Analysis of Vibrio parahaemolyticus Detection in Commercially Available Oysters

SU Yanlan

（GuangdongHongke Testing Technology Co.，Ltd.，Huizhou 516ooo， China）

Abstract： Vibrio parahaemolyticus is a foodborne pathogen that can easily cause bacterial food poisoning. In order tounderstand the contamination status of Vibrio parahaemolyticus in oysters，reducetherisk offoodborne diseases，and provide scientific basis for the safe consumption of oysters，this study tested oyster samples sold in the market.The results showed that among the 16 randomly purchased oysters，3 were detected with Vibrio parahaemolyticus， with a detection rate of 18.8% .The high detection rate of Vibrio parahaemolyticus in oyster samples in this study indicates that there is acertain food safety risk assciated with consuming raw oysters，which should be taken seriously.

Keywords： Vibrio parahaemolyticus; food-borne pathogens; oyster

牡蠣，俗稱(chēng)生蠔、蠔等，在我國(guó)沿海地區(qū)均有分布，是廣東省重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)貝類(lèi)[1]。牡蠣軟體部富含優(yōu)質(zhì)蛋白，其蛋白質(zhì)含量是牛奶的2～3倍，具有“海底牛奶”之稱(chēng)[2]。牡蠣肉質(zhì)鮮嫩、味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，深得廣大消費(fèi)者喜愛(ài)。部分消費(fèi)者喜歡生食牡蠣，然而牡蠣是一種濾食性雙殼類(lèi)動(dòng)物，通過(guò)鰓過(guò)濾大量水體以獲取食物，在此過(guò)程中容易富集環(huán)境中的藻類(lèi)和微生物。一旦水體受到致病微生物污染，不僅會(huì)導(dǎo)致牡蠣本身感染發(fā)病，還可能通過(guò)食物鏈傳播給人類(lèi)，對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成潛在風(fēng)險(xiǎn)。

副溶血性弧菌是養(yǎng)殖貝類(lèi)中最常見(jiàn)的致病性弧菌[。該菌廣泛存在于海水以及蝦、貝類(lèi)等海產(chǎn)品中，屬于嗜鹽性細(xì)菌。研究表明，副溶血性弧菌在 6% NaC1和 8%NaCl 條件下生長(zhǎng)旺盛，在 0%NaCl 和10%NaCl 條件下生長(zhǎng)受限甚至被抑制[4]。此外，該菌對(duì)環(huán)境條件敏感，在冷凍保鮮過(guò)程中易發(fā)生亞致死損傷，在環(huán)境適宜時(shí)，損傷的菌體又會(huì)復(fù)蘇，容易引發(fā)細(xì)菌性食物中毒，對(duì)食品安全造成潛在危害[5]。

臨床上，副溶血性弧菌感染主要表現(xiàn)為急性發(fā)病、嘔吐、腹瀉等，嚴(yán)重時(shí)可能導(dǎo)致感染者脫水、休克甚至死亡。通常，人們?cè)诟腥竞?24～72h 發(fā)病，多數(shù)人癥狀較為輕微，一般可以自行恢復(fù)，但對(duì)于小孩、老年人等免疫力低下的人群，可能導(dǎo)致嚴(yán)重并發(fā)癥，甚至死亡。本研究根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)副溶血性弧菌檢驗(yàn)》（GB4789.7—2013）[4]，對(duì)隨機(jī)采購(gòu)的16份牡蠣進(jìn)行檢測(cè)與分析，以掌握牡蠣中副溶血性弧菌的污染情況，為科學(xué)評(píng)估牡蠣的食用安全性提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

牡蠣，購(gòu)于養(yǎng)殖場(chǎng)。副溶血性弧菌ATCC17802（標(biāo)準(zhǔn)菌株），購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限公司。

3% 氯化鈉堿性蛋白陳水（APW）、TCBS瓊脂、弧菌顯色培養(yǎng)基（VA）、 3% 氯化鈉胰蛋白陳大豆瓊脂（TSA），北京陸橋技術(shù)有限公司；氧化酶試劑，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；革蘭氏染色液試劑盒、副溶血性弧菌干制生化鑒定試劑盒，北京陸橋技術(shù)有限公司；氯化鈉，上海滬試實(shí)驗(yàn)室器材股份有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

YXQ-100A立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；BBS-SDC醫(yī)用潔凈工作臺(tái)，BIOBASE；BSC-1500IIA2-X生物安全柜，BIOBASE；YP10002百分之一電子天平，上海佑科儀器儀表有限公司；ShockMixer-1高速振蕩樣品前處理器，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；labdancer圓周振蕩器，IKA；ECLIPSE10O顯微鏡，尼康；BSP-250生化培養(yǎng)箱，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)副溶血性弧菌檢驗(yàn)》（GB4789.7—2013）[4檢測(cè)方法，對(duì)副溶血性弧菌進(jìn)行測(cè)定。

1.3.1 配制培養(yǎng)基

3% 氯化鈉堿性蛋白陳水（APW）：稱(chēng)取 40.0g 于1L蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，分裝， 121^qC 高壓滅菌 10min ；TCBS瓊脂：稱(chēng)取 89.1g 于1L蒸餾水中，加熱煮沸滅菌；弧菌顯色培養(yǎng)基（VA）：稱(chēng)取 6.02g 干粉于 100mL 蒸餾水中，加熱煮沸滅菌； 3% 氯化鈉胰蛋白脈大豆瓊脂（TSA）：稱(chēng)取65.0g 于1L蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，分裝，121^°C 高壓滅菌 15min 。

1.3.2 樣品制備和增菌

將牡蠣放入自來(lái)水中刷洗外殼，隨后用無(wú)菌水沖洗，甩干表面水分。在醫(yī)用潔凈工作臺(tái)中，用滅過(guò)菌的刀具無(wú)菌打開(kāi)牡蠣外殼，取出全部?jī)?nèi)容物，包括牡蠣肉和體液。

無(wú)菌操作取 24.50～25.49g 上述樣品于無(wú)菌均質(zhì)袋中，加入 225mL3%NaCl 堿性蛋白肺水，于高速振蕩樣品前處理器中均質(zhì)，制成 1：10 樣品勻液;同時(shí)，挑取傳代好的副溶血性弧菌工作菌株置于 3% NaC1堿性蛋白肺水中均質(zhì)混勻，作為陽(yáng)性對(duì)照；將樣品勻液和陽(yáng)性對(duì)照分別置于（ 36±1 ） C 的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 8～18h 0

1.3.3 劃線(xiàn)分離

用接種環(huán)蘸取上述培養(yǎng)后的 3%NaCl 堿性蛋白脈水，劃線(xiàn)接種于TCBS瓊脂平板和弧菌顯色培養(yǎng)基平板；先處理樣品，再接種陽(yáng)性對(duì)照。將接種好的TCBS瓊脂平板和弧菌顯色培養(yǎng)基平板倒置于（ 36±1 ） °C 的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 18～24h 。

1.3.4純培養(yǎng)及生化鑒定

對(duì)有可疑菌落的樣品、陽(yáng)性對(duì)照，分別劃線(xiàn)接種于 3% NaC1胰蛋白脈大豆瓊脂平板，將平板倒置于（ 36±1 ） °C 的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 18～24h 從 3% NaC1胰蛋白陳大豆瓊脂平板上挑取純培養(yǎng)的菌落進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)、革蘭氏染色鏡檢、生化試劑盒鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1劃線(xiàn)分離結(jié)果分析

培養(yǎng) 24h 的兩種平板上的菌落特征見(jiàn)表1。根據(jù)菌落特征可知，1、2、3、4、5、8、10、12、13號(hào)和15號(hào)樣品中有可疑菌落（TCBS瓊脂平板：菌落表面光滑、半透明、圓形、綠色；弧菌顯色培養(yǎng)基平板：紫紅色菌落），需要進(jìn)行純培養(yǎng)及生化鑒定驗(yàn)證；6、7、9、11、14號(hào)和16號(hào)樣品中無(wú)可疑菌落，故不做純培養(yǎng)及生化鑒定驗(yàn)證。

2.2 鑒定結(jié)果及樣品結(jié)果分析

根據(jù)GB4789.7—2013及副溶血性弧菌干制生化鑒定試劑盒說(shuō)明書(shū)，對(duì)有可疑菌落，且鑒定結(jié)果為“氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性，革蘭氏染色鏡檢陰性、無(wú)芽孢， 3%NaCl TSI斜面產(chǎn)堿、底層產(chǎn)酸、不產(chǎn)氣、不產(chǎn)硫化氫， 3%NaCl 半固體陽(yáng)性， 0%ΔNaCl 胰脈水陰性（不生長(zhǎng)）， 6%NaCl 胰脈水陽(yáng)性（生長(zhǎng)）， 8% NaC1胰肺水陽(yáng)性（生長(zhǎng)）， 10%NaCl 胰肺水陰性（不生長(zhǎng)或微弱生長(zhǎng)），葡萄糖陽(yáng)性，蔗糖陰性，乳糖陰性，甘露醇陽(yáng)性，氨基酸對(duì)照黃色，賴(lài)氨酸脫羧酶陽(yáng)性，鳥(niǎo)氨酸脫羧酶陽(yáng)性，精氨酸雙水解酶陰性，V-P陰性，ONPG陰性”的樣品判定為檢出副溶血性弧菌。

綜合表1、表2、表3結(jié)果，1、2、15號(hào)樣品結(jié)果符合副溶血性弧菌現(xiàn)象，故判定1、2、15號(hào)樣品檢出副溶血性弧菌；3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14號(hào)和16號(hào)樣品結(jié)果不符合副溶血性弧菌現(xiàn)象，故判定未檢出副溶血性弧菌。也就是，在16份牡蠣中，有3份檢出副溶血性弧菌。

3結(jié)論

本研究結(jié)果表明，牡蠣中的副溶血性弧菌檢出率為 18.8% ，存在微生物感染風(fēng)險(xiǎn)，生食牡蠣，容易引發(fā)食物中毒。需要指出的是，本研究?jī)H采集了16份樣品，樣本量有限，存在一定的隨機(jī)誤差，研究結(jié)果可能不具有代表性。不同來(lái)源、不同批次或不同季節(jié)的樣品，其污染情況可能存在差異。因此，研究結(jié)果尚不足以全面反映牡蠣中副溶血性弧菌的整體污染水平。未來(lái)研究應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，并結(jié)合不同產(chǎn)地、不同季節(jié)及養(yǎng)殖方式等變量，開(kāi)展系統(tǒng)性監(jiān)測(cè)，以提高研究的科學(xué)性和代表性。

研究表明，在 56^°C 加熱 5min ，或在 90^°C 加熱1min ，可有效殺滅副溶血性弧菌[7]。因此，建議消費(fèi)者食用牡蠣時(shí)，應(yīng)盡量充分加熱，降低副溶血性弧菌感染風(fēng)險(xiǎn)；采購(gòu)牡蠣時(shí)，應(yīng)優(yōu)先選擇新鮮、外殼完整、無(wú)異味的牡蠣，對(duì)于有異味、變色、殼開(kāi)口的牡蠣，應(yīng)舍棄不食用；采購(gòu)的牡蠣?wèi)?yīng)盡快食用，避免微生物滋生，降低食源性疾病風(fēng)險(xiǎn)。

參考文獻(xiàn)

[1]古小莉，徐瑞文，李惠青，等.廣東沿海養(yǎng)殖牡蠣中副溶血性弧菌的污染狀況、毒力基因及耐藥性分析[J]海洋環(huán)境科學(xué)，2022，41（6）：865-871.

[2]李旭東，彭吉星，吳海燕，等.牡蠣中營(yíng)養(yǎng)、呈味及功能成分研究進(jìn)展[J].水產(chǎn)科學(xué)，2022，41（4）：682-694.

[3]張穎雪，蘇潔，樊景鳳，等.海水養(yǎng)殖貝類(lèi)弧菌病流行暴發(fā)及其環(huán)境影響因素研究進(jìn)展[J].海洋環(huán)境科學(xué)，2020，39（3）：480-487.

[4]國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)，食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)副溶血性弧菌檢驗(yàn)：GB4789.7—2013[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2013.

[5]楊平，黃靜敏，陳晶，等.海產(chǎn)品中4種副溶血性弧菌檢驗(yàn)方法的研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2019（8）：238-239.

[6]王燕春.副溶血性弧菌引發(fā)食源性疾病的病原學(xué)檢測(cè)及同源性研究[J].中國(guó)食品工業(yè)，2024（7）：107-109.

[7]梁思源，袁敏，徐斐，等.生食貝類(lèi)水產(chǎn)品中副溶血性弧菌的半定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[J].工業(yè)微生物，2017，47（3）：59-65.