曲莖石斛（Dendrobiumflexicaule）為多年生蘭科（Orchidaceae）石斛屬（DendrobiumSw.）植物，是我國1986年在伏牛山新發(fā)現(xiàn)的物種[，秦巴山區(qū)稱之為“金釵石斛\"2。曲莖石斛為藥食同源植物，以莖入藥，具有抗腫瘤、活血化瘀、治療糖尿病、降血壓、降血糖、抗衰老、提高免疫力等功能[3-8。野生曲莖石斛喜溫濕，多生于海拔較高的陰坡、半陰坡山溝和溪流的巖石或懸崖石壁上，數(shù)量稀少。加之多年來人為采掘嚴(yán)重，自然繁殖率低，野生資源瀕危滅絕[9-10]。2021年，國家林業(yè)和草原局頒布的《國家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄》將曲莖石斛列為一級(jí)保護(hù)野生植物。曲莖石斛還被《中國物種紅色名錄》和《世界自然保護(hù)聯(lián)盟瀕危物種紅色名錄》列為極危物種，是瀕于滅絕的中草藥植物[11-12]

目前，國內(nèi)外對(duì)于曲莖石斛的研究多為其藥用價(jià)值方面，在組織培養(yǎng)研究中對(duì)曲莖石斛涉及較少，多為鐵皮石斛及其他石斛品種。本研究以曲莖石斛具節(jié)莖段為材料，通過建立曲莖石斛組織培養(yǎng)無菌體系探究適宜的外植體消毒方法，并篩選曲莖石斛具節(jié)莖段腋芽誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基配方，為曲莖石斛離體組織培養(yǎng)、快速繁育以及種質(zhì)資源保護(hù)提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料采自河南省南陽市農(nóng)業(yè)科技示范園區(qū)溫室栽培的曲莖石斛壯苗。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1外植體材料預(yù)處理選取長(zhǎng)勢(shì)健壯的曲莖石 斛新鮮莖段，去掉莖段節(jié)處葉片，用鑷子輕輕將膜質(zhì) 葉鞘剝?nèi)ィ舫杉s 10cm 的具節(jié)莖段[13]

1.2.2外植體消毒將預(yù)處理好的曲莖石斛外植體莖段放在燒杯中，用薄紗布封口在流水下沖洗30min ，再將外植體莖段放于 200mL 小燒杯中，用洗潔精水浸泡 30min ，然后用蒸餾水沖洗干凈轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)待用。外植體莖段的消毒方法如下：

方法一：用 75% 酒精浸泡 30s ，蒸餾水沖洗3次，然后用 0.1%HgCl₂ 浸泡 4.7，10，13min ，蒸餾水沖洗5次。

方法二：用 75% 酒精浸泡 30s ，蒸餾水沖洗3次，然后用 1% NaClO浸泡 12，16，20min ，蒸餾水沖洗5次。

方法三：用 75% 酒精浸泡 30s ，蒸餾水沖洗3次，然后用必潔仕牌二氧化氯消毒劑（原液）浸泡4、7.10min ，蒸餾水沖洗5次。

1.2.3外植體接種用剪刀將消毒處理過的曲莖石斛莖段剪成長(zhǎng)約 2cm 的具節(jié)莖段，在酒精燈火焰附近打開培養(yǎng)基蓋子，將瓶口傾斜接近水平方向并不斷轉(zhuǎn)動(dòng)用火焰灼燒瓶口，用鑷子夾取外植體莖段，將其形態(tài)學(xué)下端接種到培養(yǎng)基上，深度約 0.5cm 培養(yǎng)基配方為 玉米素 +3% 蔗糖 +0.8% 瓊脂，每瓶接種2個(gè)外植體，每個(gè)消毒時(shí)間接種12瓶，重復(fù)2次。接種好的材料轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)室培養(yǎng)兩周。

1.2.4腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)以MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)置4種腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方，一組空白對(duì)照（表1）。曲莖石斛無菌莖段培養(yǎng)兩周后，選取生長(zhǎng)良好的初始無菌培養(yǎng)物為外植體，轉(zhuǎn)接到腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每個(gè)處理接種11瓶，每瓶接種1個(gè)外植體，2個(gè)重復(fù)。將材料放到無菌室培養(yǎng)，溫度 25^°C ，光照時(shí)間 10h/d ，光照強(qiáng)度為 1500～2000lx ，培養(yǎng)1個(gè)月。

1.2.5數(shù)據(jù)分析消毒的曲莖石斛外植體培養(yǎng)兩周后統(tǒng)計(jì)消毒效果數(shù)據(jù)，包括污染率、成活率以及污染菌源類型；無菌培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)30d后，統(tǒng)計(jì)不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的曲莖石斛莖段腋芽誘導(dǎo)情況，包括腋芽誘導(dǎo)率、污染莖段數(shù)、褐化莖段數(shù)以及腋芽生長(zhǎng)情況。所有數(shù)據(jù)用Excel軟件分析處理，采用SPSS26.0方差分析，應(yīng)用Duncan法進(jìn)行多重比較，用標(biāo)記字母法進(jìn)行差異顯著性分析。

污染率 ?= （污染外植體莖段數(shù)/接種外植體莖段總數(shù) 1×100%

成活率 ?= （成活外植體莖段數(shù)/接種外植體莖段總數(shù) 1×100%

腋芽誘導(dǎo)率 ?= （誘導(dǎo)出芽的外植體莖段數(shù)/接種外植體莖段總數(shù) 1×100%

2結(jié)果與分析

2.1曲莖石斛無菌體系建立由表2可知，3種消毒處理方法差異顯著， 0.1%HgCl₂ 處理組整體表現(xiàn)佳。在 0.1%HgCl₂ 處理中， 7.13min 處理污染外植體數(shù)只有8個(gè)，污染率為 16.67% ，最低，但處理13min 有兩個(gè)莖段死亡，表明 0.1%HgCl₂ 消毒時(shí)間過長(zhǎng)可能會(huì)對(duì)外植體莖段產(chǎn)生毒害作用；處理10min 污染莖段數(shù)10個(gè)，污染率為 20.83% ，理論上， 0.1%HgCl₂ 消毒 10min 污染率應(yīng)低于 7min 的，但實(shí)際結(jié)果與之相反，可能是操作誤差導(dǎo)致。其次是1% NaClO組， 12，16，20min 消毒處理污染率都在90% 以上，消毒效果較差。二氧化氯消毒劑外植體莖段污染率隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，但消毒效果明顯低于 HgCl₂ 處理組。

如圖1所示，不同消毒試劑處理曲莖石斛外植體莖段污染效果有所不同， 0.1%HgCl₂ 處理的外植體污染程度較輕，多為真菌性污染（圖1A），同樣消毒時(shí)間處理下二氧化氯消毒劑處理污染程度較重（圖1B）。使用 0.1%HgCl₂ 消毒處理 7min ，材料污染率最低，為最適外植體消毒方案。

2.2曲莖石斛腋芽誘導(dǎo)研究不同激素濃度及配比對(duì)曲莖石斛腋芽誘導(dǎo)影響結(jié)果如表3所示，與CK相比，不同處理均有利于曲莖石斛腋芽誘導(dǎo)。由圖2可以看出，培養(yǎng)基配方A和C組中健壯腋芽數(shù)比配方B和D高，說明NAA濃度 0.3mg/L 比 0.6mg/L 處理效果好，當(dāng)6-BA濃度一定時(shí)，較高濃度的NAA會(huì)抑制腋芽誘導(dǎo)效果；A比C腋芽長(zhǎng)勢(shì)好且健壯腋芽數(shù)多，B比D腋芽長(zhǎng)勢(shì)好，說明當(dāng)NAA濃度一定時(shí)，較高濃度的6-BA會(huì)抑制腋芽誘導(dǎo)效果。 C，D ）CK組分別有1個(gè)外植體污染，轉(zhuǎn)移的外植體為無菌莖段，少數(shù)的污染可能是由于操作失誤。對(duì)照組誘導(dǎo)出33個(gè)腋芽，長(zhǎng)勢(shì)較弱小，近半數(shù)外植體僅誘導(dǎo)出約 0.5cm 的芽尖，且外植體長(zhǎng)出大量不定根（圖3）。綜合結(jié)果表明，A配方即 1mg/L 6-BA 和 0.3mg/L NAA激素濃度配比效果最佳，腋芽誘導(dǎo)率達(dá)到了100% ，且腋芽生長(zhǎng)健壯。

3討論

探究了曲莖石斛的外植體消毒方法和芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基配方。外植體消毒選擇使用 0.1%HgCl₂ ，1% NaClO、二氧化氯3種消毒劑[14-16，通過設(shè)置不同的時(shí)間梯度，增加消毒劑類型，便于對(duì)比分析以篩選最適外植體消毒方案。研究發(fā)現(xiàn)，使用 消毒劑處理曲莖石斛外植體莖段的消毒效果不好，可在后續(xù)研究中提高消毒劑含量和消毒時(shí)間以優(yōu)化消毒方案。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度及配比對(duì)腋芽誘導(dǎo)起重要作用，高濃度的細(xì)胞分裂素和低濃度的生長(zhǎng)素配合有利于腋芽誘導(dǎo)[7。本研究通過添加6-BA、玉來素和NAA以探究不同植物激素組合與含量水平對(duì)曲莖石斛外植體莖段的腋芽誘導(dǎo)效果，發(fā)現(xiàn) 1mg/L 6-BA+0.3mg/LNAA+0.2mg/L 玉米素的誘導(dǎo)效果最佳，表明低濃度的6-BA和NAA有利于曲莖石斛腋芽發(fā)生，誘導(dǎo)效果較好，可以作為曲莖石斛莖段腋芽誘導(dǎo)的適宜培養(yǎng)基配方。本研究結(jié)果可為曲莖石斛的離體組織培養(yǎng)和快繁提供參考依據(jù)。

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【基金項(xiàng)目】：河南省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（232102310336）；南陽師范學(xué)院實(shí)驗(yàn)室開放項(xiàng)目（SYKF2023063）。

郭國業(yè)，何瀟宇，王夢(mèng)，劉怡辰，景小藝，蘇曼玉，賀秀芬，吳佳瑩，丁宇煊，南陽師范學(xué)院，郵編473061（河南）；尹英英，國有南陽市黃石庵林場(chǎng)。