摘要：本研究在已有桑遺傳轉(zhuǎn)化體系的基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，以提高轉(zhuǎn)化效率，為后續(xù)?；蚬δ苎芯考胺肿佑N奠定基礎(chǔ)。首先分別從發(fā)根農(nóng)桿菌種類、外植體類型、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、侵染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間五個(gè)方面對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的桑遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行優(yōu)化，再構(gòu)建MaCYP90A -pBI121質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌誘導(dǎo)發(fā)根以驗(yàn)證優(yōu)化體系的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，優(yōu)化后的桑遺傳轉(zhuǎn)化條件為：采用OD600為0.6的農(nóng)桿菌LBA9402菌液侵染預(yù)培養(yǎng)2d的無菌桑苗真葉10 min，共培養(yǎng)時(shí)間為2d。在此優(yōu)化條件下，毛狀根誘導(dǎo)率可達(dá)到84.5 1％。同時(shí)利用該體系將重組質(zhì)粒MaCYP90A-pBI121轉(zhuǎn)化至桑葉中，經(jīng)熒光定量PCR分析，陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因毛狀根中MaCYP90A摹因表達(dá)量為空白對(duì)照的39.97倍。綜上，本研究成功對(duì)已有桑遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了優(yōu)化，毛狀根誘導(dǎo)率相比優(yōu)化前（30.21％）提高了1.8倍，可為后續(xù)?；蚬δ苎芯?、次生代謝物合成途徑解析以及分子育種提供技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞：桑；遺傳轉(zhuǎn)化體系；發(fā)根農(nóng)桿菌；毛狀根誘導(dǎo)；轉(zhuǎn)基因

中圖分類號(hào)：S888.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2025） 03-0027-10

桑（Morus alba L．）為桑科桑屬落葉喬木，廣泛分布于我國(guó)大部分地區(qū)，尤其是山東、江蘇、浙江等養(yǎng)蠶地區(qū)。桑葉富含生物堿、黃酮、多糖等次生代謝物質(zhì)，具有疏散風(fēng)熱、清肺潤(rùn)燥、清肝明目等功效。其中生物堿1-脫氧野尻霉素（1 -deoxynOJirlmycin，DNJ）具有降血糖、抗腫瘤、調(diào)節(jié)脂代謝、延緩衰老等藥理作用，常作為桑樹資源藥效品質(zhì)的評(píng)價(jià)指標(biāo)：另外，DNJ也是?？寡料x以及抑制美國(guó)白蛾幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育及繁殖的主要成分。雖然目前發(fā)現(xiàn)植物中桑的DNJ含量最高，但也僅為0.1%～0.5%，不能滿足市場(chǎng)需求。因此，選育活性物質(zhì)含量高的桑樹品種，對(duì)于促進(jìn)桑產(chǎn)品的精深加工和開發(fā)、推動(dòng)桑產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

DNJ屬于哌啶類多羥基生物堿，江蘇大學(xué)藥學(xué)院歐陽(yáng)臻教授課題組前期挖掘并鑒定出DNJ生物合成途徑中多個(gè)關(guān)鍵功能酶基因MaLADC、MaCAO、MaSDRs、MaMTs、MaCYP71BG22，解析了賴氨酸到（2R，4R） -2-甲基哌啶-4醇的生物合成途徑。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，利用桑遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得含有目的基因的毛狀根，不僅可以從分子層面調(diào)節(jié)植物的DNJ合成，提高活性物質(zhì)的含量，還可以縮短育種年限，這為解決桑中DNJ及其他活性物質(zhì)含量不能滿足市場(chǎng)需求的問題提供了新思路。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法因操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、基因沉默現(xiàn)象少等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于植物遺傳轉(zhuǎn)化。2010年，孔衛(wèi)青等首次建立了發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的桑遺傳轉(zhuǎn)化體系，利用發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC10060侵染桑子葉誘導(dǎo)其發(fā)根，但誘導(dǎo)率僅為17%;此后，方榮俊等將桑樹乙烯轉(zhuǎn)錄因子MaERF1轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌ATCC15834，并對(duì)發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的桑遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行優(yōu)化，以研究桑樹逆境脅迫下的應(yīng)答機(jī)制及次生代謝物質(zhì)變化，但依舊存在轉(zhuǎn)化效率低等問題，誘導(dǎo)率只有56%：歐陽(yáng)臻教授課題組利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的桑遺傳轉(zhuǎn)化體系對(duì)桑葉中短鏈脫氫酶（SDR）進(jìn)行功能驗(yàn)證時(shí)也發(fā)現(xiàn)了發(fā)根率低、發(fā)根周期長(zhǎng)、外源基因影響大等問題?？梢?，現(xiàn)有的桑遺傳轉(zhuǎn)化體系轉(zhuǎn)化效率較低，易受外植體類型、農(nóng)桿菌類型等因素的影響。

建立穩(wěn)定的桑遺傳轉(zhuǎn)化體系是完整解析桑中活性成分生物合成途徑和提高產(chǎn)量的前提，因此，在前期工作基礎(chǔ)上，本研究從農(nóng)桿菌菌株、外植體類型、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間五方面對(duì)已有桑遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行優(yōu)化，以提高遺傳轉(zhuǎn)化效率、縮短發(fā)根周期，同時(shí)利用歐陽(yáng)臻教授課題組前期篩選得到的可能參與DNJ生物合成途徑的MaCYP90A基因進(jìn)一步驗(yàn)證該體系的穩(wěn)定性，以期為后續(xù)?；蚬δ苎芯亢头肿佑N提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2022年7月至2023年12月在江蘇大學(xué)藥學(xué)院進(jìn)行。供試桑種子采于江蘇大學(xué)桑樹園，經(jīng)藥學(xué)院歐陽(yáng)臻教授鑒定為?？浦参锷＃∕o-rus alba L．）的種子。所用發(fā)根農(nóng)桿菌菌株為L(zhǎng)BA9402、R1600、R1601、C58C1，于-80℃冰箱保存。過表達(dá)載體pBI121 -EGFP購(gòu)自豐暉生物股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無菌桑苗的獲得

選取適量桑種子于燒杯中浸泡一晚，次日洗去種皮，依次用75%乙醇、10%次氯酸鈉溶液分別進(jìn)行2 min、9 min的消毒處理，無菌水清洗多次：將種子表面水分擦干后轉(zhuǎn)接于MS固體培養(yǎng)基上，置于濕度69%、溫度（25±1）℃、光照3 000 lx、光周期為光照16 h/黑暗8h的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，30 d左右可長(zhǎng)出茁壯桑苗，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 侵染液的制備

取不含目的基因的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株LBA9402、R1600、R1601分別于含50mg/L卡那霉素（Kan）的YEB平板上劃線培養(yǎng)，取菌株C58C1于含20 mg/L利福平（Rif）的YEB平板上劃線培養(yǎng)，均于28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2d。挑取單菌落于1 mL YEB（含對(duì)應(yīng)抗生素）液體培養(yǎng)基中28℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)16～18 h，然后按照1：100的比例將上述農(nóng)桿菌菌液擴(kuò)大，每?jī)尚r(shí)測(cè)一次菌液在600 nm波長(zhǎng)處的吸光值，繪制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)曲線。同時(shí)吸取1 mL擴(kuò)大前的菌液于20 mL YEB（含對(duì)應(yīng)抗生素）液體培養(yǎng)基中活化至OD600值為0.6，在28℃、4 000 xg條件下離心5 min，棄上清，收集菌體，加入含終濃度100 μmol/L乙酰丁香酮（AS）的MS液體培養(yǎng)基20 mL重懸菌體，28℃、200 r/min振蕩活化30min，用于侵染桑的外植體。

1.2.3 桑遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化試驗(yàn)

基于參考文獻(xiàn)[16]中的桑遺傳轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。遺傳轉(zhuǎn)化步驟如下：將外植體置于MS固體培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)：用無菌針頭將外植體表面均勻刺破后浸入農(nóng)桿菌菌液中，在28 0C搖床上200 r/min振蕩侵染：將外植體取出，用無菌紙吸干表面菌液，轉(zhuǎn)接于MS固體培養(yǎng)基（含終濃度100 μmol/L AS）上，置于25℃、黑暗條件下共培養(yǎng)；共培養(yǎng)結(jié)束后取出，用含300 mg/L頭孢噻肟鈉（Cef）的無菌水清洗多次，然后轉(zhuǎn)入含終濃度500 mg/L Cef[篩選陽(yáng)性毛狀根則需加入終濃度為2.5 mg/L的潮霉素（Hyg）]的MS固體培養(yǎng)基上，25℃暗培養(yǎng)，每7d繼代一次，10 d后外植體創(chuàng)口處開始出現(xiàn)白點(diǎn)，25 d后統(tǒng)計(jì)毛狀根誘導(dǎo)率（產(chǎn)生毛狀根的外植體數(shù)÷受侵染的外植體總數(shù)×100%）。

共設(shè)計(jì)五項(xiàng)單因素試驗(yàn)和一項(xiàng)正交試驗(yàn)，具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：

（1）發(fā)根農(nóng)桿菌菌株的篩選：以無菌桑苗真葉為外植體，置于MS固體培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)2d，分別用OD600為0.6的LBA9402、R1600、R1601、C58C1菌液侵染10 min，用無菌紙將真葉表面菌液吸干后置于MS+100 μmol/L AS固體培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2d。其余條件同上，25 d后統(tǒng)計(jì)毛狀根誘導(dǎo)率，以篩選最適發(fā)根農(nóng)桿菌。每處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)45個(gè)外植體樣本。

（2）桑外植體的篩選：將無菌桑苗的真葉、子葉剪成0.5～1.0 cm2小塊，莖段剪成0.5～1.0 cm小段，分別用作外植體，置于MS固體培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)2d，農(nóng)桿菌菌液侵染10 min后用無菌紙將外植體表面菌液吸干，然后置于MS+100 μmol/L AS固體培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2d。其余條件同上，25 d后統(tǒng)計(jì)毛狀根誘導(dǎo)率，篩選最適外植體類型。每處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)45個(gè)外植體樣本

（3）預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的篩選：以無菌桑苗真葉為外植體，置于MS固體培養(yǎng)基上分別預(yù)培養(yǎng)1、2、3d，農(nóng)桿菌菌液侵染10 min后用無菌紙將外植體表面菌液吸干，置于MS+100 μmol/L AS固體培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2d。其余條件同上，25 d后統(tǒng)計(jì)毛狀根誘導(dǎo)率，篩選最適預(yù)培養(yǎng)時(shí)間。每處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)45個(gè)外植體樣本

（4）侵染時(shí)間的篩選：以無菌桑苗真葉為外植體，置于MS固體培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2d，農(nóng)桿菌菌液分別侵染5、10、15、20 min后用無菌紙將外植體表面菌液吸干，置于MS+100 μmol/L AS固體培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2d。其余條件同上，25 d后統(tǒng)計(jì)毛狀根誘導(dǎo)率，篩選最適侵染時(shí)間。每處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)45個(gè)外植體樣本

（5）共培養(yǎng)時(shí)間的篩選：以無菌桑苗真葉為外植體，置于MS固體培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2d，農(nóng)桿菌菌液侵染10 min后用無菌紙將外植體表面菌液吸干，置于MS+100 μmol/L AS固體培養(yǎng)基上分別共培養(yǎng)1、2、3、4d。其余條件同上，25 d后統(tǒng)計(jì)毛狀根誘導(dǎo)率，篩選最適共培養(yǎng)時(shí)間。每處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)45個(gè)外植體樣本

（6）預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間的正交試驗(yàn)：設(shè)置預(yù)培養(yǎng)時(shí)間（1、2、3 d）、侵染時(shí)間（5、10、15 min）、共培養(yǎng)時(shí)間（1、2、3 d）三因素三水平正交試驗(yàn)，根據(jù)毛狀根誘導(dǎo)率獲得三因素的最優(yōu)組合。

1.2.4 MaCYP90A基因的克隆

提取新鮮桑葉總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA作為PCR的模板。根據(jù)本課題組前期轉(zhuǎn)錄組分析獲得的MaCYP90A基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以賽默飛的Taq DNA Polymerase高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見表1，反應(yīng)體系見表2。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min;94℃30 s，60℃30 s，72℃96 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.20-/0瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)并進(jìn)行膠回收。

1.2.5 MaCYP90A基因過表達(dá)載體的構(gòu)建

將MaCYP90A基因膠回收產(chǎn)物與pMD18 -T載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5ce感受態(tài)細(xì)胞中。挑取陽(yáng)性單克隆菌落于10 mL LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒，利用BamH I和Kpn I限制性內(nèi)切酶對(duì)連接成功的MaCYP90A - 18T質(zhì)粒以及過表達(dá)載體pBI121-EGFP進(jìn)行雙酶切，雙酶切產(chǎn)物經(jīng)T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。

1.2.6 桑轉(zhuǎn)基因毛狀根的驗(yàn)證

將MaCYP90A/pBI121-EGFP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌，利用優(yōu)化后的遺傳轉(zhuǎn)化體系誘導(dǎo)發(fā)根。提取毛狀根總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板，利用表3中發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒上的誘根基因rol B、rol C及過表達(dá)載體pBI121-EGFP上的報(bào)告基因EGFP的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。反應(yīng)體系：2x SanTaq PCR Mix 12.5 μL，菌液2μL，正、反向引物各1 μL，Nuclease - freeH20 8.5μL，共計(jì)25μL。PCR反應(yīng)程序：94℃5min;94℃30 s，58℃（rol B、rol C基因）或64℃（EGFP基因）30 s，72 0C 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃7 min;4℃保存。同時(shí)利用過表達(dá)載體pBI121 -EGFP具有EGFP增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的特點(diǎn)，通過熒光顯微鏡觀察桑葉毛狀根中綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。

1.2.7 桑陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因毛狀根的除菌培養(yǎng)

將陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因毛狀根轉(zhuǎn)移到含終濃度500 mg/L Cef和2.5 mg/L Hyg的MS固體篩選培養(yǎng)基，25℃暗培養(yǎng)，每7d繼代一次，每次培養(yǎng)的Cef濃度以100 mg/L的梯度遞減，直至培養(yǎng)基中無菌落出現(xiàn)。除菌結(jié)束后可將毛狀根轉(zhuǎn)移至MS液體培養(yǎng)基，于25℃、80 r/min搖床上培養(yǎng)或-80℃保存，用于后續(xù)研究。

1.2.8 桑陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因毛狀根中MaCYP90A基因的表達(dá)分析

以陽(yáng)性毛狀根的cDNA作為模板進(jìn)行熒光定量PCR（qRT-PCR）分析，所用引物見表4。反應(yīng)體系（20μL）：2x SYBR Green AbstartPCR Mix 9μL，cDNA 2μL，正、反向引物各1μL，Nuclease-free H2O 7μL。反應(yīng)程序：95℃5 min，95℃15 s;60℃20 s，72℃15 s，95℃10 s，45個(gè)循環(huán)；65℃60 s，97℃1 s；37 0C 30 s。采用2-ΔΔCt法計(jì)算MaCYP90A基因在轉(zhuǎn)基因毛狀根中的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計(jì)分析，Origin 2021軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 無菌桑苗的培養(yǎng)

桑苗培養(yǎng)歷程見圖1。桑種子接種3d后開始露白，6d時(shí)長(zhǎng)出約1 cm的芽，30 d左右長(zhǎng)成高4～6 cm的無菌桑苗。

2.2 發(fā)根農(nóng)桿菌生長(zhǎng)曲線

挑取農(nóng)桿菌LBA9402、R1600、R1601、C58C1的單菌落于YEB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，繪制不同菌株的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果見圖2。該4種菌株生長(zhǎng)曲線均呈“S”形，總體來說，在0-4 h生長(zhǎng)緩慢，OD600為0.078～0.473;6～12 h菌液OD600值快速上升，OD600為0.473～1.487，菌株處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：12 h后菌株處于生長(zhǎng)穩(wěn)定期，表明農(nóng)桿菌復(fù)制速度降低并開始產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物。因此，本研究選擇OD600值為0.6時(shí)的菌液用于桑侵染，此時(shí)農(nóng)桿菌處于快速生長(zhǎng)期，其誘導(dǎo)桑愈傷組織生根的效率較高。

2.3 不同因素對(duì)桑毛狀根誘導(dǎo)率的影響

2.3.1 不同菌株對(duì)桑毛狀根誘導(dǎo)率的影響

本試驗(yàn)選用LBA9402、R1600、R1601、C58C1四種發(fā)根農(nóng)桿菌分別侵染無菌桑苗的真葉外植體，結(jié)果（圖3、圖4）顯示，菌株對(duì)桑毛狀根誘導(dǎo)率的影響顯著。其中，菌株R1600、R1601無法誘導(dǎo)桑葉外植體發(fā)根：LBA9402菌株的誘導(dǎo)率最高，是C58C1菌株誘導(dǎo)率的4.6倍，且LBA9402的誘導(dǎo)發(fā)根周期短（比C58CI縮短了20d），外植體長(zhǎng)勢(shì)良好不易褐化。因此，選用LBA9402農(nóng)桿菌用于后續(xù)遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。

2.3.2 不同外植體類型對(duì)桑毛狀根誘導(dǎo)率的影響

選擇無菌桑苗子葉、真葉以及莖段作為誘導(dǎo)發(fā)根的外植體，比較其毛狀根誘導(dǎo)率，結(jié)果（圖3、圖4）顯示，子葉、真葉、莖段均能誘導(dǎo)發(fā)根，但是不同外植體誘導(dǎo)發(fā)根的能力有顯著差異，表現(xiàn)為真葉＞子葉＞莖段。用真葉作為外植體時(shí)最先發(fā)根，誘導(dǎo)率達(dá)到85.19％；用莖段作為外植體的誘導(dǎo)率最低，僅12. 59％，且除菌困難極易被污染。因此，選用無菌桑苗真葉用于后續(xù)遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。

2.3.3 不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)桑毛狀根誘導(dǎo)率的影響

對(duì)外植體進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)可以促進(jìn)農(nóng)桿菌誘導(dǎo)其發(fā)根，但預(yù)培養(yǎng)的時(shí)間并非越長(zhǎng)越好，因此對(duì)桑真葉外植體分別進(jìn)行1、2、3d的預(yù)培養(yǎng)，比較分析預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)毛狀根誘導(dǎo)率的影響，結(jié)果（圖3、圖4）顯示，隨著外植體預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，毛狀根誘導(dǎo)率先升后降，最佳預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為2d，此時(shí)誘導(dǎo)率為75.56％：預(yù)培養(yǎng)1d和3d的發(fā)根率無顯著差異，但均顯著低于預(yù)培養(yǎng)2d的。因此，后續(xù)遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)預(yù)培養(yǎng)天數(shù)選擇2d。

2.3.4 不同侵染時(shí)間對(duì)桑毛狀根誘導(dǎo)率的影響

為了確定適宜的侵染時(shí)間，設(shè)置侵染時(shí)間分別為5、10、15、20 min，通過對(duì)毛狀根誘導(dǎo)率的比較，結(jié)果（圖3、圖4）顯示，侵染10 min的毛狀根誘導(dǎo)率最高，為81 .48%，顯著高于其他侵染時(shí)間：侵染5、15、20 min的毛狀根誘導(dǎo)率差異不顯著，但侵染5 min時(shí)間過短，質(zhì)粒上的發(fā)根基因不易整合到植物體中，而侵染15 min及20 min則時(shí)間過長(zhǎng)，外植體軟化，不易發(fā)根且后期除菌困難。因此，后續(xù)遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)侵染時(shí)間選擇10 min。

2.3.5 不同共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)桑毛狀根誘導(dǎo)率的影響

共培養(yǎng)時(shí)間也是影響毛狀根誘導(dǎo)率的一個(gè)重要因素，共培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)使得除菌困難，植物損傷，而時(shí)間過短又會(huì)導(dǎo)致發(fā)根基因不能高效地轉(zhuǎn)入外植體中。本試驗(yàn)設(shè)置共培養(yǎng)1、2、3、4d，通過比較發(fā)現(xiàn)，桑毛狀根誘導(dǎo)率隨共培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)先升后降，共培養(yǎng)2d時(shí)毛狀根誘導(dǎo)率最高，為81.48％：共培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)則會(huì)導(dǎo)致農(nóng)桿菌滋生，污染增加（圖3、圖4）。因此，后續(xù)遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)共培養(yǎng)天數(shù)選擇2d。

2.3.6 正交試驗(yàn)

結(jié)果（表5）表明，三個(gè)因素對(duì)桑毛狀根誘導(dǎo)率的影響大小為侵染時(shí)間＞共培養(yǎng)時(shí)間＞預(yù)培養(yǎng)時(shí)間，在預(yù)培養(yǎng)2d、侵染10 min、共培養(yǎng)2d條件下毛狀根誘導(dǎo)率最高，達(dá)到84.51%。因此，確定桑遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化因素為：選用發(fā)根農(nóng)桿菌LBA9402侵染預(yù)培養(yǎng)2d的無菌桑苗真葉，侵染10 min后再經(jīng)2d的共培養(yǎng)。

2.4 桑葉MaCYP90A基因克隆與重組質(zhì)粒構(gòu)建

以桑葉總RNA逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在1 440 bp處有單一亮帶（圖5），與預(yù)計(jì)大小一致，說明擴(kuò)增成功。將MaCYP90A與克隆載體pMD18-T連接后采用通用引物M13對(duì)菌液進(jìn)行PCR驗(yàn)證，在1 500 bp左右有單一亮帶（圖6A），與預(yù)計(jì)大小一致，說明目的基因與pMD18-T載體連接成功。用BamH I和Kpn I限制性內(nèi)切酶對(duì)其進(jìn)行雙酶切，分別在1 500 bp（目的基因）、2 692 bp（pMD18-T）出現(xiàn)亮帶（圖6B），說明雙酶切成功。將目的基因膠回收產(chǎn)物與過表達(dá)載體pBI121-EGFP連接，連接產(chǎn)物經(jīng)雙酶切，分別在1 500 bp（目的基因）、10 000 bp（過表達(dá)載體）附近出現(xiàn)條帶（圖6C），說明MaCYP90A/pBI121-EGFP過表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.5 轉(zhuǎn)基因毛狀根的PCR鑒定

轉(zhuǎn)基因毛狀根誘導(dǎo)過程見圖7。取0.1 g新鮮轉(zhuǎn)基因毛狀根提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板，以發(fā)根基因rol B和rol C的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果分別在423 bp和626 bp出現(xiàn)單一亮帶（圖8），與Ri質(zhì)粒上發(fā)根基因rol B和roZ C的大小吻合，表明桑葉上產(chǎn)生的根為毛狀根。以目的基因的引物進(jìn)行擴(kuò)增，在1 500 bp處有單一亮帶，以EGFP基因的引物進(jìn)行擴(kuò)增，在715 bp出現(xiàn)單一亮帶，均與預(yù)計(jì)大小相符，同時(shí)在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，顯示綠色熒光（圖9），說明過表達(dá)基因被成功轉(zhuǎn)入桑葉的基因組中。

2.6 轉(zhuǎn)基因毛狀根的擴(kuò)大培養(yǎng)

由圖10可見，轉(zhuǎn)基因毛狀根前期生長(zhǎng)緩慢，大致在第3周開始出現(xiàn)分支，后期生長(zhǎng)快速，第8周部分出現(xiàn)枯萎。

2.7 轉(zhuǎn)基因毛狀根中MaCYP90A基因表達(dá)水平檢測(cè)

以未轉(zhuǎn)基因的的毛狀根為對(duì)照，結(jié)果（圖11）表明，MaCYP90A基因在轉(zhuǎn)基因桑葉毛狀根中高表達(dá)，其表達(dá)量是空白對(duì)照的39.97倍，差異達(dá)顯著水平（P＜0.001）。

3 討論與結(jié)論

日本學(xué)者M(jìn)achii通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將攜帶GUS和Kan抗性基因的pBI121質(zhì)粒轉(zhuǎn)入桑葉盤，獲得了5株陽(yáng)性苗，開啟了桑樹轉(zhuǎn)基因研究。但是就木本植物而言，建立高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的難度較大，普遍存在遺傳轉(zhuǎn)化效率低、發(fā)根周期長(zhǎng)等現(xiàn)象。故本研究對(duì)發(fā)根農(nóng)桿菌菌株、外植體類型、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，以期建立高效、穩(wěn)定的桑遺傳轉(zhuǎn)化體系，為后續(xù)?；蚬δ苎芯恳约爸参镉N提供技術(shù)支持。

在農(nóng)桿菌方面，本研究選擇了四種農(nóng)桿堿型菌株LBA9402、R1600、R1601及C58C1進(jìn)行試驗(yàn)，相較于黃瓜堿型、甘露堿型的發(fā)根農(nóng)桿菌，農(nóng)桿堿型菌株具有更高的毛狀根誘導(dǎo)率。結(jié)果表明，LBA9402的發(fā)根率最高，為80. 74%，是C58C1的4.6倍，而R1600與R1601沒有誘導(dǎo)發(fā)根，這可能與桑葉對(duì)R1600、R1601菌株敏感性不強(qiáng)或R1600、R1601的T-DNA片段不易整合到桑葉外植體基因組有關(guān)。同時(shí)根據(jù)農(nóng)桿菌生長(zhǎng)曲線，確定了OD600值為0.6時(shí)的菌液濃度較為適宜。

在受體材料方面，本研究選用桑的真葉、莖段、子葉外植體進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，最終選擇了真葉。莖段和子葉雖然也可以誘導(dǎo)發(fā)根，但是誘導(dǎo)率低，這與以往文獻(xiàn)報(bào)道一致，可能是因?yàn)?0 d的無菌桑苗子葉與莖段已經(jīng)處于桑組織細(xì)胞衰老期，不能維持旺盛的細(xì)胞分裂能力，而此時(shí)的鮮嫩真葉處于細(xì)胞分裂期，更利于誘導(dǎo)發(fā)根。預(yù)培養(yǎng)不僅可以將帶有污染源的外植體提前去除以減少后期試驗(yàn)的損失，還可以促進(jìn)外植體細(xì)胞分裂以提高毛狀根誘導(dǎo)率。本研究發(fā)現(xiàn)進(jìn)行2d預(yù)培養(yǎng)的毛狀根誘導(dǎo)率最高。

在植株侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間方面，本研究經(jīng)試驗(yàn)確定最佳侵染時(shí)間為10 min，共培養(yǎng)時(shí)間為2d。這與前人在其他植物上的報(bào)道不一致：甘薯最佳侵染時(shí)間為20 min，萬壽菊最佳侵染時(shí)間為5 min，丹參共培養(yǎng)4 d，谷子共培養(yǎng)3d，可能與基因型差異、切口大小以及農(nóng)桿菌T-DNA片段整合速率不同有關(guān)。

經(jīng)過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，本研究建立了高效的桑遺傳轉(zhuǎn)化體系，確定了桑毛狀根最佳誘導(dǎo)條件，即選用OD600為0.6的發(fā)根農(nóng)桿菌LBA9402菌液侵染預(yù)培養(yǎng)2d的無菌桑苗真葉10min，再經(jīng)過2 d的共培養(yǎng)。在此條件下，桑毛狀根誘導(dǎo)率大大提高，誘導(dǎo)率為84.51%，相比優(yōu)化前的30. 21%提高了1.8倍。利用可能參與DNJ生物合成途徑的MaCYP90A基因?qū)?yōu)化后的桑遺傳轉(zhuǎn)化體系穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證，qRT-PCR檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)基因毛狀根中MaCYP90A基因表達(dá)水平是空白對(duì)照的39.97倍，表明本研究建立的優(yōu)化后桑遺傳轉(zhuǎn)化體系能夠?qū)崿F(xiàn)外源基因在該體系中的高效、穩(wěn)定表達(dá)。本研究結(jié)果可為后續(xù)?；蚬δ苎芯?、次生代謝物合成途徑解析以及分子育種提供技術(shù)支撐。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“桑葉DNJ類多羥基生物堿生物合成途徑中關(guān)鍵羥基化過程解析”（82274040）、“桑葉DNJ類多 羥基生物堿生物合成關(guān)鍵酶基因挖掘和功能研究”（81872961）