h 的斑馬魚(yú)幼魚(yú)分別在不同金桔果皮提取物溶液中處理 48h ，然后通過(guò)計(jì)算斑馬魚(yú)幼魚(yú)的死亡率評(píng)估3種提取物對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)的安全濃度（ 0.1LC₅₀ ）與亞致死濃度（ 0.5LC₅₀ ）。最后整合斑馬魚(yú)體長(zhǎng)、肝臟熒光定量（面積/強(qiáng)度）等多參數(shù)聚類分析評(píng)估3種提取物對(duì)斑馬魚(yú)的毒性效應(yīng)?！窘Y(jié)果】1）3種金桔果皮提取物對(duì)不同發(fā)育時(shí)段斑馬魚(yú)幼魚(yú)的半致死濃度值（ LC₅₀ ）順序分別為：對(duì)于受精后 48h 的幼魚(yú)，以滑皮金桔果皮提取物（ 374μg/mL ） lt; 油桔果皮提取物（ 595μg/mL ）lt;脆蜜金桔果皮提取物中 699μg/mL ）；對(duì)于受精后72h的幼魚(yú)，以滑皮金桔果皮提取物（ 312μg/mL ）lt;油桔果皮提取物 643μg/mL ）lt;脆蜜金桔果皮提取物（ 652μg/mL ）；對(duì)于受精后 96h 的幼魚(yú)，以滑皮金桔果皮提取物（ 340μg/mL ） lt; 油桔果皮提取物（ 755μg/mL ） lt; 脆蜜金桔果皮提取物（ 795μg/ mL）；對(duì)于受精后 120h 的幼魚(yú)，以滑皮金桔果皮提取物（ 597μg/mL ）lt;油桔果皮提取物（787μg/mL ） ∠ 脆蜜金桔果皮提取物（ 926μg/mL ）?？梢?jiàn)，脆蜜金桔果皮提取物綜合安全性最高。2）與對(duì)照相比，3種金桔果皮提取物在安全濃度（ 0.1LC₅₀ ）下對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)無(wú)發(fā)育毒性，體長(zhǎng)無(wú)顯著差異（ Pgt;0.05） ）、肝臟結(jié)構(gòu)正常且無(wú)畸形。3）油桔果皮提取物在亞致死濃度（0.5LC₅₀ ）時(shí)可對(duì)受精后 72h 的斑馬魚(yú)誘發(fā)可逆性肝細(xì)胞水腫，但未見(jiàn)病理?yè)p傷?！窘Y(jié)論】廣西金桔果皮在安全濃度（ [0.1LC₅₀ ）下對(duì)脊椎動(dòng)物發(fā)育無(wú)不良影響，推薦高安全品種脆蜜金桔用于嬰幼兒食品等高敏感產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)。

中圖分類號(hào)：S666.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Analysis of Acute Toxicity of Different Kumquat Peel Extracts on Zebrafish Larvae

DENG XiaoHong，TAN XiaoHui，LONG LingYun，MAO LiYan， HUANG QiuLan，HUANG QiuWei* （Guangxi Subtropical Crops Research Institute/Guangxi Key Laboratory of Quality and Safety Control for Subtropical Fruits，Nanning，Guangxi 53ooo1，China）

Abstract： 【Objective】Fortunella crassifolia Swingle （kumquat） is a citrus fruit that could be eaten wholly，with rich nutrients and medicinal value. Guangxi is the largest kumquat production area in China，but the high-value utilization rate are low for the main kumquat cultivars，Huapi kumquat， Cuimi kumquat and Youju kumquat. This study aimed to evaluate the specific safety of kumquat fruit peel extracts on zebrafish larvae at different developmental stages，so as to provide technical support for the development of functional food and high value utilization of by-products. 【Method】Mature fruits of Huapi kumquat （HP），， Cuimi kumquat （CM），and Youju kumquat （YJ） were used as materials to obtain ethanol extracts from their lyophilized peels using microwave extraction. A developmental toxicity assessment system was established using transgenic zebrafish model [Tg（fabpIa：dsRed;ela3l：GFP）] .Theembryosat48，72，96，and 120h post fertilization （hpf） were exposed to kumquat peel extracts for 48h .The safe concentration （0.1LC₅₀ ）and sublethal concentration（ 0.5LC₅₀ ）ofeach extractweredeterminedbasedon zebrafish fryfatality.The toxicity effects of the three extracts on zebrafish were evaluated by cluster analysis based on multivariate indicators including zebrafish body length and liver fluorescence quantification （area/ intensity）.【Result】1）The orders of median lethal concentrations（ LC₅₀ ）of the 3 kumquat peel extracts on zebrafish larvae at 48h post exposure treatment were as follows： Huapi kumquat peel extract （374μg/mL ） lt; Youju kumquat peel extract （ 595μg/mL ） lt; Cuimi kumquat peel extract （ 699μg/mL ） at48hpf;Huapi kumquat peel extract （ 312μg/mL ） lt; Youju kumquat peel extract （ 643μg/mL）lt; Cuimi kumquat peel extract （ 652μg/mL ）at 72 hpf；Huapi kumquat peel extract （ 340μg/mL）lt; Youju kumquat peel extract （755μg/mL ） ? Cuimi kumquat peel extract 795μg/mL ）at96hpf; Huapi kumquat peel extract （ 597μg/mL ） lt; Youju kumquat peel extract （ 787μg/mL ） lt; Cuimi kumquat peel extract （ 795μg/mL ） at120 hpf. Obviously，the Cuimi kumquat peel extract showed the highest safety.2）Compared with control（CK），at safe concentrations （0.1LC₅₀ ），all the3extracts showed no developmental toxicity，evidenced by unchanged body length （ Pgt;0.05 ）and normal hepatic morphology without deformity.3）The treatment at 0.5LC₅₀ to Youju kumquat peel extract induced reversible hepatocyte edema in the larvae of 72hpf ，but no pathological damage was found.【Conclusion】 Peel of kumquats cultivated in Guangxi has no adverse effects on vertebrate development at scientifically defined safe thresholds （0.1LC₅₀） ），and the highly safe cultivar， Cuimi kumquat，is recommended to be used for developing infant food and other highly sensitive products.

Keywords： Kumquat； peel safety； dependency at developmental stages； zebrafish toxicityassessment；cultivar variation；value-added utilization

0 引言

【研究意義】金桔（FortunellacrassifoliaSwing-le），又名金柑，是蕓香科柑橘屬植物，作為全果食用型柑橘，其果皮富含黃酮類、維生素C等生物活性物質(zhì)（WANGetal.，2008；王治元等，2010；王秀蓉等，2014；李麗等，2015），具有顯著的食藥用價(jià)值。廣西作為全國(guó)最大的金桔產(chǎn)區(qū)（莫星煜等，2021；林益群，2024），隨著滑皮金桔、脆蜜金桔等新品種推廣種植，金桔產(chǎn)量激增，但因缺乏針對(duì)不同栽培品種的系統(tǒng)毒理學(xué)評(píng)價(jià)，導(dǎo)致金桔高值化利用率不高，嚴(yán)重制約了高附加值金桔產(chǎn)品如嬰幼兒食品開(kāi)發(fā)。研究不同金桔品種果皮提取物的毒性可為金桔栽培品種篩選和副產(chǎn)物加工利用開(kāi)發(fā)提供毒理學(xué)理論支撐?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究表明，金桔果皮提取物具有顯著的抗氧化活性，能有效清除2，2-聯(lián)苯基-1-苦基腫基（DPPH）自由基；對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均表現(xiàn)出抑制效果（AL-SAMANetal.，2019）。此外，金桔乙醇提取物通過(guò)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）通路顯著改善高脂膳食誘導(dǎo)的小鼠代謝綜合征，降低血清總膽固醇和肝臟甘油三酯水平（譚颶，2016）。盡管金桔的生物活性研究已經(jīng)較為深入，但其品種間毒理學(xué)差異仍不明晰。在毒理評(píng)價(jià)模型方面，斑馬魚(yú)（Daniorerio）因其胚胎透明、器官發(fā)育保守性與哺乳動(dòng)物高度相似，已成為化合物毒性測(cè)試的重要模式動(dòng)物（ALURUetal.，2013；BAILEYetal.，2013;LIet al.，2020a； TANG et al.，2022；LI et al.，2023a）。其肝臟在功能與結(jié)構(gòu)上具有哺乳動(dòng)物同源性，通過(guò)轉(zhuǎn)基因品系可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)肝臟發(fā)育動(dòng)態(tài)（OBERetal.，2006；WANGetal.，2017）。研究證實(shí)該模型在解析外源物質(zhì)肝毒性機(jī)制方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)（COLLARDetal.，2018；LIetal.，2023b）。【本研究切入點(diǎn)】目前，金桔提取物安全性研究基礎(chǔ)較為薄弱，特別是對(duì)哺乳動(dòng)物的毒性研究較少。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以斑馬魚(yú)肝臟熒光標(biāo)記轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)幼魚(yú)為模式動(dòng)物，探究不同金桔品種果皮提取物安全濃度和亞致死濃度下對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)早期肝臟發(fā)育的影響，為金桔果皮功能性食品開(kāi)發(fā)和副產(chǎn)物高值化利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)材料：供試金桔品種為廣西柳州市融安縣主栽的滑皮金桔（F.crassifolia SwingleHuapi）、脆蜜金桔（F.crassifoliaSwingleCuimi）和油桔（F.crassifoliaSwingleYouju）。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用國(guó)家斑馬魚(yú)資源中心（ChinaZebrafishResourceCenter，CZRC）的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)品系 Tg （fabpla：dsRed;ela3l：GFP），其肝臟組織特異性表達(dá)紅色熒光蛋白（DsRed），胰腺組織表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）。斑馬魚(yú)培養(yǎng)條件：室溫（ 26±0.5 ） °C ，水溫（ 28±0.5 ） °C ， pH7.5 ，電導(dǎo)率 500μS/cm ，光周期 14L ： 10D （光照強(qiáng)度 800lx） ，每天9：00與15：00定量投喂豐年蝦（Artemiasalina）。實(shí)驗(yàn)試劑：無(wú)水乙醇（AR， ?99.7% 、氯化鈣（ CaCl₂ ，AR）、氯化鈉（NaCl，AR）、氯化鉀（KCI，AR）、硫酸鎂（ MgSO₄ ，AR）、三卡因（tricainemethanesulfonate）及甲基纖維素（metho-celA4M），均購(gòu)自南寧市因信科技產(chǎn)品經(jīng)營(yíng)部；斑馬魚(yú)胚胎培養(yǎng)液（內(nèi)含0.4mmol/L CaCl₂ 、5mmol/LNaCl、0.17mmol/LKCl、 0.16mmol/L MgSO₄ ，用純水配制）。

1.2 主要儀器

MCR-3S常壓微波反應(yīng)萃取儀（鄭州市亞榮儀器有限公司）；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；斑馬魚(yú)養(yǎng)殖系統(tǒng)（上海海圣生物實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；SZ680體視顯微鏡（重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司）；MF31-M熒光生物顯微鏡（廣州明美光電技術(shù)有限公司）；LRH-250-S恒溫恒濕光照培養(yǎng)箱（廣東泰宏君科學(xué)儀器股份有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 金桔材料預(yù)處理

成熟金桔果實(shí)經(jīng)自來(lái)水清洗干凈后，將金桔果實(shí)沿赤道面橫切為兩半，使用無(wú)菌解剖匙沿切面的皮肉交界處旋轉(zhuǎn)一圈將果皮和果肉分離。所得果皮組織經(jīng)自來(lái)水清洗去除表面雜質(zhì)，按料液比1：6（g：mL）的比例加入（ 70±2 ） ^°C 超純水，并置于滅菌鍋中進(jìn)行蒸氣熱處理（ 70^°C ， ^1h ，常壓），之后將果皮撈出置于自來(lái)水中搓洗去除殘余果肉，果皮清洗后置于（ 60±1 ） ^°C 烘箱中干燥 8h 經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過(guò)20目篩?；そ鸾郏℉P）、脆蜜金桔（CM）果皮粉末按1：2（ g：mL 、油桔（YJ）果皮粉末按1：6（ g：mL ）加入石油醚，室溫靜置提取 24h 以脫去大部分脂肪，抽濾后將濾渣進(jìn)行二次干燥（ 60^°C ， ^4h ，常壓），獲得脫脂果皮粉末。

1.3.2 不同金桔果皮提取物提取與提取液配制

稱取 45.0g 脫脂果皮粉末，按照1：20（ g：mL ）的料液比加入 50% （v/v）乙醇溶液，于微波反應(yīng)儀中進(jìn)行動(dòng)態(tài)回流工（ 80±1 ） °C ， 30min. 后趁熱抽濾，濾液靜置冷卻析出果膠雜質(zhì)，將液體于 10000r/min 轉(zhuǎn)速下常溫離心 10min ，收集上清液進(jìn)行抽濾，獲得粗提取液。提取液經(jīng)真空濃縮至可溶性固形物含量為 10% 左右，最后將濃縮液冷凍干燥研磨后獲得果皮提取物凍干粉。分別準(zhǔn)確稱取HP果皮提取物凍干粉末（ 2.20g? 、CM果皮提取物凍干粉末（ 5.04g） 、YJ果皮提取物凍干粉末 （4.12g） ，置于 100mL 燒杯中，每種提取物粉末均加入 20mL 純水超聲溶解，記錄不同金桔品種果皮提取物溶液的初始濃度（HP： 110mg/mL ; CM：252mg/mL ；YJ： 206mg/mL） 。吸取一定體積的提取物配制成工作母液（ 10mg/mL ）， 4^°C 備用。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

用定時(shí)交配法獲取斑馬魚(yú)同步化胚胎，于實(shí)驗(yàn)前一日16：00將性成熟斑馬魚(yú)按雌雄比1：1分置于配種缸（配種隔離板分隔），次日9：00移除隔離板誘導(dǎo)產(chǎn)卵。受精卵于16：00收集后，經(jīng)體視顯微鏡篩選正常發(fā)育胚胎，置于含胚胎培養(yǎng)液（配方見(jiàn)1.1）的玻璃培養(yǎng)皿中，恒溫培養(yǎng)箱[（ 28±0.5） 0 °C ，光周期 14L ：10D］內(nèi)孵化至目標(biāo)發(fā)育時(shí)段。基于預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)立以下處理組：（1）空白對(duì)照組（CK）：胚胎培養(yǎng)液 （0μg/mL） （2）HP果皮提取物處理組：50、100、150、250、350、600、800、 1000μg/mL 梯度濃度；（3）CM果皮提取物處理組：100、200、300、400、600、800、 1000μg/mL 梯度濃度；（4）YJ果皮提取物處理組：100、200、300、400、600、800、 1000μg/ mL梯度濃度。各濃度組溶液采用胚胎培養(yǎng)液梯度稀釋提取物溶液（HP果皮提取物 110mg/mL 、CM果皮提取物 252mg/mL 、YJ果皮提取物 206mg/ mL）制備。取48、72、96、120hpf（受精后小時(shí)數(shù)hourspost fertilization，hpf）健康幼魚(yú)，隨機(jī)分配至24孔板（10尾/孔），每處理組設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。金桔果皮提取物體積2mL/孔，于 28^°C 恒溫培養(yǎng)箱處理 48h 。

1.3.4不同金桔果皮提取物處理對(duì)斑馬魚(yú)急性毒性效應(yīng)評(píng)估

取胚胎發(fā)育48、72、96、120hpf這4個(gè)時(shí)段的幼魚(yú)按照1.3.3的方法處理48h后，分別統(tǒng)計(jì)各處理組幼魚(yú)的死亡率（死亡判定標(biāo)準(zhǔn)：體色變白、心搏停止且觸碰無(wú)逃避反應(yīng)），并通過(guò)處理濃度梯度和相對(duì)應(yīng)死亡率進(jìn)行非線性曲線擬合求出果皮提取物處理48h致半數(shù)斑馬魚(yú)死亡的濃度值（ LC₅₀ ）（冉凱凱等，2022）。

1.3.5不同金桔果皮提取物處理對(duì)斑馬魚(yú)體長(zhǎng)發(fā)育評(píng)估

基于處理48h半致死濃度（ LC₅₀ ）測(cè)定結(jié)果，設(shè)置空白對(duì)照組（CK，胚胎培養(yǎng)液）及2個(gè)濃度處理組（安全濃度組： 0.1LC₅₀ ；亞致死濃度組：0.5LC₅₀ ）。按照1.3.3的方法，對(duì)48、72、96、120hpf4個(gè)發(fā)育時(shí)段的幼魚(yú)分別進(jìn)行48h連續(xù)處理后，每組隨機(jī)選取10尾健康幼魚(yú)進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。樣本處理流程如下：將經(jīng)過(guò)提取物溶液處理的幼魚(yú)浸入 0.1% 的三卡因溶液麻醉30s后迅速轉(zhuǎn)移至載玻片上，用濾紙吸干魚(yú)周圍多余液體，馬上滴 0.5mL 2.5% 甲基纖維素溶液形成透明凝膠層固定魚(yú)體，將載玻片置于體視顯微鏡載物臺(tái)上，調(diào)整顯微鏡焦距和魚(yú)體位置至可以觀察到清晰且完整的魚(yú)體側(cè)位并拍照。測(cè)量處理48h的幼魚(yú)體長(zhǎng)（從吻端沿魚(yú)體背中線至尾鰭末端的長(zhǎng)度）。

1.3.6 不同金桔果皮提取物處理的斑馬魚(yú)肝臟觀察

實(shí)驗(yàn)濃度設(shè)置與體長(zhǎng)發(fā)育評(píng)估體系一致，每組隨機(jī)選取10尾幼魚(yú)進(jìn)行肝臟原位熒光檢測(cè)。用0.1% 的三卡因溶液輕微麻醉幼魚(yú)，再用 0.5mL 2.5% 甲基纖維素溶液將斑馬魚(yú)固定于載玻片上，然后將載玻片置于熒光生物顯微鏡載物臺(tái)上，調(diào)整顯微鏡焦距、熒光光源和魚(yú)體位置至可以觀察到清晰肝臟熒光（DsRed通道，Ex/Em： 558/583nm ）的魚(yú)體側(cè)位并拍照。使用ImageJ閾值分析模塊分割肝臟熒光區(qū)域，計(jì)算單位面積熒光強(qiáng)度及熒光投影面積，評(píng)估不同金桔果皮提取物對(duì)斑馬魚(yú)肝臟發(fā)育的影響。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

毒理參數(shù)計(jì)算：采用OriginPro2024b軟件進(jìn)行非線性曲線擬合，計(jì)算各發(fā)育時(shí)段LC ₅₀ 值。生物指標(biāo)統(tǒng)計(jì)：應(yīng)用SPSS19.0進(jìn)行單因素方差分析（One-wayANOVA），組間差異采用Tukey'sHSD檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示。圖像處理：體長(zhǎng)指標(biāo)和熒光指標(biāo)的測(cè)量通過(guò)ImageJ軟件來(lái)計(jì)算；其余作圖通過(guò)OriginPro2024來(lái)繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1不同金桔果皮提取物對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)的毒性效應(yīng)

如圖1所示，斑馬魚(yú)幼魚(yú)在不同發(fā)育時(shí)段對(duì)金桔果皮提取物的毒性響應(yīng)差異顯著。當(dāng)處理濃度?250μg/mL HP果皮提取物、 ?600μg/mL CM果皮提取物和 ?400upmug/mL YJ果皮提取物時(shí)，48、96、120hpf幼魚(yú)均未觀測(cè)到致死效應(yīng)，其濃度一死亡率效應(yīng)曲線在此閾值前完全重合（ R²=0.999 。超過(guò)臨界濃度后，各發(fā)育時(shí)段效應(yīng)曲線出現(xiàn)顯著分離（圖1）。值得注意的是，72hpf幼魚(yú)對(duì)金桔果皮提取物表現(xiàn)出更高的敏感性，HP果皮提取物濃度?150μg/mL 、CM果皮提取物與YJ果皮提取物濃度?300μg/mL 時(shí)即表現(xiàn)出致死效應(yīng)。該時(shí)段的濃度一死亡率效應(yīng)曲線擬合度相對(duì)降低，部分?jǐn)?shù)據(jù)點(diǎn)偏離理論曲線（HP果皮提取物 R²=0.998 ，CM果皮提取物 R²=0.998 ，YJ果皮提取物 R²=0.999 ），提示此發(fā)育時(shí)段可能存在非線性毒性動(dòng)力學(xué)特征。通過(guò)擬合曲線求出3個(gè)金桔品種果皮提取物對(duì)4個(gè)發(fā)育時(shí)段的處理48h的半致死濃度（ LC₅₀ ）（見(jiàn)表1）順序分別為：對(duì)于48hpf的幼魚(yú)，以HP果皮提取物（204 （374μg/mL ） Φ

2.2不同金桔果皮提取物對(duì)斑馬魚(yú)形態(tài)發(fā)育的影響

基于處理48h的半致死濃度（ LC₅₀ ）的濃度一死亡率效應(yīng)關(guān)系，本研究設(shè)定 0.1LC₅₀ （安全濃度）和 0.5LC₅₀ （亞致死濃度）2個(gè)處理劑量（表1）進(jìn)行形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)。

形態(tài)學(xué)觀察顯示（圖2），在 0.1LC₅₀ 和 0.5LC₅₀ 濃度下，3個(gè)品種金桔果皮提取物處理48h均未引起48～120hpf斑馬魚(yú)幼魚(yú)顯著畸形表型。所有處理組幼魚(yú)均保持完整的腦室結(jié)構(gòu)、正常心包形態(tài)（未見(jiàn)心包水腫）、線性脊柱發(fā)育及功能性魚(yú)，表明在本實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)果皮提取物未造成器官發(fā)育毒性。體長(zhǎng)測(cè)量數(shù)據(jù)（圖3）進(jìn)一步揭示劑量依賴性效應(yīng)：（1）安全濃度組（ ?0.1LC₅₀? ，各發(fā)育時(shí)段（48、72、96、 120hpf） 斑馬魚(yú)體長(zhǎng)與對(duì)照組（CK）無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（ （Pgt;0.05） ，提示該濃度

下果皮提取物對(duì)幼魚(yú)生長(zhǎng)速率無(wú)顯著抑制。（2）亞致死濃度組（ 0.5LC₅₀"）中，HP果皮提取物處理在所有發(fā)育時(shí)段的體長(zhǎng)與CK組相比均未達(dá)到顯著差異（ （Pgt;0.05） ；CM果皮提取物處理時(shí)， 48hpf 與72hpf幼魚(yú)體長(zhǎng)顯著低于CK組（ ?Plt;0.05） ，而96、120hpf階段未檢測(cè)到生長(zhǎng)抑制；YJ果皮提取物處理時(shí)，48hpf幼魚(yú)體長(zhǎng)較CK組降低（ ?Plt; 0.05），而120hpf階段出現(xiàn)反常增長(zhǎng)，72、96hpf階段無(wú)顯著變化。上述結(jié)果表明，HP果皮提取物在0.5LC₅₀"劑量下未表現(xiàn)發(fā)育毒性，而CM果皮提取物和YJ果皮提取物則分別對(duì)早期（48、72hpf）和特定發(fā)育節(jié)點(diǎn)（48、120hpf）的斑馬魚(yú)體長(zhǎng)產(chǎn)生顯著影響，提示品種特異性毒性效應(yīng)可能與發(fā)育時(shí)段敏感性相關(guān)。

2.3不同金桔果皮提取物對(duì)斑馬魚(yú)肝臟發(fā)育的影響

2.3.1 肝臟形態(tài)學(xué)定量分析

為了探究不同金桔果皮提取物對(duì)斑馬魚(yú)肝臟發(fā)育的影響，利用 Tg （fabpla：dsRed;ela3l：GFP）魚(yú)系開(kāi)展了3種金桔果皮提取物對(duì)斑馬魚(yú)肝臟發(fā)育毒性的研究。通過(guò)肝臟形態(tài)學(xué)觀察（圖4）與熒光面積對(duì)比（圖5）發(fā)現(xiàn)，HP與CM果皮提取物在 0.1～0.5LC₅₀ 濃度內(nèi)，對(duì)48～120hpf幼魚(yú)肝臟面積無(wú)顯著影響（ Pgt;0.05） 。YJ果皮提取物用于處理72hpf幼魚(yú)時(shí)， 0.1LC₅₀ 與 0.5LC₅₀ 濃度使肝臟面積增加。所有處理組幼魚(yú)肝臟均保持正常解剖結(jié)構(gòu)，未出現(xiàn)形態(tài)畸變或異位增生（圖4）。胰腺綠色熒光空間分布與對(duì)照組一致，表明提取物處理未引發(fā)肝臟一胰腺的發(fā)育紊亂。值得注意的是，YJ果皮提取物 0.5LC₅₀ 處理72hpf幼魚(yú)時(shí)，肝臟體積增大伴隨肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞排列疏松，提示可能存在可逆性肝細(xì)胞水腫。

2.3.2不同金桔果皮提取物對(duì)斑馬魚(yú)肝臟熒光強(qiáng)度的影響

基于熒光強(qiáng)度密度分析（熒光總強(qiáng)度/熒光面積），不同品種金桔果皮提取物對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)肝細(xì)胞分布密度呈現(xiàn)發(fā)育時(shí)段特異性影響（圖6）。在72～120hpf發(fā)育時(shí)段，CM與YJ的果皮提取物處理組（ 0.1LC₅₀ ， 0.5LC₅₀ ）幼魚(yú)的肝臟熒光強(qiáng)度與對(duì)照組（CK）無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （Pgt;0.05） 。值得注意的是，HP果皮提取物處理72hpf幼魚(yú)時(shí)，熒光強(qiáng)度較CK組顯著升高（ ?Plt;0.05） ，但在后續(xù)發(fā)育時(shí)段（204號(hào) （96～120hpf） 未觀察到顯著改變。對(duì)48hpf早期幼魚(yú)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HP與YJ的果皮提取物處理組呈現(xiàn)劑量依賴性雙相效應(yīng)： 0.1LC₅₀ 濃度下熒光強(qiáng)度較CK組分別升高 23.5% 和 17.2% （ Plt;0.05） ，而0.5LC₅₀ 濃度時(shí)回落至基線水平（ Pgt;0.05） 。CM果皮提取物則顯示濃度正相關(guān)效應(yīng)， 0.5LC₅₀ 處理組熒光強(qiáng)度較CK組顯著增加（ Plt;0.05， 。此現(xiàn)象提示金桔提取物可能影響早期發(fā)育時(shí)段肝的細(xì)胞增殖。

2.4多參數(shù)聚類分析

基于安全濃度（ 0.1LC₅₀ ）處理48h后，對(duì)4個(gè)發(fā)育時(shí)段（ 48～120hpf） 斑馬魚(yú)幼魚(yú)的體長(zhǎng)及肝臟熒光參數(shù)（強(qiáng)度與面積）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，以對(duì)照組（CK）數(shù)據(jù)為基準(zhǔn)（設(shè)定相對(duì)值 _?=1.000 ，采用歐氏距離（euclideandistance）構(gòu)建層次聚類熱圖（圖7）。如圖7所示，可將4個(gè)發(fā)育時(shí)段斑馬魚(yú)按3種果皮提取物處理48h的安全濃度和CK分成4類，其中CK組幼魚(yú)和3種果皮提取物處理 120hpf 幼魚(yú)歸為一類；CM果皮提取物處理48hpf幼魚(yú)和HP果皮提取物處理72hpf幼魚(yú)歸為一類；CM和YJ的果皮提取物處理72hpf幼魚(yú)和3種金桔果皮提取物處理96hpf幼魚(yú)歸為一類；HP和YJ的果皮提取物處理48hpf幼魚(yú)歸為一類。由分類結(jié)果來(lái)看，在3種金桔果皮提取物安全濃度48h處理下，96hpf和120hpf幼魚(yú)同一個(gè)發(fā)育期的魚(yú)都能聚在同一類，且處理后 120hp f幼魚(yú)與CK組幼魚(yú)能聚為一類，表明安全濃度下金桔果皮提取物48h處理對(duì)120hpf幼魚(yú)影響最??；而48hpf和72hpf這些發(fā)育前期的幼魚(yú)會(huì)因果皮提取物不同而分散，同一發(fā)育時(shí)段的魚(yú)不能聚在同一類。從與CK組聚類距離來(lái)判別，3種金桔果皮提取物48h的 0.1LC₅₀ 處理對(duì)同一發(fā)育時(shí)段幼魚(yú)體長(zhǎng)和肝臟發(fā)育影響強(qiáng)弱，依次為48hpf幼魚(yú)（YJ果皮提取物 gt;HP 果皮提取物 gt;CM 果皮提取物）、72hpf幼魚(yú)（YJ果皮提取物 gt;CM 果皮提取物 HP果皮提取物）、96hpf幼魚(yú)（CM果皮提取物gt;YJ果皮提取物gt;HP果皮提取物）、 120hpf （YJ果皮提取物gt;CM果皮提取物gt;HP果皮提取物）。

3 討論

3.1金桔果皮提取物毒性效應(yīng)的種質(zhì)特異性

柑橘屬的水果被認(rèn)為是生物活性化合物如維生素、類胡蘿卜素、纖維和酚類化合物等的健康來(lái)源（BOCCOetal.，1998；GORINSTEINetal.，2001；YANGetal.，2011），但對(duì)金桔類果實(shí)果皮提取物的安全性研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究首次系統(tǒng)揭示了滑皮金桔（HP）、脆蜜金桔（CM）、油桔（YJ）3個(gè)金桔品種果皮提取物對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)的急性毒性差異，其 LC₅₀ 值排序?yàn)椋篐P果皮提取物

3.2不同發(fā)育時(shí)段斑馬魚(yú)幼魚(yú)的毒性響應(yīng)機(jī)制

本研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)幼魚(yú)對(duì)金桔果皮提取物的敏感性存在顯著發(fā)育時(shí)段差異。72hpf幼魚(yú)在較低濃度處理下即出現(xiàn)死亡率升高。72hpf屬于斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育的孵化期，此時(shí)胚胎開(kāi)始突破卵膜進(jìn)入自由游動(dòng)階段，卵膜原本對(duì)胚胎具有物理保護(hù)作用，但孵化后幼魚(yú)直接暴露于提取物，導(dǎo)致防御屏障消失（KIMMELetal.，1995），可能是此階段較低濃度提取物即可引起幼魚(yú)死亡的原因。值得注意的是，120hpf幼魚(yú)在 0.5LC₅₀ 濃度處理下呈現(xiàn)體長(zhǎng)顯著增加，可能是因?yàn)殡S著孵化后幼魚(yú)經(jīng)過(guò)48h 的環(huán)境適應(yīng)后對(duì)金桔果皮提取物的耐受性增強(qiáng)的緣故。

3.3 肝臟發(fā)育的生物標(biāo)志物響應(yīng)

肝臟是許多外源物質(zhì)毒害作用的重要靶器官（KENNON-MCGILLandMCGILL，2017；LIetal.，2020b ；LIUetal.，2023）。肝臟熒光標(biāo)記轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)品系，可以直觀地在熒光顯微鏡下觀察到外源物質(zhì)暴露下fabpla基因在肝臟表達(dá)的部位和表達(dá)量，從而表征肝臟可能的尺寸變化，以評(píng)估外源物質(zhì)對(duì)斑馬魚(yú)的肝臟毒性（LIetal.，2023a；XIAetal.，2020；李秋熳等，2025）。本研究利用轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模型首次揭示了金桔果皮提取物對(duì)幼魚(yú)肝臟發(fā)育的階段性影響。安全濃度（ 0.1LC₅₀ ）下48hpf呦魚(yú)肝臟熒光強(qiáng)度顯著升高，提示果皮提取物中的特定成分可能通過(guò)激活肝細(xì)胞增殖相關(guān)通路促進(jìn)肝臟發(fā)育（OBERetal.，2006）。其熒光面積未發(fā)生顯著改變且肝臟形態(tài)正常，表明該效應(yīng)屬于生理性調(diào)節(jié)而非病理性改變。

3.4安全性評(píng)價(jià)的系統(tǒng)性啟示

本研究構(gòu)建的多參數(shù)毒性評(píng)價(jià)體系表明，傳統(tǒng)LC5指標(biāo)需結(jié)合器官特異性生物標(biāo)志物進(jìn)行綜合解析。聚類分析顯示YJ提取物在安全濃度下對(duì)早期發(fā)育時(shí)段（48～72hpf）幼魚(yú)的影響最為顯著，提示金桔食用安全評(píng)估應(yīng)特別關(guān)注胚胎期及幼體期的暴露風(fēng)險(xiǎn)。盡管當(dāng)前研究未檢測(cè)具體毒性成分，但急性毒性強(qiáng)度與果皮脫脂工藝殘留脂溶性物質(zhì)的相關(guān)性值得深入探究。

4結(jié)論

本研究通過(guò)系統(tǒng)評(píng)價(jià)HP果皮提取物、CM果皮提取物、YJ果皮提取物對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)的急性毒性效應(yīng)，首次揭示了金桔品種特異性毒性強(qiáng)弱規(guī)律（HP果皮提取物 gt;YJ 果皮提取物gt;CM果皮提取物）及不同金桔果皮提取物處理下斑馬魚(yú)不同發(fā)育時(shí)段的差異特征。實(shí)驗(yàn)表明，72hpf幼魚(yú)對(duì)毒性響應(yīng)最為敏感，安全濃度（ 0.1LC₅₀ ）下金桔果皮提取物雖未顯著抑制幼魚(yú)體長(zhǎng)發(fā)育，但油桔提取物可特異性誘導(dǎo)早期發(fā)育時(shí)段（48hpf）幼魚(yú)肝臟細(xì)胞增殖。研究結(jié)果為金桔果皮食用安全評(píng)估提供了關(guān)鍵毒理學(xué)數(shù)據(jù)，后續(xù)研究將結(jié)合成分組學(xué)解析毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)，并針對(duì)敏感發(fā)育期建立差異化安全閾值標(biāo)準(zhǔn)。

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（責(zé)任編輯 謝紅輝）