中圖分類號：S792.99 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-923X（2025）07-0174-14

Analysisof transcriptomeand chlorogenicacid related genesin Eucommia ulmoides leaves at different developmental stages

WANGSiran1，LIHui，Aricha’，JINMulan2，QINGJun1，BAIYu’e1 （1.CollegeofForestryInnerMongoliaAgriculturalUnversity，Hohhot Ooo19，Inner Mongolia，China; 2.UlanqabForestryand GrassandMonitoring andPlanning Station，UlanQab O120o，Inner Mongolia，China）

Abstract：【Objective】Chlorogenicacid isanindex componentforthequalityevaluationofEucommiaulmoides leaves，whichhas variousmeiciallusschtbactealdtamtorytiodanttacrdtptitieatio andexcaationofmetabolicpathwaysandgnesinvolvedinregulatingchlorogenicacidbiosynthesis inEucommiaulmoidesleaves willprovidefurtherevidenceforanalysisofthemolecularmchanismofchlorogenicacidformationinEucommiaulmoidesleaves. 【Method】Eucommialmoidesleavesrecectedfromotou，Iergoliautonomousgion，inpril，Julydctober 2023at diferetdevelopmenalperods，andwereclaifedaccordingtotecharacterationas：Aprilfreshlyunfoledyoungleaves; Julymatureleaves，withlighteathery;andctoberfullymatureaves，withthdarkestcoloroftelavesandompleteleathrye chlorogenicacidcontentofEucommiaulmoidesleavesatdiferentperiodswasdeterminedbyig-performanceliquidchromatography （HPLC），andthediferetiallexpressedgenesereidentifdbyrasiptomesequencing.【Result】Teloogniccidctet ofEucommiaulmoidesleavesrangesfromApriltoJulyandthentoOctober，showsanincreasingandthendecreasing trend withleaf development.Transcriptome sequencing yielded 58.06 Gbof clean data，enablingthe identification of11 689 genes.The numberof down-regulatedexpressdgnesisigherthanteumberofupregatedexpresedgenesinteompasonofsTTsand

T2vsT3hreegroups.KEGGenrichmentanalysisandGOenrichmentanalysis，bothofwhichdisplaychlorogenicacidsynthsis-related enrichments.FurtemoreKmeanstredexpreionividsteensinto0modles，inwhichtrendsofgeneexpressinlass4， Class8adClassareconsstentwithtrendsoforogenicacidotetadtwozsandegensareidentifdfroClass4 Class8andClass10tatarerelatedtoclorogenicacidbiosythsis.Tresultsofal-tiefuoreseequanitativePCR（-CR） are inaccordance withRNA-seqoutcomes.【Conclusion】ThechlorogenicacidcontentintheEucommiaulmoides leavesshowsa trend of increasing and then decreasing with the development of the leaves.

Keywords：Eucommiulmodesorogeniccid;trsiptoe;difrentiallyexpreedneDEGs）;iofoatiais

杜仲Eucommiaulmoides落葉喬木，為杜仲科杜仲屬植物，是我國名貴藥材之一，亦是藥食同源植物。其有關(guān)記載可追溯到《神農(nóng)本草經(jīng)》，《中國藥典》收錄杜仲樹皮作為中藥入藥。隨著對杜仲研究的深入，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，杜仲樹皮與杜仲葉片的化學(xué)成分大致相同。杜仲中的主要化學(xué)成分包括木脂素類、環(huán)烯醚萜類、酚酸類、類黃酮等；其中，在2020版《中國藥典》中，將綠原酸（Chlorogenicacid，CGA）作為杜仲葉片質(zhì)量評價(jià)的指標(biāo)性成分，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不得少于0.08% 的限度[1-2]。苯丙烷代謝途徑作為植物重要的二級代謝途徑之一，在植物生長發(fā)育及調(diào)控中起到關(guān)鍵作用。苯丙烷代謝途徑衍生了許多下游代謝途徑，以苯丙氨酸為前體產(chǎn)生化合物，如類黃酮、木質(zhì)素、花青素和有機(jī)酸等。其中綠原酸是一種苯丙類物質(zhì)，在植物有氧呼吸過程中，通過莽草酸途徑（Shikimatepathway）由苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonialyase，PAL）轉(zhuǎn)化為肉桂酸（Aerobic respiration）[3-6]。在不同種類植物中，綠原酸合成主要有4種途徑，第1種途徑，肉桂酸通過4-香豆酸：輔酶A連接酶（4-coumarate：CoALigase，4CL）、肉桂酸-4-羥化酶（Cinnamic acid 4-hydroxylase，C4H）、莽草酸羥基肉桂?；D(zhuǎn)移酶（shikimate O-hydroxycinnamoyltransferase，HCT） 和 CYP98A 酶（5-O-（4-coumaroyl）-D-quinate 3^′ -monooxygenase）進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化為中間體咖啡酰輔酶A（Caffeoyl-CoA），然后通過羥基桂皮酰輔酶A羥基桂皮酰轉(zhuǎn)移酶（Hydroxycinnamoyl-Co A：quinate hydrox-ycinnamoyl transferase，HQT）催化咖啡酰輔酶A（Caffeoyl-CoA）和奎寧酸（Quinicacid）合成綠原酸；該途徑被認(rèn)為是植物合成CGA的主要途徑，已在多個物種中進(jìn)行了研究認(rèn)證[6-12]。第2種途徑，羥基肉桂酰輔酶A：莽草酸/奎寧酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶（HCT）和對香豆酸-3-羥化酶（C3H）發(fā)生催化反應(yīng)，然后通過羥基化反應(yīng)形成綠原酸[1l-2]。第3種途徑是對香豆酸能在對-香豆酸3-羥化酶和肉桂酸-4-羥化酶催化下轉(zhuǎn)化為咖啡酸，然后在4-香豆酸-輔酶A連接酶與羥基肉桂酰輔酶A奎寧酸羥基肉桂?；D(zhuǎn)移酶連續(xù)作用下生成綠原酸[13]。第四種途徑是僅在少量植物中合成，通過同位素示蹤在甘薯根部發(fā)現(xiàn)了HCGQT，咖啡酰-D-葡萄糖（Caffeoyl-D-glucose）和D-奎寧酸（D-quinic acid）催化綠原酸的形成[13-14]。所有這些合成途徑都涉及相同類型的羥基化和酯化反應(yīng)[6-16]。

自20世紀(jì)50年代起，為獲得更高的經(jīng)濟(jì)效益，抗生素開始作為生長促進(jìn)劑被添加到動物飼料中，此做法逐步成為全球養(yǎng)殖業(yè)的普遍行為[17]。在沒有嚴(yán)格的監(jiān)管制度和過度使用抗生素的情況下，不僅針對動物的病原菌產(chǎn)生耐藥性，而且在動物體內(nèi)堆積的抗生素會隨著糞便等排泄物排出，一旦其被用作肥料進(jìn)入土壤，進(jìn)入地下水，就會影響人類的健康環(huán)境[18-19]。2020 年，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部正式發(fā)布第194號公告，決定停止生產(chǎn)、進(jìn)口、經(jīng)營、使用部分藥物飼料添加劑，宣告著我國“全面禁抗”時(shí)代的到來；但是，其中仍然保留獸藥作為促生長類藥物的飼料添加劑品種[20]。早在2011年，我國就開始擬計(jì)劃全面禁止在飼料中添加任何抗生素。由此可見，抗生素替代產(chǎn)品的研究與發(fā)展，已經(jīng)成為當(dāng)前畜牧業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域不可忽視的問題。因此，植物來源的藥用提取物被人類所關(guān)注，因其具有長期接觸后不會誘發(fā)耐藥性等優(yōu)勢，使得植物來源提取物成為當(dāng)今研究主要熱點(diǎn)[21-22]。因此，本研究對不同發(fā)育時(shí)期的杜仲葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq），以期為杜仲葉片及其活性成分在養(yǎng)殖動物營養(yǎng)調(diào)控方面提供重要參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

研究中所用試驗(yàn)材料來自內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市甲爾壩村10年生種質(zhì)資源，以4月、7月和10月采集不同發(fā)育時(shí)期的葉片，根據(jù)表征將葉片劃分為：4月剛展開的嫩葉（T1）；7月成熟葉片，輕微革質(zhì)化（T2）；10月完全成熟葉片，葉片顏色最深，完全革質(zhì)化（T3）（圖1）。采樣后用液氮速凍，放置于 -80^°C 超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 HPLC法測定綠原酸含量

使用HPLC測定3個不同發(fā)育時(shí)期葉片的綠原酸含量，使用1260InfinityII高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），LunaHPLC/UHPLCC18色譜柱（飛諾美phenomenex）；GM-0.33M循環(huán)水式多用真空泵（津騰）；SKE-3（72S）超聲波清洗機(jī)（寧波市鄞州碩力儀器有限公司）。綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（津騰）。色譜條件：柱溫 25^°C ，流動相A為 0.4% 甲醇，流動相B為磷酸水，以洗脫梯度 0～3 min，30%～33%B ： 3～10min ， 33%～35%B ； 10～ 13min ， 35%～ 62%B ； 13～23min ， 62%～ 65%B ； 23～25min ， 65%～100%B ； 30～ 45min ， 30%～33%B 。

標(biāo)準(zhǔn)溶液制備：分別稱取綠原酸對照品10mg ，用甲醇水定容至 10mL ，冷藏待用。供試品稱取綠原酸粉末 5g ，用 60% 乙醇定容至 100mL 后，恒溫水浴鍋加熱、過濾、濃縮。綠原酸含量根據(jù)峰面積計(jì)算，3個技術(shù)性重復(fù)，通過SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析[23]。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測序及數(shù)據(jù)分析

1.3.1RNA提取、cDNA文庫構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測序

使用CTAB法提取3個不同發(fā)育時(shí)期杜仲葉片總RNA，3個不同發(fā)育時(shí)期總RNA送至武漢邁特維爾生物科技有限公司進(jìn)行高通量RNA-Seq測序。利用IlluminaNovaseq6000 測序平臺對cDNA文庫進(jìn)行測序；Unigene序列利用BLAST軟件在KEGG和GO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。

1.3.2轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量評估

測序reads經(jīng)過fastp過濾后得到cleanreads，測序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度以Q20和Q30的大小評估，通常 ?85% 數(shù)據(jù)質(zhì)量較好。將質(zhì)量較好的cleanreads與杜仲參考基因組比對，進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)注釋、基因表達(dá)分析和基因功能預(yù)測等[24]。利用軟件HISAT2將CleanReads與杜仲參考基因組進(jìn)行序列比對，獲得在基因組或參考基因組上的位置信息，以及測序樣品特有的序列特征信息。

1.3.3 差異表達(dá)基因（DEGs）鑒定與功能注釋分析

采用HISAT軟件構(gòu)建基因組索引，并將cleanreads比對到參考基因組。隨后，使用featureCounts軟件對基因比對情況進(jìn)行計(jì)算，并根據(jù)基因長度計(jì)算每個基因的FPKM（FragmentsPerKilobase of transcript per Million mapped reads）?；诒磉_(dá)量定量結(jié)果，以FDR lt;0.05 且 （foldchange） ?1 作為顯著性閾值，篩選不同發(fā)育時(shí)期間表達(dá)水平顯著差異的基因（Differentiallyexpressedgenes，DEGs）。最后，將篩選出的DEGs 進(jìn)行 KEGG（Kyoto encyclopedia of genesand genomes）和GO（Gene ontology）富集分析。

1.4 Kmeans表達(dá)趨勢

基于篩選獲得的DEGs并集，提取其FPKM表達(dá)矩陣，使用R語言中的scale函數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，采用Kmeans聚類分析，將具有相似的變化趨勢的基因進(jìn)行歸類分析。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）

根據(jù)杜仲葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選綠原酸合成通路中的DEGs，進(jìn)行qRT-PCR測定，驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的真實(shí)性及可靠性。使用Primer3.0設(shè)計(jì)各基因的特異性qRT-PCR引物，Actin和GADPH為內(nèi)參基因（表1）?？俁NA的提取使用試劑盒（OminiPlantRNAKit），反轉(zhuǎn)錄使用試劑盒（PrimeScriptTMRT-PCRkit）合成，使用LightCycler480II實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。每個基因重復(fù)3次，表達(dá)量的計(jì)算采用 法[25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜仲葉片不同發(fā)育時(shí)期綠原酸含量變化

在葉片發(fā)育過程中，綠原酸含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢（圖2）。具體而言，從T1階段 42.20% 到T2階段 79.51% ，綠原酸含量增加了 37.31% ；而在T2至T3階段，含量則顯著下降57.63% 。結(jié)果表明，綠原酸含量隨葉片發(fā)育呈現(xiàn)先升高后降低的動態(tài)變化趨勢。

2.2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

本試驗(yàn)選取杜仲葉片3個不同發(fā)育時(shí)期的9個樣品為研究對象進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，經(jīng)嚴(yán)格過濾后共獲得58.06GbCleanData。將質(zhì)控后的cleanReads與參考基因組進(jìn)行比對，得到的比對率均高于90.00% 以上。其中Q30堿基百分比在 94.00% 以上，序列GC含量為 47.13～48.90 （表2）。以上結(jié)果均表明本實(shí)驗(yàn)測序質(zhì)量較好，可用于后續(xù)分析。

2.3 樣本間相關(guān)性分析

對杜仲葉片在3個發(fā)育時(shí)期的樣本轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（PCA），結(jié)果顯示，主成分1（PC1）和主成分2（PC2）可分別解釋 49.35% 和22.94% 的方差，累計(jì)貢獻(xiàn)率為 72.29% 。同時(shí)，各時(shí)期內(nèi)的3個生物學(xué)重復(fù)具有高度相似性，且不同時(shí)期樣本間存在明顯分離，表明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量良好。此外，基于FPKM的聚類熱圖證實(shí)了樣本的組內(nèi)相似性（圖3）；進(jìn)一步驗(yàn)證了數(shù)據(jù)的可靠性。值得注意的是，3個月份樣本明顯分離，說明3個發(fā)育時(shí)期存在差異。

2.4 杜仲葉片不同發(fā)育時(shí)期DEGs的鑒定與分析

篩選杜仲葉片3個發(fā)育時(shí)期的DEGs，比較基因表達(dá)水平及鑒定不同發(fā)育時(shí)期中DEGs。

T1vsT2產(chǎn)生8192個DEGs，其中上調(diào)基因個數(shù)為3523個，下調(diào)基因數(shù)量為4669個；T1vsT3產(chǎn)生9350個DEGs，其中上調(diào)基因個數(shù)為3927個，下調(diào)基因數(shù)量為5423個；T2vsT3產(chǎn)生3963個DEGs，其中上調(diào)基因個數(shù)為1679個，下調(diào)基因數(shù)量為2284個（圖4A）?？梢钥闯?，T1vsT3之間的差異表達(dá)基因最多，這些差異表達(dá)基因可能與杜仲葉片代謝產(chǎn)物活性較強(qiáng)有關(guān)。進(jìn)一步通過韋恩圖分析，展示出不同比較組特有的差異表達(dá)基因和組間共有的差異表達(dá)基因。通過對比3個比較組，發(fā)現(xiàn)共存上調(diào)基因336個，共存下調(diào)基因652個（圖4B）。根據(jù)兩兩比較的差異表達(dá)基因數(shù)目，發(fā)現(xiàn)3個比較組中下調(diào)DEGs數(shù)目均高于上調(diào)DEGs數(shù)目，這意味著葉片發(fā)育過程中代謝物積累的變化可能受到差異表達(dá)基因的嚴(yán)格調(diào)控。

2.5 差異表達(dá)基因KEGG富集分析

2.5.1 KEGG上下調(diào)差異表達(dá)基因（DEGs）氣泡圖

通過KEGG數(shù)據(jù)庫對杜仲葉片在3個不同發(fā)育時(shí)期中DEGs參與的代謝通路進(jìn)行注釋和分析。對3個不同發(fā)育時(shí)期的差異表達(dá)基因進(jìn)行對比分析發(fā)現(xiàn)（圖5），3組比較中，與綠原酸合成的相關(guān)代謝途徑DEGs在6個途徑中顯著富集（ ?Plt;0.05） ：花青素生物合成（Anthocyaninbiosynthesis）、單萜生物合成（Monoterpenoidbiosynthesis）、苯并惡嗪生物合成（Benzoxazinoidbiosynthesis）、苯丙素生物合成（Phenylpropanoid biosynthesis）、萜類骨架生物合成（Terpenoidbackbonebiosynthesis）、苯并嗪類生物合成（Benzoxazinoidbiosynthesis）。這表明綠原酸積累的變化可能是由參與這些生物代謝過程的DEGs引起。

2.5.2KEGG上調(diào)差異表達(dá)基因富集分析

對上調(diào)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG柱狀圖分析（圖6），發(fā)現(xiàn)T1vsT2主要富集在單萜生物合成（Monoterpenoidbiosynthesis）、苯并嗪類生物合成（Benzoxazinoid biosynthesis）、花青素（Anthocyaninbiosynthesis）。T1vsT3主要富集在Isoflavonoidbiosynthesis（異黃酮生物合成）、Benzoxazinoidbiosynthesis（苯并嗪類生物合成）、Caffeinemetabolism（咖啡因代謝）。T2vsT3上調(diào)差異表達(dá)基因主要富集在苯丙素生物合成（Phenylpropanoidbiosynthesis）、異黃酮生物合成（Isoflavonoidbiosynthesis）、類胡蘿卜素生物合成（Carotenoidbiosynthesis）。由此發(fā)現(xiàn)，在3個比較組中，均出現(xiàn)與綠原酸合成相關(guān)通路，說明綠原酸差異表達(dá)基因在杜仲葉片整個發(fā)育時(shí)期均有所變化。

2.6 差異表達(dá)基因GO注釋分析

為探究杜仲葉片發(fā)育過程中DEGs的主要生物學(xué)功能，對DEGs進(jìn)行GO注釋分析，從而確定差異表達(dá)基因主要的生物學(xué)功能，包括生物過程（Biological process）、細(xì)胞組成（Cellularcomponent）和分子功能（Molecularfunction）三大類。對DEGs進(jìn)行GO第二層級分類統(tǒng)計(jì)，按照注釋將基因數(shù)量從大到小進(jìn)行排序，分別取BP、CC和MF三大類的前15個GOTerm（圖7）。分析過程中，主要關(guān)注差異表達(dá)基因參與綠原酸生物合成。

T1vsT2與綠原酸相關(guān)的DEGs富集在萜類化合物生物合成過程（Terpenoidbiosyntheticprocess）、單萜生物合成過程（Monoterpenoidbiosyntheticprocess）、單萜代謝過程（Monoterpenoidmetabolicprocess）。T1vsT3與綠原酸相關(guān)的DEGs富集在萜類化合物生物合成過程（Terpenoidbiosyntheticprocess）、苯丙素代謝過程（Phenylpropanoidmetabolicprocess）、單萜生物合成過程（Monoterpenoid biosynthetic process）、單萜代謝過程（Monoterpenoid metabolicprocess）。T2vsT3與綠原酸相關(guān)的DEGs富集在苯丨丙烷代謝過程（Phenylpropanoidmetabolicprocess）、苯丙烷生物合成過程（Phenylpropanoidbiosyntheticprocess）、三萜生物合成過程（Triterpenoidbiosynthetic proces）、異黃酮代謝過程（Isoflavonoid metabolic process）、異黃酮生物合成過程（Isoflavonoidbiosynthetic process）。GO注釋分析表明，綠原酸積累的變化可能是由參與這些生物代謝過程的DEGs引起的。

2.7 表達(dá)趨勢分析

為解析差異基因在杜仲葉片發(fā)育過程中的表達(dá)趨勢，將差異基因并集的FPKM使用R語言scale函數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，并進(jìn)行Kmeans聚類分析，最終獲得10個不同表達(dá)模塊（圖8）?；诒磉_(dá)模式與綠原酸含量變化的相關(guān)性分析，篩選出Class4、Class8和Class10中的基因進(jìn)行深入研究，以挖掘調(diào)控綠原酸合成的關(guān)鍵基因。

2.8 杜仲葉片綠原酸生物合成相關(guān)基因篩選

現(xiàn)有研究表明，綠原酸生物合成主要涉及苯丙烷生物合成途徑（ ）。在上述分析中，Class4、Class8和Class10中共有20個基因富集在苯丙烷生物合成途徑（ ko00940 ）。然而，與綠原酸相關(guān)且與綠原酸含量變化一致的基因有9個，2個PAL基因和7個HCT基因?；谄渌参锉奖楹铣上嚓P(guān)研究及差異基因的KEGG代謝通路分析，本研究建立了杜仲葉片綠原酸的合成通路（圖9）。

2.9 qRT-PCR驗(yàn)證RNA-seq數(shù)據(jù)可靠性

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究選取了在綠原酸生物合成（ ko00940 ）中4個與綠原酸合成相關(guān)的基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示EU01211331、EU0122731、EU0122730、EU0122732的表達(dá)量從T1至T3呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，與RNA-seq結(jié)果基本一致（圖10）。此外，與HPLC法測定3個不同發(fā)育時(shí)期綠原酸含量變化結(jié)合分析，發(fā)現(xiàn)不同發(fā)育時(shí)期綠原酸合成相關(guān)基因的表達(dá)趨勢與綠原酸含量變化趨勢一致，均隨著葉片發(fā)育過程中呈現(xiàn)先增加后降低趨勢。

3討論

3.1 杜仲葉片綠原酸含量

評價(jià)藥用植物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，主要取決于有效藥用化學(xué)成分含量，其與品種、地域、栽培環(huán)境和采收季節(jié)等有較大關(guān)系，其中采收季節(jié)是不可忽略的重要因素。早前，確定藥用植物最佳采收季節(jié)，多來自人類生產(chǎn)實(shí)踐中的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)；隨著藥用植物研究的發(fā)展，需要考慮有效藥用成分在植物體內(nèi)積累動態(tài)的變化規(guī)律[25]。關(guān)于不同種類藥用植物中有效藥用成分積累變化有較多研究，如郝巖等[2測定了不同采收時(shí)期五味子葉片中總黃酮、總黃酮醇和總酚酸含量的動態(tài)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)藥用成分含量大致趨勢為先升高至6月下旬到達(dá)最大值，后逐漸降低并有微小浮動。戚仁潔等[27]在苦瓜皂苷的研究中發(fā)現(xiàn)，在子房期（T1）、幼果期（T2）、商品果期（T3）和完全成熟期（T4）中，苦瓜內(nèi)源皂苷含量隨著果實(shí)發(fā)育而呈現(xiàn)顯著下降的趨勢。杜仲中將綠原酸作為質(zhì)量評價(jià)的指標(biāo)性成分，為了明確杜仲綠原酸在發(fā)育過程中的合成規(guī)律，本研究測定了杜仲葉片3個不同發(fā)育時(shí)期綠原酸含量，結(jié)果表明杜仲葉片中綠原酸含量會隨著發(fā)育過程出現(xiàn)先增加后降低趨勢，在夏季杜仲中綠原酸含量高于其他時(shí)期，這與黃琛斐等[28]、魏銳[29]、何希瑞等[30]研究結(jié)果一致。魏銳[27]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)6月是綠原酸含量最高的月份，與之不同的是何希瑞等[30研究發(fā)現(xiàn)8—9月是綠原酸含量最高的月份。這一現(xiàn)象可能是地域差異和樣品處理方式的不同導(dǎo)致[29-32]。

3.2 杜仲葉片綠原酸生物合成相關(guān)基因

本研究中發(fā)現(xiàn)，在3個不同發(fā)育時(shí)期對比數(shù)據(jù)中，下調(diào)基因數(shù)目均高于上調(diào)基因數(shù)目，這說明杜仲葉片發(fā)育過程中，某些生物合成相關(guān)基因作用是逐漸減弱的，推測可能與代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)。該現(xiàn)象在其他植物中也出現(xiàn)類似現(xiàn)象，如苦瓜不同時(shí)期果實(shí)皂苷合成存在變化，在組間對比差異中，下調(diào)基因數(shù)目均高于上調(diào)基因數(shù)目，這表明苦瓜果實(shí)成熟過程中，皂苷合成相關(guān)基因的作用是逐漸減弱的[30]。本研究的Class4、Class8 和Class10中的差異基因的表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，與測定的綠原酸含量變化規(guī)律相一致。由此推測，該模塊中的基因可能與杜仲葉片綠原酸生物合成相關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，苯丙烷生物合成通路與杜仲葉片綠原酸化合物合成相關(guān)，鑒定出2個關(guān)鍵酶及9個差異表達(dá)基因。這一結(jié)果與Ye等[31]研究結(jié)果相似，但與綠原酸合成通路中的關(guān)鍵酶有部分差異，這可能由于不同基因型、采樣時(shí)間和地理位置等因素所影響。植物綠原酸化合物主要是通過苯丙烷途徑合成[13]，對苯丙烷途徑不同變化趨勢的DEGs進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)部分DEGs變化趨勢與綠原酸含量變化不一致。這一現(xiàn)象原因尚不明確，推測可能與葉片發(fā)育過程中的部分次生代謝產(chǎn)物會向種子轉(zhuǎn)運(yùn)和積累這一現(xiàn)象有關(guān)。

4結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)杜仲葉片綠原酸含量隨著葉片發(fā)育成熟呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。通過轉(zhuǎn)錄組分析，按照表達(dá)模式將這些基因分成10個模塊，其中Class4、Class8和Class10中基因的表達(dá)趨勢與杜仲葉片綠原酸含量變化規(guī)律相一致。從中進(jìn)一步鑒定出，苯丙烷合成通路兩個關(guān)鍵酶PAL和HCT，包含9個與綠原酸合成相關(guān)基因。目前對于杜仲葉中綠原酸合成途徑的研究不足，制約了對杜仲葉片的合理利用與發(fā)展。本研究從分子生物學(xué)的角度，闡明影響杜仲葉中綠原酸形成的主導(dǎo)內(nèi)在遺傳因素，對實(shí)現(xiàn)藥材質(zhì)量“安全、有效、穩(wěn)定、可控”的目標(biāo)有重要意義，可為杜仲資源合理利用，合理采收等提供參考依據(jù)。

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[本文編校：吳毅]