中圖分類號：Q418 文獻標志碼：A DOI： 10.19907/j. 0490-6756.250058

Effects of high dose ellagic acid on the lifespan and physiological parametersofCaenorhabditis elegans

YANGHua1，YANXin1，SHIHao1，CHENYi-Ping1，ZHUHan-Sheng， HUANG Chang- Yi^r ，WANGJia1，WANG Song-Tao2，LI Shu2，ZAHO Jian

（1.Key Laboratoryof Microbiological Resources and Biotechnologyof Sichuan Province，CollgeofLife Sciences，

Sichuan University，Chengdu 6loo64，China；2.Luzhou Pinchuang Technology Co.，Ltd./National Engineering Research Center of Solid-State Brewing，Luzhou 646OOO，China）

Abstract： In order to investigate the effects of high-dose ellagic acid （EA） on the lifespan，growth ability，reproductive capacity，pharyngeal pumping frequency，and mobility of Caenorhabditis elegans （C. elegans）， nematodes were randomly assgned to a blank control group or experimental groups treated with varying concentrations （0.025～1mg/mL ）of 24% or 81% purity EA，under standard culture condition at 20^°C .The results showed that both 24% and 81% EA significantly reduced the mean lifespan and reproductive capacity of nematodes in a concentration- and purity-dependent manner，with higher doses and purities exerting stronger inhibitory efects.However，EA treatment had no significant efect on the growth of adult nematodes.In terms of pharyngeal pump and mobility，the 24% EA and 81% EA concentration groups were consistent with the blank control group，showing an age-dependent decline. EA had no significant efect on pharyngeal pumping frequency，but high-dose 81% EA（ 1mg/mL ）can accelerate the decrease of the movement ability of nematodes. The results showed that high dose of ellagic acid could shorten lifespen of nematodes and affect the related physiological parameters of nematodes，highlighting potential risks associated with excessive EA intake.

Keywords： High dose ellagic acid; Caenorhabditis elegans; Lifespan; Physiological parameters

1引言

鞣花酸是一種天然多酚類物質，不僅存在于石榴和草莓等各種水果中，同時也存在于核桃和開心果等各種堅果中[1]，具有很強的抗氧化性[2]、抗炎3、抗病毒感染4和保肝5等生物學功能.根據(jù)自由基學說[6，鞣花酸可以通過激活抗氧化相關途徑來清除自由基從而可達到抵抗衰老的作用.然而由于EA的大量攝入，導致對細胞存在一定潛在的毒性，王東等研究表明高劑量EA對HEK-293細胞存在損傷作用，使得細胞內活性氧水平升高，氧化性損傷標志性產物增多，造成細胞DNA損傷； 15～240μmol/L 的EA對中國倉鼠B14細胞的研究也表明對細胞具有潛在的毒性作用，甚至在濃度為 15μmol/L 時也會導致細胞損傷，而濃度在 60μmol/L 時對細胞的損傷到達最大，使細胞存活率降到 50% ；盛夢圓9研究高劑量的EA對HK-2細胞線粒體功能的影響，結果表明 50～200 μmol/L 的EA會導致腎小管上皮細胞活性氧升高，從而導致細胞活力下降，線粒體膜電位下降，線粒體自噬障礙，以及細胞凋亡的產生.在亞慢性毒性研究中發(fā)現(xiàn)，在喂食9Od的EA之后，雄性大鼠無明顯變化，而在雌性大鼠中觀察到體重輕微減輕，并呈劑量依賴性，以上研究都表明高劑量的EA存在一定的毒性作用[10].因此，本研究通過探究高劑量的EA對機體生長的影響，為評估其對人類健康的潛在危害提供一定的理論依據(jù).

秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditiselegans，C.el-egans）在1974年首次被引入作為分子和發(fā)育生物學的模式生物[1]，與傳統(tǒng)動物模型相比，存在著許多的優(yōu)點，有著超過 65% 與人類疾病相關的基因[12]，生命周期短、保守的細胞和分子結構、易于觀察培養(yǎng)和個體結構簡單等特點，使其成為研究人類疾病的理想模式生物，也成為研究衰老的首要模型[13].在衰老相關的研究中，除了通過直接比較C.elegans的壽命長短來評估衰老過程外，還可以通過觀察其隨年齡增長所呈現(xiàn)的多項生理指標的變化來進行表征.具體而言，隨著線蟲年齡的增大，其活動性逐漸減弱，表現(xiàn)為運動頻率降低、身體擺動的協(xié)調性變差，同時吞咽食物的速度也出現(xiàn)明顯的下降14.如Kim等15研究了微生物群衍生的代謝物3-苯乳酸對C.elegans中的線粒體功能和壽命的影響；王萌萌等16研究了川續(xù)斷對阿爾茨海默病C.elegans模型作用機制；李姝等[17]研究了 β -煙酰胺單核苷酸對C.elegans生長的影響及其作用機制.

基于此，本研究以C.elegans作為動物模型，探究高劑量的EA對線蟲生長的影響，旨在為EA的安全劑量設計和衰老干預策略提供理論基礎.

2 材料與方法

2.1 實驗材料

秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditiselegans，C.el-egans）野生型N2和大腸桿菌（Escherichiacoli，E.col）尿嘧啶缺陷型OP50由提供．

純度為 24% 和 81% 鞣花酸，由實驗室從石榴皮中提取的；膽固醇，北京索萊寶科技有限公司；LB肉湯、LB瓊脂，青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司；5-氟 -2^′ -脫氧尿嘧啶核苷（floxuridine，F(xiàn)UDR），美國Sigma公司；逆轉錄試劑、TBGreen，寶生物工程（大連）有限公司；其余生化試劑（分析純），成都金山化學試劑有限公司.

2.2 實驗方法

2.2.1線蟲常規(guī)培養(yǎng)將平板上的線蟲以 3mL M9緩沖液18洗下，并轉移至 15mL 離心管中，2500r/min 離心 2min ，棄去上清，保留管底約150μL 液體，移液槍吹吸混勻后接種于線蟲生長培養(yǎng)基NGM-OP5[18]上至發(fā)育成懷卵線蟲為止（直至平板上出現(xiàn)大量的卵即可）[18].

2.2.2線蟲同步化將 9cm 平板上已發(fā)育至成蟲的懷卵線蟲以 3mLM9 緩沖液洗下，并轉移至15mL 離心管中，使其最終體積約為 2.8mL ，按順序依次加入次氯酸鈉原液 0.8mL，5mg/mL NaOH溶液 0.4mL ，來回顛倒混勻數(shù)次后，置于離心機中 5500r/min 離心 1min ，棄上清.在無菌條件下，加入 4mL M9緩沖液，混勻后 5500r/min 再次離心 1min ，棄上清.隨后加入 4mL M9緩沖液，吹吸混勻后將含蟲卵的液體轉移至 3.5cm 的空培養(yǎng)皿中， 20°C 過夜孵化[18].

2.2.3待測樣品的制備以 1% DMSO作為溶劑（即空白對照），配制 2.5mg/mL 的 24% 和 81% 的鞣花酸母液，并按照倍比稀釋法配制成不同濃度的鞣花酸溶液進行實驗，樣品濃度為 1mg/mL 、0.1mg/mL，0.05mg/mL，0.025mg/mL^[19]

2.2.4線蟲壽命實驗取 6cm 平血，每血中加入約 5mLNGM 培養(yǎng)基，室溫放置過夜備用.所有野生型秀麗隱桿線蟲N2均依據(jù)標準規(guī)程以大腸桿菌OP50作為食物來源于 20^°C 下進行培養(yǎng)．為了排除待測樣品對OP50生長以及OP50代謝待測樣品所帶來的影響，將過夜生長的OP50離心后重懸于M9緩沖液中， 65^°C 加熱 30min ，至于一 20^°C 保存?zhèn)溆?

每次轉移線蟲之前，取 100μL 備用的OP50（ 8.5×10⁸ CFU/mL）均勻涂布在 6cm 的NGM平板上，室溫放置過夜.隨后吸取 100μL 不同濃度鞣花酸樣品及空白對照（ 1% DMSO）均勻涂布在含OP50-NGM的平板上，自然干燥后備用.

采用次氯酸鈉、NaOH溶液使線蟲同步化，收集同步化后的L1期線蟲 8000r/min 離心 10min 離心管底留液體適量，渦旋后取 5μL 至平板蓋上于體式顯微鏡下計數(shù)，將過夜孵化的L1期線蟲轉移至含有預先加人不同濃度待測樣品或 1% DMSO及表面涂布有OP50的NGM平板中.待線蟲長至L4期，按照不同組別及以每 6cm 平皿中30條線蟲的比例進行隨機分配轉移（每組3個平行）.將L4期的線蟲轉移至同時加有終濃度為 40μmol/L 5^′. -氟脫氧尿苷（FUDR）的NGM中培養(yǎng)2d，以防止生殖.隨后將線蟲轉移至無FUDR的NGM平板中．以線蟲成年的第1d記為day1，線蟲成年后需每天將其轉移至新鮮NGM中，成年5d后每2d將其轉移至新鮮NGM中（保證線蟲營養(yǎng)充足且保證實驗中的線蟲是同一代，避免由于雌性線蟲與雄性線蟲交配影響實驗結果）. 20°C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每次轉移時記錄線蟲的存活、死亡（無移動或吞咽，輕觸后無反應）及剔除條數(shù)（爬到培養(yǎng)血上干涸而死、蟲卵在體內孵化、鉆入瓊脂或逃逸），直至所有線蟲死亡為止[20].

2.2.5線蟲生長實驗設置 1% DMSO空自對照組和鞣花酸實驗組 （0.025mg/mL，0.05mg/ mL.0.1mg/mL.1mg/mL） .與壽命檢測同步進行，于生存天數(shù)的第12d測1次，每組隨機挑選至少 7～13 條線蟲在顯微鏡下進行線蟲長度的測量[21-22].

2.2.6線蟲生殖能力檢測設置 1% DMSO空白對照組和鞣花酸實驗組 （0.025mg/mL，0.05 mg/mL.0.1mg/mL.1mg/mL） .隨機挑取L4期線蟲（前期處理同壽命實驗）轉移到新鮮NGM板中（每板10條線蟲，每組3個平行），每隔1d轉移1次，直至生殖期結束.每次產卵后對蟲卵直接計數(shù)，計算10條線蟲每天及總的產卵量[23].

2.2.7線蟲咽泵頻率檢測設置 1% DMSO空白對照組和鞣花酸實驗組 （0.025mg/mL，0.05 mg/mL.0.1mg/mL.1mg/mL） .與壽命檢測同步進行，每次檢測隨機挑選至少5條線蟲（每組3個平行）在顯微鏡下記錄15s內線蟲吞咽的次數(shù)[23].2.2.8線蟲移動能力檢測參照壽命檢測設置1% DMSO空白對照組和鞣花酸實驗組（0.025mg/mL_?0.05mg/mL_?0.1mg/mL_?1mg/mL） .每次檢測隨機選取約5條線蟲（每組3個平行）滴入1滴M9緩沖液，在顯微鏡下記錄20s線蟲身體來回擺動的次數(shù)[24].

2.2.9數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析采用GraphPadPrism8.0軟件對線蟲體長檢測的結果進行單因素方差分析，實驗結果以平均值土標準差表示，圖表中各組間的顯著性差異用星號表示， Plt; 0. 05 表示結果具有統(tǒng)計學意義．

3實驗結果

3.1高劑量的EA對線蟲壽命的影響

為探究高劑量的EA對線蟲壽命的影響，采用0.025～1mg/mL 的 24% EA、 81% EA對線蟲壽命的作用效果進行了評估，由表1和圖1可知，不同濃度的 24%EA，81% EA都可以抑制線蟲的壽命，且隨著處理濃度的增加，對壽命的抑制更加顯著．與空白對照組相比，處理組線蟲的平均壽命及中位生存時間均低于對照組，隨著 24%EA，81%

EA各組處理濃度的增加，線蟲平均壽命降低的百分比整體呈現(xiàn)升高的趨勢，且 81% EA各處理組線蟲的平均壽命總體上低于 24% EA各處理組線蟲的平均壽命（表1）.對比 24% EA與 81% EA同一濃度各處理組發(fā)現(xiàn)，在低濃度處理時 （0.025mg/）

mL，0.05mg/mL ，兩者差異不顯著，在高濃度處理時 （0.1mg/mL，1mg/mL） ， 81% EA對線蟲壽命的抑制效果更顯著（圖1）.以上結果表明，高劑量的EA可顯著抑制線蟲壽命，且隨著EA處理濃度和純度的增加，抑制效果越顯著.

3.2高劑量的EA對線蟲體長的影響

體長是衡量線蟲個體生長發(fā)育常見的指標之二[25].為研究高劑量的EA對線蟲生長的影響，采用 0.025～1mg/mL 的 24%EA，81% EA喂食線蟲，在第12d對線蟲的長度進行了測定.由表2可知，在12d時，相比于對照組，同一純度不同濃度或同種濃度不同純度EA處理對線蟲的體長均無顯著影響，表明EA并不會影響線蟲的正常生長.

3.3高劑量的EA對線蟲生殖能力的影響

相關研究表明，壽命與生殖能力有著一定的變化關系[26].通過喂食線蟲 0.025～1mg/mL 的24% EA、 81% EA，評估其對線蟲生殖能力的影響.結果表明其生殖高峰期與空白對照組一致，集中在3～5d，以第3d最多，并隨著線蟲年齡的增長，產卵量逐漸降低（圖2）.此外，實驗組中所有劑量EA處理組線蟲的日產卵量均低于對照組， 24% EA實驗組處理后線蟲每日產卵量較小，不同濃度差異不明顯， 81% EA實驗組處理后，隨EA處理濃度增加，線蟲每日產卵量呈下降趨勢（圖2）.不同濃度 24% EA、 81% EA處理線蟲后，線蟲總產卵量雖然均降低，呈正偏態(tài)分布，但產卵量總體較小，實驗組相較于對照組均無顯著性差異（圖3）.以上結果表明，EA可抑制線蟲的生殖能力，且隨EA處理濃度增加，抑制效果更明顯．

3.4高劑量的EA對線蟲咽泵頻率的影響

除生殖能力之外，線蟲的咽泵頻率也被認為是衰老的重要標志[27].觀察 0.025～1mg/mL 的24%EA，81% EA對線蟲咽泵頻率的影響.由圖4可知，隨著線蟲年齡的增長，空白對照組、 24% EA、 81% EA各濃度處理組線蟲的咽泵頻率總體上均逐步降低；對比相同時間內，各濃度EA處理組的咽泵頻率相較于對照組均無顯著性差異，在第13d與第31d，不同處理組下線蟲咽泵頻率無明顯變化規(guī)律；在第28d時， 81% EA處理組線蟲咽泵頻率低于 24% EA處理組，但各組之間差異不顯著，表明不同純度EA對線蟲咽泵頻率影響較小.

Thereisa significantdifference between different experimental groups，with *** Plt;0.001

3.5高劑量的EA對線蟲移動能力的影響

線蟲運動能力與機體肌肉群息息相關，直觀反映了其生長的健康狀態(tài)，所以通過加入 0.025～ 1mg/mL 的 24%EA，81% EA在第1、4、7、13、28和31d觀察對線蟲移動能力的影響．如圖5所示，空白對照組、 24%EA，81% EA各濃度處理組線蟲的移動能力隨著線蟲年齡的增長總體呈現(xiàn)降低趨勢；其中，第7d時，EA各濃度處理組線蟲的移動能力均低于空白對照組，隨著EA處理濃度的增加，對線蟲移動能力的抑制更明顯.而在第13d開始，由于線蟲運動能力下降明顯，各實驗組相較于對照組均無顯著性差異（圖5）.以上結果表明，高劑量的EA在一定程度上可抑制線蟲的移動能力，且隨EA處理濃度增加，抑制效果更明顯.

24% EA 0.1mg/mL 組因線蟲移動能力檢測實驗過程中出現(xiàn)染菌情況導致結果出現(xiàn)異常，因而不計入結果與討論中，與空白對照組相比具有顯著性差異， ^*Plt;0.05 **Plt;0.01

The 24% EA 0.1mg/mL group showed abnormal results due to bacterial contamination during the nematode mobility detection experiment，andthereforewasnotincludedintheresultsanddiscusion.Comparedwiththeblankcontrolgroup，therewasasignifi cant difference， ^*Plt;0.05 . **Plt;0.01

4討論

本研究以秀麗隱桿線蟲為模型，主要研究了不同純度（ 24% 與 81% EA）以及濃度 （0.025～1 mg/mL ）對線蟲的壽命及生理指標的影響，揭示了鞣花酸在一定濃度下會導致線蟲壽命縮短，并導致生殖能力下降和移動能力降低，而對體長和咽泵無影響.實驗結果中EA對線蟲的體長和咽泵無影響，與李金澤在EA對線蟲的抗衰老作用及其機制的研究結果相似，表明EA并不會影響線蟲的正常生長發(fā)育和對食物的攝取量28；但在本研究中，EA對線蟲壽命的抑制作用，并伴隨生理指標（運動能力和生殖能力）的下降，與以往研究中EA作為天然抗氧化劑通常表現(xiàn)出有益效應的結果存在差異[29]，分析可能由于鞣花酸濃度過高、暴露時間過長和物種代謝差異導致的.

EA在低濃度 （100μmol/L） 下可以通過胰島素/IGF-1信號通路激活抗衰老機制，上調了daf-16、hlh-30、skn-1、hsf-1等長壽調控相關基因的活性，并且進一步誘導下游的抗氧化應激基因和解毒基因sod-3、gst-4、hsp-16.2的表達水平的上調[30]，從而增強了線蟲的氧化損傷修復能力，最終延長了線蟲的壽命，并降低衰老相關功能障礙的發(fā)生率.EA可通過不同的分子機制來抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡和促進細胞毒性自噬的激活等方式發(fā)揮抗腫瘤作用，效果顯著[31].然而在高濃度下可能引發(fā)過多的活性氧積累，導致細胞損傷、DNA損傷、衰老標志物的上調以及細胞線粒體活性氧產生增多，線粒體自噬發(fā)生障礙[9].而線粒體發(fā)生功能障礙會進一步引發(fā)許多不良后果，包括誘導細胞凋亡、細胞自噬、酶體降解以及神經元功能障礙[32.在線蟲移動能力檢測中，發(fā)現(xiàn)在第7d時用 81% 0.05mg/mLEA（134μmol/L） 以及更高劑量的EA處理時，線蟲的移動能力下降明顯，而長期暴露可能加重這種效應9，在線蟲壽命檢測中，可能導致所有劑量的EA都縮短了線蟲的壽命.同樣研究表明 EA^[8] 對中國倉鼠細胞（B14）具有遺傳毒性和細胞毒性特性，用15～240μmol/LEA處理Bl4后，結果顯示所有濃度都會導致DNA損傷，細胞活力下降，但是不形成濃度依賴作用，而本研究中所有劑量（ （19.9～2680 μmol/L 線蟲生殖能力下降可能與此類遺傳毒性相關，線蟲生殖腺細胞對DNA損傷高度敏感，高劑量的EA可能通過激活ced-3和ced-4來誘導生殖細胞凋亡導致生殖力衰退[33].此外，運動能力下降與神經肌肉系統(tǒng)受損有關，可能涉及多巴胺能神經元退化或肌肉細胞鈣穩(wěn)態(tài)失調[34].

綜合線蟲的壽命及生理指標分析可知，高劑量的EA存在潛在的毒性，可抑制線蟲的壽命并在一定程度上影響線蟲的相關生理指標.EA由于對致癌和誘變的化學預防活性，被稱為天然的抗氧化劑[35]，然而也存在一些潛在的毒性作用.本研究主要集中在高劑量EA對線蟲壽命及生理指標的影響，但并未深入探討EA的具體分子機制.因此，未來的研究需結合RNA-seq篩選EA毒性相關通路，明確EA作用靶點；此外，需通過LC-MS定量分析線蟲體內EA及其代謝物濃度，比較不同純度組的生物轉化差異，并評估尿石素類代謝產物的貢獻.研究抗氧化劑最佳的作用濃度具有重要價值，旨在利用EA的有益特性，將其應用于治療中.

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（責任編輯：白林含）