The relationship between CX3CR1 expression in peripheral blood and recurrence after CAR-T therapyinpatientswith diffuse large B-cell lymphoma

BUYajing1，XIAO Min2， QINDehua'，SHI Changli’，LIU Songya2，MENG Li2 （DepartmentofRadiotherapy Gamma Knife，Zhengzhou University'sFifthAfiliated Hospital，Henan450052; 2Departmentof Hematology，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong Universityof Science and Technolog

[Abstract]Objective：To investigate the relationship between chemokine C-X3-C-motif receptor1（CX3CRl） expresioninperipheral bloodandrecurrenceafterchimericantigenreceptorT-cell immunotherapy （CAR-T）inpatients with difuse large B-cellymphoma （DLBCL）.Methods：Among 124 DLBCL patients treated with CAR-Ttherapy，44casesrecurred within one year， and the recurrence rate was 35.48% . The clinical features and peripheral blood CX3CR1 expression levels of patients in therecurrencegroupandthenon-recurrence group were compared，and therelationship between peripheral blood CX3CRlexpressionandtheriskofrecurrenceafter CAR-Ttreatment wasanalyzed.Theclinicalfeaturesof patients withdiferentexpressionlevelsofperipheralbloodCX3CR1werecompared，andthecorrelationbetweenperipheralblood CX3CR1 expression and recurrenceafter CAR-Ttreatment wasanalyzed.Result：The neutrophil to lymphocyte ratio （NLR），serum lactate dehydrogenase （LDH）， β₂ -microglobulin （ β₂- MG），CX3CR1 levelsin peripheral blood and the proportionofnonremisionafterinitial treatment intherecurrence group were higher thanthose inthenon-recurrence group at admission （all P lt;0.05）.The restrictive cubic spline analysis showed that when the expression of CX3CR1 in peripheral blood was≥2O85.40mg/mL，theriskofrecurrenceafterCAR-Ttherapyinpatients increasedwith theriseof its expresion.Thepatients with CX3CR1expression in peripheralblood ≥2085.40 mg/mL were classifiedas the high expresion group，while the patients with low CX3CR1 expression were classified as thelow expression group.The levelsof NLR， serum LDH， B₂ -MG atadmission，and the proportion of non remission after initial treatment in the high expression group were higher than those in the low expression group （ P： lt;0.05）.COX regression analysis showed that high expression of CX3CR1 inperipheral blood was an independent risk factorfor recurrence inDLBCLpatientsafter CAR-Ttherapy（ P lt;0.05）. Conclusion：Therecurrenceof DLBCL patientsafterCAR-Ttherapy isassociatedwith expressionof peripheral blood CX3CR1，and high CX3CR1 expression may indicate a higher risk of recurrence after treatment.

[Key Words]chemokine（C-X3-C-motif） receptorl;difuse large B-cellymphoma; chimericantigenreceptorT-cell immunotherapy; recurrence

非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkinlymphoma，NHL）具有高度異質性，可發(fā)生于各個年齡段，發(fā)病率隨年齡增長而增加，約占惡性淋巴瘤的 90% ，其中彌漫大B 細胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lym-phoma，DLBCL）是最常見的類型u。治療NHL的方式包括化療、放療、造血干細胞移植等，但對于復發(fā)/難治性患者療效欠佳，2年生存率僅為 20% 2。近年來腫瘤免疫治療，特別是嵌合抗原受體T細胞免疫療法（chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T取得巨大進展。有報道顯示，CAR-T治療復發(fā)/難治性NHL患者的完全緩解率為 43%～59% ，但其中 60% 患者仍會復發(fā)，2年生存率僅 50.5%^[3-5] 。

目前，有關NHL的實驗室指標較多，主要包括炎癥指標、腫瘤標志物、免疫指標等。近年來研究顯示，廣泛分布在單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和自然殺傷細胞上的趨化因子受體1［chemokine（C-X3-C-motif）receptor1，CX3CR1]，在調節(jié)免疫細胞行為中起著關鍵作用，可作為免疫治療效果的評價指標。李好等研究顯示，CX3CR1表達上調預示腫瘤免疫治療效果不佳，推測CX3CR1可能與NHL患者CAR-T治療后復發(fā)有一定關系。本研究選取2021年9月一2023年9月在華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院接受CAR-T治療的DLBCL患者124例為對象，分析外周血CX3CR1表達與復發(fā)的關系。

1資料與方法

1.1一般資料納入標準：（1）符合《中國淋巴瘤治療指南（2021年版）》關于DLBCL診斷標準，經病理組織活檢確診；（2）復發(fā)或難治性DLBCL（對標準一線治療原發(fā)耐藥或治療12個月內復發(fā)）；（3）經造血干細胞移植二線治療后達到部分緩解；（4）年齡≥18歲;（5）疾病分期為Ⅲ＼～V期;（6）接受CAR-T治療。排除標準：（1）合并心、肝、腎等重要臟器疾病、自身免疫疾病或免疫缺陷疾病；（2）妊娠或哺乳期女性；（3）存在腦轉移及骨髓侵犯；（4）嚴重凝血功能異常；（5）患有癲癇或其他中樞神經疾??；（6）近2周使用過全身性類固醇藥物和免疫抑制劑。剔除和脫落標準：（1）未完成規(guī)范治療者；（2）治療期間未遵循注意事項或治療后預防措施不足者；（3）中途退出研究、失訪者。研究期間剔除脫落4例，最終124例納入統計分析。

收集患者臨床特征，包括性別、年齡、體質量指數、疾病分期、疾病狀態(tài)、CAR-T治療方式（二線、二線以上）既往治療次數、初始治療效果[參照《中國彌漫大B細胞淋巴瘤診斷與治療指南（2013年版）》中的療效標準，將完全緩解、部分緩解定義為緩解，疾病穩(wěn)定、疾病進展定義為未緩解]CAR-T治療后有無感染［參照《CAR-T細胞治療惡性血液病指南（2024）》[中感染的診斷標準，包括細菌、病毒、侵襲性真菌、肺孢子蟲感染丁、入院時實驗室指標[血清鐵蛋白、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH） 微球蛋白（ -microglobulin， β₂ -MG）中性粒細胞與淋巴細胞比值（neutrophil-to-lymphocyteratio，NLR）免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）水平、外周血CD4+細胞、CD8+細胞」。本研究方案經華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準，患者與家屬簽署知情同意書。

1.2實驗室指標檢測患者入院后，采集外周肘靜脈血 5mL ，凝固后離心取血清，采用膠體金法（廈門為正生物科技股份有限公司試劑盒）檢測鐵蛋白水平，乳酸法（長沙協大生物科技有限公司試劑盒）檢測LDH水平，免疫熒光法（南京諾爾曼生物技術股份有限公司試劑盒）檢測 β₂-MG 水平，免疫比濁法（寧波醫(yī)杰生物科技有限公司試劑盒）檢測IgA水平，采用SK8800全自動血液分析儀（深圳市盛信康科技有限公司）檢測外周血中性粒細胞和淋巴細胞計數，計算NLR，BDFACSCanto流式細胞儀（碧迪醫(yī)療有限公司）檢測外周血 CD4⁺ 細胞、 .CD8⁺ 細胞數量。

1.3外周血CX3CR1檢測患者入院后采集外周肘靜脈血 5mL ，乙二胺四乙酸二鈉抗凝， 3500r/min 離心 20min ，分離血漿，儲存在 -80^°C 低溫冰箱待檢。設各濃度CX3CR1標準品： 1000ng/mL.500ng/mL （20 16.125ng/mL，0ng/mL ，以標準品濃度作為橫坐標，OD值作為縱坐標，繪制標準曲線。測定樣品OD值，根據標準曲線獲得CX3CR1濃度。

1.4CAR-T治療和隨訪采集患者外周血單個核細胞，經體外分選、轉染、擴增等過程制備針對CD19抗原的第2代CAR-T細胞，10＼～14d后回輸。回輸前所有患者給予FC方案（氟達拉濱、環(huán)磷酰胺）預處理，間歇1d后輸注CAR-T細胞。治療后1個月進行首次隨訪，1年內每3個月隨訪1次。隨訪內容包括血常規(guī)、生化全項、影像學檢查、CAR-T細胞存續(xù)情況檢查以及復發(fā)情況。復發(fā)標準：出現任何新病變或侵犯部位增大 ?50% 判定為復發(fā)。

1.5觀察指標 （1）比較復發(fā)組與未復發(fā)組患者臨床特征及外周血CX3CR1表達。（2）分析外周血CX3CR1表達與CAR-T治療后復發(fā)風險的關聯強度劑量-反應關系。（3）比較外周血CX3CR1不同表達水平患者臨床特征。（4）分析外周血CX3CR1表達與CAR-T治療后復發(fā)的相關性。

1.6統計學處理應用SPSS25.0統計軟件分析數據。經Shapiro-Wilk或K-S正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料以 表示，組間比較采用獨立樣本 Φ_t 檢驗；計數資料以 n（%） 描述，組間比較采用 χ² 檢驗；采用限制性立方樣條法分析外周血CX3CR1表達與CAR-T治療后復發(fā)風險的關聯強度劑量-反應關系；采用COX回歸模型分析外周血CX3CR1表達與CAR-T治療后復發(fā)的相關性 Plt;0.05 為差異有統計學意義。

2結果

2.1復發(fā)組與未復發(fā)組一般資料及外周血CX3CR1表達比較治療后1年內復發(fā)44例，未復發(fā)80例，復發(fā)率為 35.48% 。復發(fā)組入院時NLR、血清LDH、β₂-MG 水平、外周血CX3CR1水平、初始治療未緩解占比高于未復發(fā)組，差異均有統計學意義（ Plt;0.05 ）。見表1。

2.2外周血CX3CR1表達與治療后復發(fā)風險的關聯強度劑量-反應關系分析采用限制性立方樣條模型分析，圖1橫坐標為外周血CX3CR1表達的連續(xù)變化，縱坐標為DLBCL患者CAR-T治療后復發(fā)風險比值比（HR），可見CAR-T治療后復發(fā)風險與外周血CX3CR1表達呈近J型非線性劑量-反應關系0 （Plt;0.05） ，當外周血CX3CR1水平 ≥2 085.40mg/mL 時，NHL患者CAR-T治療后復發(fā)風險隨其表達水平的升高而增加。

2.3外周血CX3CR1不同表達水平患者臨床特征比較以外周血CX3CR1表達與NHL患者CAR-T治療后復發(fā)風險劑量-反應的閾值作為分界值，58例入院時 CX3CR1gtrsim2085.40mg/mL 為高表達組，66例入院時 CX3CR1lt;2 085.40mg/mL 為低表達組。高表達組NLR、血清 LDH，β₂-MG 水平、初始治療未緩解占比高于低表達組，差異均有統計學意義（ Plt; 0.05）。見表2。

2.4COX回歸分析外周血CX3CR1表達與CAR-T治療后復發(fā)的關系將NLR、血清 LDH，β_?B₂-MG 外周血CX3CR1、初始治療效果作為自變量，CAR-T治療后復發(fā)作為因變量（變量賦值如表3所示）。COX回歸分析結果顯示，外周血CX3CR1高表達是DLBCL患者CAR-T治療后復發(fā)的獨立危險因素（Plt;0.05） 。見表4。

3討論

隨著CAR-T在NHL治療中的應用，目前患者的生存率和治愈率得到進一步提高，但部分患者治療后復發(fā)仍是重要難題。本研究對接受CAR-T治療的124例DLBCL患者進行分析，結果顯示，治療后有44例術后1年內復發(fā)，復發(fā)率為 35.48% ，與SCHUSTER等報告的復發(fā)率相近，說明DLBCL患者CAR-T治療后復發(fā)率仍處于較高水平，需要尋找與CAR-T治療后復發(fā)有關的因素。

有研究指出，結合患者疾病類型、炎癥反應、生化指標等能對NHL患者CAR-T治療后復發(fā)風險進行評估[。本研究比較復發(fā)與未復發(fā)患者的臨床特征發(fā)現，復發(fā)組NLR、血清LDH、 β₂ -MG水平、外周血CX3CR1水平、初始治療未緩解占比高于未復發(fā)組，初步證明NLR、血清 LDH，β₂-MG 水平、外周血CX3CR1水平、初始治療效果與CAR-T治療后復發(fā)有關。COX回歸模型校正其他因素后，顯示外周血CX3CR1高表達為DLBCL患者CAR-T治療后復發(fā)的獨立危險因素。

CX3CR1主要分為膜結合性及可溶性兩種類型，表現獨特的激活構象，膜結合性CX3CR1有助于單核細胞以及T細胞黏附，使得流體狀態(tài)下的白細胞可固定并黏附于血管壁；而可溶性CX3CR1則對單核細胞和T細胞產生強趨化作用，參與多種生理和病理過程[3]。多項研究表明，CX3CR1與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展存在密切關系，通過影響免疫細胞的遷移和浸潤，降低免疫細胞殺傷腫瘤細胞的能力，導致病情進展[14-15]。本研究結果顯示，當外周血CX3CR1水平 gtrsim2085.40mg/mL 時，患者CAR-T治療后的復發(fā)風險增加。高表達的CX3CR1與其配體結合，激活下游信號通路，不僅直接促進腫瘤細胞的存活和增殖，還通過改變免疫細胞功能和腫瘤微環(huán)境，間接推動疾病進展，從而增加患者CAR-T治療后復發(fā)風險。此外，CX3CR1高表達通過與其配體的相互作用，將巨噬細胞吸引到腫瘤部位，引發(fā)腫瘤血管生成和炎癥反應，促進NHL細胞增殖、侵襲、遷移，從而增加CAR-T治療后復發(fā)風險[。

本研究發(fā)現，CX3CR1高表達組患者人院時NLR、血清 LDH，β₂-MG 水平、初始治療未緩解占比高于低表達組。NHL患者在CAR-T治療前的腫瘤負荷和疾病狀態(tài)會影響治療效果，初始治療未緩解患者腫瘤高負荷，使CAR-T治療后復發(fā)風險增加；β₂ -MG、LDH作為臨床常用的淋巴瘤相關血清標志物，反映患者腫瘤增殖情況;NLR反映體內炎癥狀態(tài)和免疫系統激活狀態(tài)[。若發(fā)現DLBCL患者NLR、血清 水平較高，或初始治療未緩解，應重視對這類患者外周血CX3CR1表達進行監(jiān)測，若呈高表達，提示CAR-T治療后可能存在高復發(fā)風險，可以嘗試采取通過改善腫瘤微環(huán)境、聯合免疫檢查點抑制劑或放化療等綜合性措施，降低CX3CR1表達，預防復發(fā)的發(fā)生。

綜上所述，DLBCL患者CAR-T治療后復發(fā)與外周血CX3CR1表達水平有關，CX3CR1高表達可能提示CAR-T治療后復發(fā)風險較高。

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[收稿日期]2025-03-25（本文編輯趙喜）