中圖分類號：TS264.21 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1000-9973（2025）07-0108-07

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2025.07.016

Optimization of Koji Making Process of Camellia oleifera Seed Meal Soy Sauce and Analysis of Its Microbial Community

JIANG Xing-xu1，HOU Lu-lu2，ZHU Jing1*，HOU Shuang-shuang1 （1.College of Food Science and Engineering，Xinyang Agriculture and Forestry University， Xinyang 464ooo，China; 2. College of Management，Xinyang Agriculture and Forestry University，Xinyang 464Ooo，China）

Abstract： Camellia oleifera seed meal has high protein content and can be used as protein source for soy sauce koji making.Therefore，with Camellia oleifera seed meal and soybean as the raw materials，the ratio of raw materials （soybean ： Camellia oleifera seed meal），Aspergillus oryzae inoculation amount， watering time，koji-making temperature and koji-making time as the factors，neutral protease activity， α -amylase activity and number of spores as the indexes，fuzzy mathematics comprehensive evaluation method and response surface method are used to optimize the koji making process of Camellia oleifera seed meal soy sauce. The optimal process is the ratio of raw materials of 4：1 ，Aspergillus oryzae inoculation amount of 0.4% ，watering time of and koji-making temperature of 32^°C .After determination，the neutral protease activity is （3763.39±25.18 ） U/g ，the α -amylase activity is （2916.90±17.64）U/mL ，and the number of spores is （2.0000±0.1000）×10⁹/g . The dominant bacterial communities of Camellia oleifera seed meal soy sauce koji are Weissella，Kurthia and Aspergillus.

Key words： Camellia oleifera seed meal; fuzzy mathematics; soy sauce;koji making; microbial community analysis

油茶（Camelliaoleifera）是我國特有的木本油料植物，其產(chǎn)量和產(chǎn)值逐年穩(wěn)步增長，有重要的經(jīng)濟(jì)價值[1]。油茶籽粕是油茶榨油后的副產(chǎn)物，富含營養(yǎng)物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、茶皂素、糖類和多酚等，其蛋白質(zhì)含量為 12%～15% ，含有17種氨基酸，其中7種是人體必需氨基酸，油茶籽粕是一種潛在的優(yōu)質(zhì)植物蛋白資源 [2-3] 。此外，油茶籽粕中含有多種抗菌成分，如皂苷類、多糖類、黃酮類等，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、黑曲霉、米曲霉、枯草芽孢桿菌等致病菌均有較好的抑制作用[4-7]。目前對于油茶籽粕的研究多集中于其功能成分的提取[8-9]，很少有關(guān)于油茶籽粕發(fā)酵制品制備的研究。醬油是我國傳統(tǒng)的釀造調(diào)味品，其風(fēng)味獨特且營養(yǎng)豐富。醬油以黃豆和豆粕等植物蛋白為主要原料，以淀粉為輔料，經(jīng)米曲霉制曲發(fā)酵釀制而成。油茶籽粕蛋白質(zhì)含量豐富，可以作為醬油制曲的蛋白原料。此外，以牡丹籽粕、花生粕、核桃粕、秋葵籽粕和薏仁碎米等為原料生產(chǎn)醬油均有報道[10-14]。醬油制曲是釀造醬油的基礎(chǔ)，高品質(zhì)的成曲是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)醬油的重要條件。雖然制曲在整個生產(chǎn)過程中所占時間較短，但其所生產(chǎn)的優(yōu)勢菌和豐富的酶系為醬醪發(fā)酵提供了必要條件[15-16]。有研究表明，醬醪發(fā)酵初期存在的大部分揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)可能是在制曲發(fā)酵階段產(chǎn)生的[17]

為提高油茶籽粕的利用率，本試驗以原料配比（黃豆：油茶籽粕）米曲霉接種量、潤水時間、制曲溫度和制曲時間為因素，以中性蛋白酶活力、 α -淀粉酶活力和孢子數(shù)為指標(biāo)，考察各因素對制曲效果的影響，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以模糊數(shù)學(xué)綜合評價法得到的綜合得分為響應(yīng)值設(shè)計響應(yīng)面試驗，優(yōu)化油茶籽粕醬油制曲工藝，并通過高通量測序技術(shù)分析油茶籽粕醬油曲的微生物群落結(jié)構(gòu)，探究油茶籽粕對制曲過程中微生物的影響，以期為油茶籽粕醬油制曲提供理論指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1 材料與儀器

黃豆：依蘭縣郡澤商貿(mào)有限公司；油茶籽粕：光山縣槐店鄉(xiāng)司馬光油茶園；面粉：五得利面粉集團(tuán)有限公司；米曲霉滬釀3.042：久微食品科技（上海）有限公司；瓊脂糖、GoldView：北京夢怡美商貿(mào)中心；L-酪氨酸：天津市巴斯夫化工貿(mào)易有限公司；酪蛋白：合肥千盛生物科技有限公司；PCR試劑：紐英倫生物技術(shù)（北京）有限公司；有機(jī)溶劑均為國產(chǎn)分析純。

SPX-150-BS-Ⅱ恒溫培養(yǎng)箱上海康華生化儀器制造有限公司； FE28pH 計山東新達(dá)科學(xué)儀器有限公司；DZKW-D-2數(shù)顯恒溫水浴鍋北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；A390紫外可見分光光度計翱藝儀器（上海）有限公司；LDZW-80L-Ⅲ高壓蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠；XSP-36-1600X光學(xué)顯微鏡邁時迪（東莞）科技有限公司;XB-K-25血球計數(shù)板上海市求精生化試劑儀器有限公司；NanoDrop2OO0微量分光光度計 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；DYY-6C型瓊脂糖凝膠電泳儀北京六一儀器廠；Tanon 25O0 凝膠成像系統(tǒng)上海天能科技有限公司；ETC811PCR儀蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程

黃豆?jié)櫵瓰r水－拌入油茶籽粕－蒸煮－冷卻－拌入面粉混勻－接種米曲霉－培養(yǎng)箱培養(yǎng)－第一次翻曲－第二次翻曲－成曲。

1.2.2 操作要點

原料配比：挑選表面無霉斑、無黑斑、品質(zhì)優(yōu)良的黃豆。以 100g 為基準(zhǔn)，按照原料配比（黃豆：油茶籽粕 ）3：2 分別稱取所需重量的黃豆和油茶籽粕，備用。

黃豆?jié)櫵合螯S豆中加入1.2倍清水浸泡 3h ，黃 豆?jié)櫵疗湓w積的 1.5～2.0 倍即可。

蒸煮：將潤水后的黃豆瀝水，拌入油茶籽粕在蒸煮鍋中蒸料 1.5h 左右，直至黃豆變軟且表皮不脫落。

接種：稱取 30g 面粉，待熟料快速冷卻至 37～40°C 時，分兩次拌入面粉，便于接種時米曲霉能均勻分布在曲料表面。稱取 0.3% 米曲霉，分次撒至曲料表面并翻動，使米曲霉接種均勻。

制曲：將接種后的原料平鋪，放入培養(yǎng)箱中，調(diào)整培養(yǎng)箱溫度為 32°C ，濕度為 90% 。在放人培養(yǎng)箱 ^12h 后進(jìn)行第一次翻曲，再培養(yǎng) 19～22h 后進(jìn)行第二次翻曲，累計 36h 完成制曲。

1.2.3 油茶籽粕醬油制曲試驗設(shè)計

以原料配比（黃豆：油茶籽粕為 5：0.4：1.3：2 、2：3.1：4） 、米曲霉接種量 （0，1%，0，2%，0，3%，0，4% 0.5% ）、潤水時間 （1，2，3，4，5h） 、制曲溫度（28，30，32，34，36^°C 和制曲時間 （24，28，32，36，40h） 為因素，以醬油曲中性蛋白酶活力、 α -淀粉酶活力和孢子數(shù)為指標(biāo)，探究其對制曲效果的影響。根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計原理，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以原料配比、米曲霉接種量、潤水時間和制曲溫度為自變量，以中性蛋白酶活力 ?^α -淀粉酶活力和孢子數(shù)的模糊數(shù)學(xué)綜合得分為指標(biāo)，設(shè)計響應(yīng)面試驗，確定最佳制曲工藝。響應(yīng)面試驗因素和水平見表1。

1.2.4 指標(biāo)測定方法

中性蛋白酶活力：參照GB/T28715—2012中的中性蛋白酶測定方法。以不含酪氨酸作為空白，酪氨酸的濃度為橫坐標(biāo) （x） ，酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度為縱坐標(biāo) （y） A繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y 0.010 1x-0.003（R²=0.999 5） ，線性關(guān)系良好。

α -淀粉酶活力：參照GB1886.174——2016中的 α -淀粉酶活力測定方法。

孢子數(shù)：參考劉晶晶[18]的測定方法，采用血球計數(shù)板法測定。精準(zhǔn)稱取種曲 1g （精確至 0.002g） ，倒人 250mL 錐形瓶中，加入無菌玻璃珠、 .5mL 無水乙醇 、20mL 無菌水、 10mL 低濃度硫酸，充分振蕩搖勻，使分生孢子分散，然后用多層紗布過濾，反復(fù)沖洗，使濾渣中不含孢子，然后將含有孢子的濾液定容至500mL 。吸取稀釋后的樣品液1滴，滴于血球計數(shù)板上進(jìn)行計數(shù)。

1.2.5 制曲品質(zhì)的綜合得分

參考邵良偉等[19]的方法，設(shè)試驗組別集為 X= （204號 （x₁，x₂，x₃，…，x₂₉） ，影響油茶籽粕醬油制曲的因素集為 U=（u₁，u₂，u₃），u₁ 表示中性蛋白酶活力， u₂ 表示 α -淀粉酶活力， u₃ 表示孢子數(shù)。對于組別 x_i∈X ，按第 j 個因素 u_j∈U 進(jìn)行測度，得到 Ψ_Xi 條件下關(guān)于因素 u_j 的數(shù)據(jù) x_ij ，從而構(gòu)成模糊數(shù)學(xué)信息矩陣 A= （X_ij）_29×3 。對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行規(guī)范化處理：

式中： X_ijmax 表示在影響因素 u_j 下 x_ij 中的最大值； r_j 表示在影響因素 u_j 下 r_ij 中的最大值。

權(quán)重集計算方法如下：

式中： ω_j（j=1，2，3） 表示因素 u_j 的權(quán)重，且 表示各組數(shù)據(jù)與最大值的差的平方。

綜上，確定油茶籽粕制曲品質(zhì)模糊數(shù)學(xué)評價綜合得分：

2，3，…，29） 。

1.2.6 微生物檢測

1.2.6.1 DNA提取和PCR擴(kuò)增

醬油曲樣品中DNA的提取使用HiPureSoilDNA提取試劑盒。利用細(xì)菌引物341F（ 5^′ -CCTACGGGN-GGCWGCAG- 3^′ ）和806R（ 5^′. -GGACTACHVGGGTW-TCTAAT- ?3^′ ）擴(kuò)增16SrDNA基因的 V3～V4 區(qū)，利用真菌引物ITS1-F（ 5^′ -CTTGGTCATTTAGAGGAAG-TAA- 3^′ 和ITS2R 5^′ -GCTGCGTTCTTCATCGATGC- 3^′ ）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增體系 Reaction Buffer，10 μL （204號 High GC Enhancer，1.5μL2.5mmol/L dNTPs，1.5μL上下游引物 （10μmol/L） 0.2μL High-Fidelity DNA Polymerase， 50ng 模板DNA（補 ddH₂O 至 50μL） 。擴(kuò)增條件： 95°C 5min;95°C 個循環(huán)，最后 72°C 7min 。

1.2.6.2 高通量測序

使用 2% 瓊脂糖凝膠評估擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)量。委托廣州基迪奧生物科技有限公司IlluminaNovaSeq6Ooo平臺進(jìn)行高通量測序。通過QIIME（version1.9.1）進(jìn)行OTU（operationaltaxonomicunit）劃分并進(jìn)行物種注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1油茶籽粕醬油制曲單因素試驗結(jié)果

2.1.1原料配比對油茶籽粕制曲效果的影響原料配比對制曲效果的影響見圖1。

由圖1可知，隨著混料中油茶籽粕占比的增加，中性蛋白酶活力、 α -淀粉酶活力和孢子數(shù)均呈先上升后下降的趨勢，并在原料配比為 4：1 時達(dá)到峰值。原料中蛋白質(zhì)對米曲霉具有誘導(dǎo)作用，誘導(dǎo)作用與蛋白質(zhì)的含量、種類有關(guān)，同時微生物對原料的利用程度也存在差異[20]，各指標(biāo)隨著油茶籽粕占比的繼續(xù)增加而減小，可能與微生物難以利用原料中的營養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)。

2.1.2米曲霉接種量對油茶籽粕制曲效果的影響

米曲霉是醬油制曲中的主要微生物，其接種量對制曲效果的影響見圖2。

由圖2可知，中性蛋白酶活力、 α -淀粉酶活力和孢子數(shù)在米曲霉接種量為 0.4% 時均達(dá)到峰值。繼續(xù)增加米曲霉接種量，一方面，有限的營養(yǎng)物質(zhì)難以為米曲霉的生長提供所需的營養(yǎng)；另一方面，會造成微生物間的競爭而不利于發(fā)酵產(chǎn)酶。

2.1.3潤水時間對油茶籽粕制曲效果的影響黃豆?jié)櫵畷r間對制曲效果的影響見圖3。

由圖3可知，中性蛋白酶活力、 α -淀粉酶活力和孢子數(shù)隨著潤水時間的延長整體呈先上升后下降的趨勢。潤水時間過長時，原料吸水量增大，加速了米曲霉的生長和繁殖，同時產(chǎn)生的熱量過多，使豆曲出現(xiàn)結(jié)塊現(xiàn)象。結(jié)塊后的豆曲熱量不易散發(fā)，不利于米曲霉后續(xù)的生長繁殖，導(dǎo)致酶活力和孢子數(shù)降低。

2.1.4制曲溫度對油茶籽粕制曲效果的影響制曲溫度對制曲效果的影響見圖4。

由圖4可知，隨著制曲溫度的升高，中性蛋白酶活力 ?α -淀粉酶活力和孢子數(shù)均呈先上升后下降的趨勢。制曲溫度對醬油制曲的效果尤為重要。當(dāng)制曲溫度過低時，米曲霉的發(fā)芽、生長緩慢，當(dāng)制曲溫度過高時，會加速曲料中水分的喪失，并導(dǎo)致米曲霉中對溫度敏感的蛋白質(zhì)、核酸等出現(xiàn)不可逆損傷，甚至造成菌絲死亡[21]。

2.1.5制曲時間對油茶籽粕制曲效果的影響制曲時間對制曲效果的影響見圖5。

由圖5可知，中性蛋白酶活力、 Ω_?α -淀粉酶活力和孢子數(shù)均在制曲時間為 36h 時達(dá)到最大值。米曲霉從孢子發(fā)芽到后熟的整個過程中需要一定的時間才能形成酶系比較齊全的高效組合體系[22]，制曲時間過長或過短均不利于米曲霉的生長。制曲時間過短時，微生物對原料的利用不足，進(jìn)而導(dǎo)致微生物分泌酶系不足，酶活力較低。制曲時間過長時，曲料中的水分和營養(yǎng)物質(zhì)減少，米曲霉生長受到阻礙，且部分菌絲會出現(xiàn)老化的現(xiàn)象。

2.2油茶籽粗醬油制曲響應(yīng)面試驗結(jié)果

綜合單因素試驗和模糊數(shù)學(xué)綜合評價結(jié)果，選擇對油茶籽粕醬油制曲效果影響較大的因素：原料配比（A）、米曲霉接種量（B）、潤水時間（C）和制曲溫度 （D）₄ 個因素作為自變量，以醬油曲品質(zhì)的綜合得分作為響應(yīng)值設(shè)計響應(yīng)面試驗。響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果見表2。

2.2.1 回歸方程的建立與方差分析

利用Design-Expertvl3.1.O軟件對表2中試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以中性蛋白酶活力、 α -淀粉酶活力和孢子數(shù)的模糊數(shù)學(xué)綜合得分為響應(yīng)值，得到擬合方程：綜合得分 ?=88.55-0.242 5A-0.048 3B-0.014 2C+0.21 1 ^7D+ 0 ）.1575AB-0.6175AC+0.7525AD+0.0625BC+1.77BD+ 1.39CD-1.65A²-2.38B²-1.49C²-2.90D² ?；貧w模型方差分析見表3。

由表3可知，模型的 P 值 lt;0.000 1 ，失擬項的 P 值 0.1754gt;0.05 ，說明模型極顯著，據(jù)此得出該模型的預(yù)測值和實際值較符合，試驗結(jié)果可靠。同時由 P 值可得出，原料配比、米曲霉接種量、潤水時間和制曲溫度的二次項對結(jié)果的影響均極顯著，交互項 AD 對結(jié)果的影響顯著，BD、CD對結(jié)果的影響均極顯著。各因素對醬油曲品質(zhì)的綜合得分影響的主次順序為原料配比gt;制曲溫度 gt; 米曲霉接種量 gt; 潤水時間。

各因素交互作用對油茶籽粕制曲效果影響的響應(yīng)面圖見圖6。

由圖6可知，交互項 AD 、 BD 、 CD 對結(jié)果的影響顯著，響應(yīng)面反映的各因素之間的交互作用結(jié)果與回歸方程分析結(jié)果一致。

2.2.2 驗證試驗

根據(jù)響應(yīng)面試驗結(jié)果，得到醬油制曲最佳工藝條件為原料配比 3.09：1.91 、米曲霉接種量 0.407 3% 、潤水時間 3.877h 、制曲溫度 32.296^°C ，此時綜合得分預(yù)測值為87.074分。基于實際工藝的可行性，將最優(yōu)工藝調(diào)整為原料配比 3：2 、米曲霉接種量 0.41% 、潤水時間 3.9h 制曲溫度 32°C ，測得中性蛋白酶活力為 （3735.54±28.35） ） U/g α -淀粉酶活力為 （2885.65±19.72）U/mL ，孢子數(shù)為（1.6500±0.1250）×10⁹ 個/g，綜合得分為87.15分。響應(yīng)面試驗得出的最優(yōu)結(jié)果低于試驗組24，綜合分析，選擇原料配比 4：1 、米曲霉接種量 0.4% 、潤水時間 ⁴h 、制曲溫度 32°C 為最佳工藝。

2.3傳統(tǒng)制曲與油茶籽粕制曲微生物群落分析結(jié)果

2.3.1微生物群落多樣性（ ?- 多樣性）分析

對油茶籽粕醬油曲（CO）和黃豆醬油曲（CK）進(jìn)行16SrDNA、ITS高通量測序，分別獲得78354，117348條優(yōu)化序列和991，113個OTUs，高通量序列覆蓋率gt;99% ，表示結(jié)果可靠。Chaol和Ace指數(shù)表示物種的豐度，Shannon和Simpson指數(shù)表示群落的多樣性，另外，微生物群落的復(fù)雜性與Chaol、Ace、Shannon指數(shù)呈正相關(guān)，與Simpson指數(shù)呈負(fù)相關(guān)。由表4可知，油茶籽粕對醬油曲微生物群落豐度和多樣性的影響不大。

2.3.2 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

由圖7中A可知，兩種醬油曲在屬水平上的優(yōu)勢菌均為魏斯氏菌（Weissella）、庫特氏菌（Kurthia）、腸桿菌（Enterobacter）、葡萄球菌（Staphylococcus）和芽孢桿菌（Bacillus）。胡傳旺[23]發(fā)現(xiàn)在釀造醬油制曲階段，菌群主要由米曲霉、乳酸菌、葡萄球菌和芽孢桿菌組成。Wang等[24]通過宏基因組學(xué)測序發(fā)現(xiàn)，制曲階段共存在29個細(xì)菌屬，其中優(yōu)勢菌為庫特氏菌、魏斯氏菌和葡萄球菌。韓月婷等[15]認(rèn)為醬油曲中優(yōu)勢菌群為魏斯氏菌和葡萄球菌。油茶籽粕醬油曲中魏斯氏菌和庫特氏菌占比分別為 63.91% 和 16.90% ，其在黃豆醬油曲中占比分別為 20.82% 和 65.49% 。庫特氏菌能產(chǎn)生蛋白酶和揮發(fā)性脂肪酸，屬于嚴(yán)格好氧性細(xì)菌，溶氧量不足將抑制其生長[24]。魏斯氏菌作為乳酸菌的一種，在制曲發(fā)酵階段進(jìn)行乳酸發(fā)酵，分泌多種酶系，作為曲霉酶系的補充，促進(jìn)原料水解，對有機(jī)酸、酯類和短鏈脂肪酸等風(fēng)味物質(zhì)的生成有著重要意義[25]。油茶籽粕醬油曲中占比較高的魏斯氏菌可能對后期醬油風(fēng)味產(chǎn)生有利影響。腸桿菌可發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸或產(chǎn)氣，推測為風(fēng)味產(chǎn)生菌[26-27]。葡萄球菌是豆類發(fā)酵食品風(fēng)味的主要貢獻(xiàn)者之一，其主要參與酸性化合物和氨基酸的生成[28]。芽孢桿菌在醬油發(fā)酵過程中可以協(xié)助真菌分解原料中的蛋白質(zhì)和淀粉，是醬油中醬香風(fēng)味形成的基礎(chǔ)[29]。由圖7中B可知，因制曲過程中添加了米曲霉，測得兩種醬油曲中曲霉菌（Aspergillus）的相對豐度 gt;99.9% 。

3結(jié)論

本試驗以油茶籽粕和黃豆為原料，選擇原料配比（黃豆：油茶籽粕）、米曲霉接種量、潤水時間、制曲溫度和制曲時間為因素，以中性蛋白酶活力、 α -淀粉酶活力和孢子數(shù)為指標(biāo)，結(jié)合模糊數(shù)學(xué)綜合評價法和響應(yīng)面法優(yōu)化油茶籽粕醬油制曲的最佳工藝，最佳工藝為原料配比 4：1 、米曲霉接種量 0.4% 、潤水時間 、制曲溫度 32^°C ，測得中性蛋白酶活力為 α -淀粉酶活力為 （2916.90±17.64）U/mL ，孢子數(shù)為（2.0000±0.1000）×10⁹ 個/g。油茶籽粕醬油曲優(yōu)勢菌群為魏斯氏菌（Weissella）庫特氏菌（Kurthia）和曲霉菌（Aspergilus）。油茶籽粕的添加對醬油曲微生物群落豐度和多樣性的影響不大。油茶籽粕醬油曲中占比較高的魏斯氏菌可能對后期醬油風(fēng)味產(chǎn)生有利影響。綜上，用油茶籽粕代替?zhèn)鹘y(tǒng)醬油制曲的蛋白質(zhì)原料是可行的，既提高了油茶籽粕的利用率，又為后續(xù)研究提供了依據(jù)。

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