Application of Recombinase-Mediated Nucleic Acid Amplification Technology for Detecting of Vibrio parahaemolyticus in Aquatic Products

ZHANG Xiaoyan12， XU Qiusheng12，LIU Jun12， XU Yemei12， SHEN Wei2* （1.Pinghu Food and Drug Testing Center， Jiaxing ， China; 2.Pinghu Product Quality Supervision and Inspection Institute， Jiaxing ， China）

Abstract： Vibrio parahaemolyticus is the main pathogen causing foodborneilness，and itisof great significance to establish arapid and accurate detection technology to prevent food poisoning causedby Vibrio parahaemolyticus. In this study，a highly effcient detection method for Vibrio parahaemolyticus was established basedonrecombinaseaided amplification （RAA）.By comparing the sensitivity and specificity of the traditional culture method with the RAA technique，and optimizing the experimental parameters，the applicability of the RAA method in the detection of Vibrio parahaemolyticus was verified.The results show that RAA technology can directly detect the sample，and the results can be obtained in only ^2h to ^3h .For the low bacterial volume samples， the total detection time could be controlled within 10h after 6h to 8h of bacterial enhancement pretreatment， which significantly shortened the detection time. The established RAA detection method has high specificity （ 100% ）and sensitivity，and is suitable for the on-site rapid detection of Vibrio parahaemolyticus in aquatic products and other foods.

Keywords： Vibrio parahaemolyticus; recombinase-aided amplification; quick detection

副溶血性弧菌（Vibrioparahemolyticus）作為一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，其隸屬于變形菌門弧菌科弧菌屬，主要定殖于近海水體、港口及咸淡水交匯區(qū)域[]。該病原體具有雙重致病特性：通過污染海產(chǎn)品引發(fā)人類急性胃腸炎、腹瀉、創(chuàng)傷感染及敗血癥等食源性疾病[；可感染魚、蝦、蟹等甲殼類及貝類水產(chǎn)動物，嚴重威脅水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[3]。流行病學數(shù)據(jù)顯示，副溶血性弧菌已連續(xù)多年位列我國食源性疾病病原體首位，其中沿海地區(qū)由其引發(fā)的食源性中毒事件占比在 50%～70% ，公共衛(wèi)生影響顯著[4-5]。

現(xiàn)行副溶血性弧菌檢測方法為《食品安全國家標準食品微生物學檢驗副溶血性弧菌檢驗》（GB4789.7—2013）。該傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定法雖特異性良好，但存在操作煩瑣、周期冗長（5～7個工作日）等局限性?！哆M出口食品中副溶血性弧菌快速及鑒定檢測方法實時熒光PCR法》（SN/T2424—2010）[，雖將檢測周期縮短至 24h ，但仍受限于精密儀器配置、專業(yè)操作人員及高昂檢測成本，難以滿足基層現(xiàn)場的快速檢測需求。

新型重組酶介導鏈置換核酸擴增技術（Recombinase-AidAmplification，RAA）突破傳統(tǒng)溫控限制，其核心機制在于重組酶-引物復合物的動態(tài)作用：重組酶與特異性引物結合形成穩(wěn)定復合物，通過靶向性掃描識別模板DNA同源序列，在單鏈DNA結合蛋白協(xié)同下解旋雙鏈結構，最終在DNA聚合酶催化下完成指數(shù)級核酸擴增。結合熒光探針標記技術，可在恒溫條件下實現(xiàn) 5～15min 的快速檢測，并同步完成定量分析[。該技術兼具操作簡便、設備普適性強等優(yōu)勢，可為現(xiàn)場即時檢測提供創(chuàng)新解決方案。

1材料和方法

1.1材料、試劑與儀器

1.1.1 儀器與設備

GENCHEK熒光檢測儀（杭州眾測生物科技有限公司）；PCR專用離心機；金屬??；SHP-250D生化培養(yǎng)箱（上海森信實驗儀器有限公司）；DK-S12恒溫水浴鍋（上海森信實驗儀器有限公司）。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑

3% 氯化鈉堿性蛋白脈水、TCBS選擇性瓊脂及營養(yǎng)瓊脂（青島海博生物科技有限公司）；DNA快速提取試劑（杭州眾測生物科技有限公司）、RAA檢測試劑盒（杭州眾測生物科技有限公司）。

1.1.3 菌株來源

副溶血性弧菌（ATCC17802）、鼠傷寒沙門菌（ATCC14028）、福氏志賀菌（CMCC51572）、大腸埃希氏菌（ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、單增李斯特菌（ATCC19114），均購自青島海博生物科技有限公司標準菌種庫，復蘇后經(jīng)VITEK2Compact全自動微生物鑒定系統(tǒng)確認種屬純度。

1.1.4樣品來源

于2020年6—8月采集平湖市當湖街道農貿市場不同攤位各類水產(chǎn)品樣品50份。

1.2 方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)

選取副溶血性弧菌、鼠傷寒沙門氏菌、福氏志賀菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌等6種標準菌株，分別接種于相應選擇性液體培養(yǎng)基中進行活化增殖。完成復蘇后，采用四區(qū)劃線法將各菌液分別轉移至專屬鑒別培養(yǎng)基平板，置于 36°C 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 18～24h 。隨后選取典型形態(tài)菌落進行二次劃線純化，在營養(yǎng)瓊脂平板上進行 24h 單菌落分離培養(yǎng)，獲得純化菌株備用。

1.2.2 菌落計數(shù)

針對副溶血性弧菌ATCC17802的 24h 純培養(yǎng)物，采用麥氏比濁法（0.5McFarland標準）配制初始菌懸液，通過連續(xù)10倍系列稀釋制備 10^-1 至 10^-7 梯度稀釋液。選取 10^-4 、 10^-5 、 10^-6 、 10^-74 個稀釋梯度，每個梯度設置雙平行樣，各取 1mL 菌液傾注于固體培養(yǎng)基平板。經(jīng) 36^°C 恒溫培養(yǎng) 48h ，觀察到 10^-5 、10^-6 、 10^-73 個稀釋梯度形成可計數(shù)的離散菌落。通過統(tǒng)計學分析確定 10^-6 稀釋度（雙平板平均菌落數(shù)62個）為最佳計數(shù)區(qū)間，計算得出的原始菌液濃度為 6.2×10⁶CFU?mL^-1 。所有梯度稀釋樣品經(jīng)標準化處理后于 4^°C 冷藏待用。

1.2.3 模板DNA制備

根據(jù)DNA快速提取試劑盒說明書提取DNA，吸取 1mL 樣品培養(yǎng)物，放人裝有 0.5mL Lysis Buffer的試劑管中，蓋緊試劑管蓋， 70% （金屬?。┘訜?0min （加熱過程中每隔 2～3min 用手輕彈混勻），加熱后冷卻室溫，離心 1～2min ，上清液即為DNA模板。根據(jù)此方法進行樣品DNA提取，并置于-20^qC 冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4RAA檢測

根據(jù)副溶血性弧菌分子檢測試劑（RAA-熒光型）使用說明書進行樣本檢測。 ① 向裝有干粉酶制劑的檢測單元管中加入 45.5μL 的Buffer A 。 ② 向檢測單元管中加入 2.0μL 按1.2.3項方法處理得到的待測DNA、陽性對照或陰性對照。 ③ 向單元管加入2.5μL BufferB，蓋上管蓋，上下顛倒混勻 5～6 次，低速離心 10s 。 ④ 將檢測單元管放人GENCHEK熒光檢測儀中，選擇“RAA”檢測程序，開始檢測，20min 后自動判定檢測結果。

結果判定方法。 ① 陽性對照。有典型的擴增曲線出現(xiàn)，出峰時間 ?15min ，為有效結果。 ② 陰性對照：無擴增曲線出現(xiàn)，或出峰時間 ?20min ，為有效結果。 ③ 檢測樣本：若出峰時間 ?17.5min ，可判斷為陽性；若 17.5minlt; 出峰時間 lt;20min ，則需重復檢測確認。

1.2.5 特異性試驗

將副溶血性弧菌、鼠傷寒沙門氏菌、福氏志賀菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌等6種標準菌株按照1.2.3項方法處理并提取DNA，再按照1.2.4項方法進行RAA檢測，對RAA檢測副溶血性弧菌特異性進行評價。

1.2.6 靈敏度試驗

采用連續(xù)10倍系列稀釋法開展實驗，評估RAA檢測體系的靈敏度。以副溶血性弧菌標準菌株為對象，制備濃度梯度為 10^-1 至 10^-7 的菌懸液。隨后，按照1.2.3項方法對各濃度菌懸液進行基因組DNA提取，并進行RAA擴增分析，以此確定該檢測方法的檢測下限。同時，設置傳統(tǒng)培養(yǎng)法作為平行對照實驗，將相同濃度梯度的稀釋液采用四區(qū)劃線法接種至TCBS選擇性培養(yǎng)基，在 36^°C 恒溫條件下培養(yǎng)24h 后，記錄最小可見菌落形成單位。

2 結果與分析

2.1特異性試驗結果

采用熒光型RAA檢測體系對6種標準菌株（副溶血性弧菌、鼠傷寒沙門氏菌等）進行交叉驗證。實時監(jiān)測結果顯示，僅副溶血性弧菌樣本呈現(xiàn)典型S型擴增曲線（熒光信號增長值 gt;40 000 ），其余菌株的終點熒光值均 lt;500 （判定閾值10000），表明該體系具有高度特異性（ 100% ）。檢測結果詳見圖1。

2.2 靈敏度試驗結果

借助瓊脂平板計數(shù)法，測得副溶血性弧菌原菌液的細菌濃度為 6.2×10⁷CFU?mL^-1 。采用RAA方法，對經(jīng)過系列10倍梯度稀釋的副溶血性弧菌標準菌株進行檢測。檢測結果顯示，RAA法在 10^-4～10^-1 的稀釋度范圍內均能夠有效地檢出副溶血性弧菌，且陽性反應時間會隨著菌液濃度的降低而逐漸延長。經(jīng)計算，該檢測方法對副溶血性弧菌的靈敏度達 6.2×10³ CFU mL^-1 。相關檢測結果如圖2所示。而采用傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)法進行檢測時，其靈敏度為6.2×10⁴CFU?mL^-1 。對比兩種檢測方法的敏感度可知，RAA法的靈敏度較傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)法更高，具體數(shù)據(jù)見表1。

2.3 方法優(yōu)化

RAA產(chǎn)品說明書要求前增菌時間參考國家標準細菌培養(yǎng)方法進行操作，但檢測副溶血性弧菌前增菌所需時間較長，為了優(yōu)化培養(yǎng)時間，本文將人工模擬樣品，精確稱取經(jīng)檢測確認副溶血性弧菌呈陰性的蝦肉餡樣品，每份 25g ，共準備4份。分別取 1mL 10^-4 、 10^-5 、 10^-6 ！ 10^-7 的副溶血性弧菌菌懸液，加入4份蝦肉餡中（編號A1、A2、A3、A4），并充分混合均勻。此時，4份人工染菌蝦肉餡樣品的染菌量依次為 6.2×10³ 、 6.2×10² 、 6.2×10¹ ！ 6.2×10⁰CFU/25g 。

隨后，將4份人工染菌的蝦肉餡樣品按照 1：10 加入含有 3.0% 氯化鈉的堿性蛋白肺水增菌液中。分別在增菌前以及在 36^°C 條件下培養(yǎng)2、4、6、8h后，依照1.2.3項方法提取DNA，并進行RAA檢測。通過比較樣品從培養(yǎng)前到培養(yǎng) 8h 期間RAA檢測結果的變化情況，分析不同培養(yǎng)時間對檢測結果的影響。檢測結果顯示，在增菌 2h 后可以檢出 10² 數(shù)量級的染菌量，增菌 ^4h 后可檢出 10¹ 數(shù)量級的染菌量，增菌 6h 后可檢測到 lt;10CFU/25g 的樣本，詳見表2。

按照優(yōu)化的前增菌培養(yǎng)時間，采用RAA法檢測流通環(huán)節(jié)收集的50批次水產(chǎn)品樣品中的副溶血性弧菌檢測，同時用傳統(tǒng)方法（GB4789.7—2013）進行對照。結果表明，傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)方法共檢出副溶血性弧菌陽性樣本9份（ 18.0% ），RAA法檢出副溶血性弧菌陽性樣本9份（ 18.0% ）。采用傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)方法檢出陽性的樣品在RAA法檢測中均為陽性，兩者陽性符合率達 100.0% ，未出現(xiàn)假陽性和漏檢的情況。

3結論與討論

本研究通過系統(tǒng)比較RAA與傳統(tǒng)培養(yǎng)法的檢測效能，揭示RAA技術在副溶血性弧菌檢測中的顯著應用優(yōu)勢，具體體現(xiàn)在以下方面。 ① 特異性優(yōu)勢?；诟比苎曰【禺愋曰蛟O計的引物-探針組合，通過雙重特異性保障實現(xiàn)對目標菌株的精準識別。50份臨床樣本的平行檢測結果顯示，該方法與傳統(tǒng)培養(yǎng)法陽性樣本的符合率達 100% ，且與其他常見致病菌無交叉反應，表明其特異性極高。 ② 靈敏度優(yōu)勢。定量分析表明，RAA檢測靈敏度較傳統(tǒng)培養(yǎng)法提升一個數(shù)量級。結合優(yōu)化的前增菌方案（ （6～8h ），可穩(wěn)定檢測 lt;10CFU/25g 的低載量樣本，有效提升了微量病原體檢出能力。 ③ 檢測時效性。傳統(tǒng)檢測方法包括培養(yǎng)基制備、增菌培養(yǎng)（ 24～48h ）、生化鑒定等多步驟，耗時 5～7d. 。RAA技術通過整合核酸擴增與實時檢測，實現(xiàn) 2～3h 快速檢測；對低菌量樣本采用6h前增菌聯(lián)用方案，總耗時可控制在 ^10h 內。 ④ 操作安全與自動化。密閉式全自動檢測體系可有效規(guī)避氣溶膠污染風險，集成化設備可實現(xiàn)“擴增－檢測-分析流程”一體化，降低人工操作誤差。實際應用數(shù)據(jù)顯示，該方法可明顯減少人工操作步驟，顯著提升檢測標準化程度。

基于上述優(yōu)勢，本研究建立“RAA初篩－靶向培養(yǎng)確認”的二級檢測模式：經(jīng)6h前增菌處理后，RAA初篩陽性樣本進行靶向培養(yǎng)驗證，陰性樣本直接排除。該策略明顯縮短了檢測周期，提升了陽性檢出率，降低了假陰性率。RAA技術應用于水產(chǎn)品中副溶血性弧菌的檢測是一種理想的檢測方法，尤其適用于以下場景： ① 食品安全日常監(jiān)測中可實現(xiàn)高通量篩查（日處理量 gt;200 樣本）； ② 食源性疾病暴發(fā)應急處置時，"^4h"內完成病原體溯源?，F(xiàn)場驗證數(shù)據(jù)顯示，該方法在基層檢測機構的操作培訓時間僅需8個標準學時，設備便攜性滿足流通環(huán)節(jié)快檢需求，具有顯著的公共衛(wèi)生應用價值。

參考文獻

[1]倪云龍，喬昕，王燕梅，等.2010—2020年江蘇省海產(chǎn)品副溶血性弧菌污染狀況分析[J].江蘇預防醫(yī)學，2023，34（1）：89-92.

[2]劉濤，俞驊，張蔚，等.免疫磁珠-環(huán)介導等溫擴增聯(lián)用技術快速檢測副溶血性弧菌方法的建立[J].中國預防醫(yī)學雜志，2017，18（4）：266-271.

[3]馮艷琴，萬夕和，沈輝，等.水產(chǎn)動物副溶血性弧菌的拮抗菌研究進展[J].微生物學雜志，2021，41（1）：99-106.

[4]劉明，曹夢思，彭雪菲，等.重大活動中食源性疾病的食品安全風險評估分級研究[J].中國食品衛(wèi)生雜志，2021，33（6）：657-665.

[5]康俊杰，王秋悅，吳晨雨，等2種食源性致病菌多重熒光PCR檢測方法的建立[J].食品科技，2024，49（3）：351-356.

[6]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.食品安全國家標準食品微生物學檢驗副溶血性孤菌檢驗：GB4789.7—2013[S].北京：中國標準出版社，2013.

[7]中華人民共和國國家質量監(jiān)督管理總局.進出口食品中副溶血性弧菌快速檢測方法實時熒光PCR法：SN/T2424—2010[S].北京：中國標準出版社，2010.

[8]陳海云，滕麗瓊，邱英華，等.柑橘黃龍病RAA-LFD檢測方法的建立[J].現(xiàn)代農業(yè)科技，2023（1）：61-66.