DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2025.07.006

中圖分類號(hào)：TS264.24 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1000-9973（2025）07-0043-04

lsolation，Purification and Structure ldentification of Umami Peptides in Pixian Broad Bean Paste

CHEN Qiu-yue1，2， ZHANG Peng-cheng1'2，，LIN Yu-zhu1'2，， ZENG Qing1，2 ， WANG Ao-dong1'2，DONG Li1'2，ZHANG Yin^1，2 （1.College of Food and Bioengineering，Chengdu University， Chengdu 61OlO6，China; 2.Key Laboratory of Meat Processing in Sichuan Province， Chengdu University， Chengdu ，China）

Abstract： Umami peptides have an important effect on the taste of seasoning products. In order to explore the types of umami peptides in broad bean paste，Pixian broad bean paste is used as the raw material，and after homogenization，the crude peptides are isolated and purified by ultrafiltration and gel chromatography on the basis of optimizing the isolation conditions. After evaluating the umami effect of crude peptides，the peptide sequences in the components with obvious umami are determined. The results show that the isolation effect of crude peptides is better when the sample volume is 3mL and the flow rate is 5mL/min by gel chromatography. Under these conditions，a total of three components are isolated by gel chromatography，and through umami evaluation，it is found that the component F-2 shows higher umami than the other two components. After reverse chromatography purification of the component F-2，the peptide sequences are identified by LC-MS/MS，and three peptides are identified， which are IPVNRPGEPQ，DIYNPQAGR and DNVISQIH.

Key words： broad bean paste; umami peptide; umami evaluation; isolation and identification

豆瓣醬是以蠶豆、辣椒、鹽等為主要原料，經(jīng)過長時(shí)間發(fā)酵而成的調(diào)味品[1]。豆瓣醬富含多種氨基酸、蛋白質(zhì)、維生素、脂類等風(fēng)味物質(zhì)，色澤鮮紅明亮、滋味鮮辣、香味濃厚，是川菜中重要的調(diào)味品之一。近年來，郫縣豆瓣醬以其獨(dú)特的調(diào)味效果而受到學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。張玉玉等采用HS-SPME與GC-MS結(jié)合，從3種不同發(fā)酵時(shí)間的郫縣豆瓣醬中分離鑒定出88種揮發(fā)性化合物，包括醇類、酯類、酸類、醛類、烴類、酚類等。除了揮發(fā)性化合物外，Lin等[3]從6種郫縣豆瓣中還發(fā)現(xiàn)了7種常見的有機(jī)酸和18種常見的氨基酸。鮮味肽是繼鮮味被確定為第五種基本風(fēng)味后，從肉湯、豆制品等產(chǎn)品中新發(fā)現(xiàn)的對(duì)食品風(fēng)味有重要影響的肽類物質(zhì)，對(duì)人體健康也有一定的調(diào)節(jié)作用[4-5]。

莊明珠從醬油中分離出5種呈味肽，其中2種具有鮮味。胡雪瀟從蝦醬中分離出序列為Asp-Gly的二肽，該肽與食鹽復(fù)配后呈現(xiàn)出較強(qiáng)的鮮味，具有增鮮作用。廖順等[8發(fā)現(xiàn)腐乳的鮮味與小分子肽類有關(guān)，并從白腐乳中鑒定出鮮味肽Asp-Phe-Lys-Arg-Glu-Pro，但目前有關(guān)郫縣豆瓣醬中鮮味肽的研究較少。本課題組將從牛肉湯中分離鑒定的鮮味八肽在工程菌中發(fā)酵表達(dá)，建立了分離純化工藝，并從骨粉中鑒定出6種呈味肽，通過鮮味評(píng)價(jià)證明其具有酸味、咸味、苦味和澀味[9-11]。在這些研究的基礎(chǔ)上，為了評(píng)價(jià)鮮味肽對(duì)豆瓣醬呈味效果的影響，以便完善郫縣豆瓣醬的呈味機(jī)理，本文對(duì)郫縣豆瓣醬中的呈味肽進(jìn)行了水提，并采用葡聚糖凝膠層析柱進(jìn)行了分離純化，比較了分離純化后的豆瓣醬肽組分與豆瓣醬的風(fēng)味，對(duì)與豆瓣醬更近的組分進(jìn)行LC-MS-MS測序，以期為郫縣豆瓣醬中風(fēng)味物質(zhì)的研究、呈味機(jī)理的闡明和功能性肽類物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)提供參考。

1材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)材料

郫縣豆瓣醬：四川省郫縣豆瓣股份有限公司；石油醚、乙醇（均為分析純）、SephadexG-15葡聚糖凝膠玻璃管柱：上海源葉生物科技有限公司；超純水：實(shí)驗(yàn)室制備；乙腈、甲醇、甲酸（均為色譜純）：金山化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HD-3型紫外檢測儀上海嘉鵬科技有限公司；層析玻璃柱上海滬西儀器廠； 0.22μm 微孔濾膜天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；WP-UPT-2O型超純水機(jī)四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司；1260InfinityⅡ高效液相色譜儀安捷倫科技（中國）有限公司；TLG-1650 型 4^°C 冷凍離心機(jī)、ConcentratorPlus真空離心濃縮儀德國Eppendorf公司；TMR恒溫混勻儀合肥ABSON科學(xué)儀器有限公司；Lab-1A-80真空冷凍干燥機(jī)博醫(yī)康（北京）儀器有限公司；Vivaflow20O切向流超濾系統(tǒng)賽多利斯（上海）貿(mào)易有限公司；HH-6S型恒溫水浴鍋上海捷呈儀器有限公司;D-130型均質(zhì)機(jī)德國IKA公司;Easy-nLC 1200 高效液相色譜儀、Q ExactiveTMHybrid Quadrupole-OrbitrapTM Mass Spectrometer 電噴霧組合型離子阱Orbitrap質(zhì)譜儀賽默飛世爾科技公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

將豆瓣醬用均質(zhì)機(jī)打漿后按照1：4的比例加入超純水， 40°C 水浴振蕩1h后過濾，濾液在 4^°C 條件下以 8 000r/min 離心 20min ，取上清液用微孔濾膜過濾，將濾液分裝至分液漏斗中，按體積比 1：1 加人石油醚進(jìn)行脫脂處理，收集下層濾液進(jìn)行凍干，將凍干粉末溶解于蒸餾水中，用 0.22μm 微孔濾膜過濾，濾液即為水溶性物質(zhì)提取液。

1.3.2 超濾分級(jí)

1.3.1中的水溶性物質(zhì)提取液在 25°C 、0.4MPa條件下經(jīng)超濾處理后，將分子量在 以下的部分截留，收集濾液，冷凍干燥后于一 18°C 條件下保存。

1.3.3 葡聚糖凝膠色譜分離

取1.3.2中凍干粉，用超純水溶解 （20～30mg/mL） ！經(jīng) 0.22μm 水相微孔濾膜過濾后，通過SephadexG-15葡聚糖凝膠玻璃管柱進(jìn)行分離。分離條件：玻璃層析柱（內(nèi)徑 × 長度為 1.5cm×75cm ，洗脫液為雙蒸水，上樣量為 3mL ，流速為 2mL/min ，檢測波長為 220nm 分別對(duì)分離峰組分進(jìn)行收集，冷凍干燥后備用。

1.3.4 呈味效果評(píng)價(jià)[11]

由的8名成員（4女4男，年齡在 20～24 歲之間）進(jìn)行呈味效果評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)小組成員根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)《感官分析味覺敏感度的測定方法》進(jìn)行篩選。評(píng)價(jià)小組的程序包括人員招募、味道匹配測試（甜味、酸味、苦味、咸味、澀味和金屬味）基本味覺敏感度和辨別測試（咖啡因、檸檬酸鹽、氯化鈉、蔗糖和順-3-己烯-1-醇）。在確定評(píng)價(jià)員后，將1mL 豆瓣醬水解物與豆瓣醬進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)員根據(jù)刺激強(qiáng)度（0表示無，10表示非常強(qiáng)烈）進(jìn)行評(píng)分。通過SephadexG-15葡聚糖凝膠玻璃管柱的不同組分也參考豆瓣醬進(jìn)行比較。

1.3.5 液相色譜分離（RP-HPLC）

經(jīng)液相色譜進(jìn)一步分析具有較強(qiáng)風(fēng)味的葡聚糖凝膠分離組分。色譜條件： ODS-AP 300A 色譜柱；流動(dòng)相A：乙腈（含 0.1% TFA），流動(dòng)相B：水（含 0.1% TFA）;梯度洗脫： 0～18 min 2%～10% B， 18～36 min 10%～ 20%B，36～50min20%～30% B;流速為 1mL/min 上樣量為 20μL ;溫度為 30^°C ;檢測波長為 220nm。

1.3.6 LC-MS/MS測序

液相條件：色譜柱為 C₁₈ 柱 （75μm×25cm ；流動(dòng)相A為 2% 乙腈（含 0.1% 甲酸），流動(dòng)相B為 80% ACN（含 0.1% 甲酸），梯度洗脫： 0～1min 0%～5% B，1～41min 5%～23%B，41～51min 23%～29% B；流速為 300μL/min ，上樣量為 10μL 。

質(zhì)譜條件：MS掃描范圍 （m/z） ？ 200～2000u ，采集模式DDA；Top20（選擇母離子中信號(hào)最強(qiáng)的20個(gè)進(jìn)行二級(jí)碎裂）；一級(jí)質(zhì)譜分辨率70 000，AGCtarget3e6，最大注入時(shí)間 20ms ，碎裂方式HCD；二級(jí)分辨率17500，AGCtargetle5，最大注人時(shí)間 50ms ，fixed first mass：100m/z ;minimum AGC target le3，Intensity threshold 2e4動(dòng)態(tài)排除時(shí)間 18s 。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有測試均重復(fù)3次，采用SPSS24、MicrosoftExcel2017對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)采用 T 檢驗(yàn)和方差分析（One-way-ANOVA）Duncan's進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 凝膠層析分離

為了建立較優(yōu)的凝膠層析條件，本文對(duì)不同流速下分離組分的分離效果進(jìn)行了比較，所得結(jié)果見圖1。

注：a為上樣量 5mL 流速 2mL/min;b 為上樣量 5mL 、流速5mL/min;c 為上樣量 3mL 流速 5mL/min 。

由圖1中 a～c 可知，在3種層析分離條件下，各組分均能較好分離，均能分離出3個(gè)組分峰（F-1、F-2、F-3）。由此可知，該粗肽中主要含有3個(gè)組分。通過對(duì)比分離條件可知，流速越大，分離峰越集中；上樣量越少，組分的分離效果越好。綜合考慮分離度和峰形，選用上樣量 3mL 、流速 5mL/min 作為豆瓣醬中多肽的凝膠層析條件，并將這3個(gè)組分分別命名為F-1、F-2、F-3。

2.2凝膠分離組分的鮮味評(píng)價(jià)

分別將經(jīng)超濾分級(jí)后小于 3kDa 的濾液F及經(jīng)SephadexG-15凝膠層析柱分離的組分F-1、F-2和F-34個(gè)組分進(jìn)行鮮味評(píng)價(jià)，所得結(jié)果見表1。

由表1可知，經(jīng)SephadexG-15凝膠層析柱分離的組分F-2的鮮味與濾液F盡管無顯著性差異 ：Pgt;0.05： ，但是其鮮味均顯著高于組分F-1和F- ?3（Plt;0.05） 。組分F-1的鮮味較弱，F(xiàn)-3無明顯鮮味。因此，為了進(jìn)一步探明組分F-2中的鮮味肽，對(duì)F-2進(jìn)行反向色譜（RP-HPLC）分離純化。

2.3 RP-HPLC分離純化

將F-2組分采用RP-HPLC分離純化，所得色譜圖見圖2。

由圖2可知，從F-2組分中共分離出5個(gè)主要組分，在保留時(shí)間為 6.422min 處，第3個(gè)特征峰的面積較大，將此峰命名為F-2-3，并對(duì)其進(jìn)行制備后，用于序列測定。

2.4 肽的序列測定

將F-2-3組分通過液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS/MS）測序，并經(jīng)過PEAKSStudio數(shù)據(jù)庫檢索分析，共獲得450條多肽（可信度評(píng)分- -10lgPgt;20 ，選取可信度最高的3條多肽，對(duì)含有甜鮮味氨基酸的多肽進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。3條多肽的二級(jí)質(zhì)譜圖見圖3。

LC-MS/MS技術(shù)通過質(zhì)譜儀將多肽分解成不同質(zhì)荷比的離子，再利用電場和磁場將不同質(zhì)荷比的離子分開，具有分離效果好、靈敏度高、準(zhǔn)確度高的優(yōu)點(diǎn)[12]。多肽鍵中的酰胺鍵易斷裂，會(huì)產(chǎn)生較多的b和y離子，同一系列內(nèi)相鄰的離子碎片之間的質(zhì)荷比差值可以反映相應(yīng)的氨基酸信息，可根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜中b和y離子碎片，對(duì)多肽的氨基酸序列進(jìn)行解析[13]。通過LC-MS/MS測序得出，F(xiàn)-2-3組分中有3條肽的置信度較高，分別是IPVNRPGEPQ、DIYNPQAGR、DNVISQIH。因此，這3條肽很可能是郫縣豆瓣醬中的鮮味肽，但其呈味效果和鮮味閾值，本課題組將在后期做深入研究。

3結(jié)論

通過對(duì)郫縣豆瓣醬中的呈味肽進(jìn)行水提、凝膠層析后，發(fā)現(xiàn)F-2組分的鮮味評(píng)分顯著高于組分F-1和F-2（ Plt;0.05） 。在對(duì)F-2組分采用RP-HPLC進(jìn)一步分離純化后，將其中含量較高的F-2-3組分進(jìn)行富集測序，得出3種肽IPVNRPGEPQ、DIYNPQAGR、DNVISQIH。

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