摘要：為了尋找燕山紅玉肉雞屠宰性狀相關(guān)基因，本研究以燕山紅玉肉雞為對象，通過對120只雞（公母各60只）進(jìn)行解剖得到屠宰性狀指標(biāo)，以胸肌重量高和低的兩組雞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序及差異表達(dá)基因分析和KEGG富集分析，利用PCR擴(kuò)增和測序技術(shù)進(jìn)行多態(tài)位點(diǎn)篩查，并采用單因素方差分析對篩得的多態(tài)位點(diǎn)基因型與屠宰性狀指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明：①顯著差異表達(dá)基因中有189個基因上調(diào)，40個基因下調(diào)；對上調(diào)基因集進(jìn)行KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)PPAR信號通路對個體肝臟的脂質(zhì)發(fā)育有重要影響，PLIN1基因參與該通路，最終影響脂肪細(xì)胞分化。②擴(kuò)增PLIN1基因第8外顯子序列，篩查到一處多態(tài)位點(diǎn)c.258G＞A（rs731147932）．產(chǎn)生GG、AG、AA三種基因型，不同基因型公雞肝重和母雞心重差異顯著（P＜0.05）。綜上，PLIN1基因影響燕山紅玉肉雞屠宰性狀，其第8外顯子中c.258G＞A多態(tài)位點(diǎn)可作為燕山紅玉肉雞屠宰性狀改良的遺傳位點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：燕山紅玉肉雞；轉(zhuǎn)錄組測序；PLIN1基因；多態(tài)位點(diǎn)；屠宰性狀

中圖分類號：S831.92：Q781 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2025） 03-0166-07

長久以來，自有品種的匱乏使我國白羽肉雞種源主要依賴進(jìn)口，另外我國對黃羽肉雞及屠宰加工型品種的需求呈上升趨勢，急需肉雞種業(yè)方面的科技創(chuàng)新進(jìn)行支撐。肉雞種業(yè)作為肉雞產(chǎn)業(yè)鏈的頂端，扮演著肉雞科技創(chuàng)新的最前沿角色，是推動肉雞產(chǎn)業(yè)發(fā)展的核心要素。燕山紅玉肉雞是用安卡紅父母代公雞與巴布考克B380商品代母雞雜交出的肉雜雞，生長性能優(yōu)異、生長速度快、抗病能力強(qiáng)，自誕生以來飼養(yǎng)規(guī)模越來越大。本研究旨在尋找與燕山紅玉肉雞屠宰性狀相關(guān)的功能基因及分子標(biāo)記，為更好地對其進(jìn)行性能改良提供依據(jù)。

轉(zhuǎn)錄組測序（RNA - seq）是利用深度測序進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄組分析的技術(shù)手段，屬于第二代測序技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，是研究基因表達(dá)和鑒定新型RNA種類的首選方法，在畜禽研究中已廣泛應(yīng)用。袁茂等通過對不同時期藏雞腿肌組織轉(zhuǎn)錄組測序，鑒定出一些影響其肌肉發(fā)育的差異基因。

脂滴是細(xì)胞內(nèi)儲存中性脂肪的主要部位，脂滴的不斷變化可維持脂質(zhì)代謝活動的穩(wěn)定。1991年，Greenberg等發(fā)現(xiàn)一種蛋白質(zhì)，存在于脂滴的表面，將其命名為圍脂滴蛋白，又稱脂滴包被蛋白（Peripilin，PLIN）。PLIN1蛋白在調(diào)控脂解和促進(jìn)脂滴融合方面具有重要作用，研究表明PLIN1在成熟的脂肪細(xì)胞中高度表達(dá)；此外，在脂肪細(xì)胞分化為成熟狀態(tài)的過程中，PLIN1逐漸進(jìn)入含有小脂滴的未成熟前脂肪細(xì)胞中，這表示PLIN1可能在脂滴的形成中發(fā)揮了作用。

本試驗(yàn)對燕山紅玉肉雞胸肌重量高和重量低的兩組樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，通過差異表達(dá)基因篩選和KEGG富集分析篩選出影響其脂質(zhì)發(fā)育的關(guān)鍵基因，旨在尋找到與該種肉雞生長及屠宰性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，對其基因和性能改良提供一定的理論和試驗(yàn)基礎(chǔ)，并為更全面地利用這一遺傳資源提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物處理與分組

試驗(yàn)雞為河北振志家禽育種有限公司培育的500只燕山紅玉肉雞，飼養(yǎng)場地為河北省唐山市曹妃甸區(qū)八農(nóng)場基地。在4月齡時隨機(jī)選取120只雞（公母各60只）進(jìn)行解剖，記錄活體重、放血重、屠體重、全凈膛重、半凈膛重、胸肌重、腿肌重、翅膀重、頭重、腳重、腺胃重、肌胃重、心重、肝重等屠宰數(shù)據(jù)，并采集各雞只的胸肌組織超低溫保存。根據(jù)胸肌重量高低分為兩組，每組各采集3只雞，編號XJG1、XJG2、XJG3的為胸肌重量高的一組（XJG組），編號XJD1、XJD2、XJD3的為胸肌重量低的一組（XJD組），胸肌組織送天津諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。試驗(yàn)樣品分組具體情況見表1。

1.2 RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測序

使用Trizol法進(jìn)行樣品總RNA提取，利用Nan-oDrop 2000分光光度計測定RNA濃度，使用Agilent5400片段分析儀系統(tǒng)評價RNA完整性和純度。RNA樣品檢測合格后，基于Illumina 1.8版本測序平臺建立轉(zhuǎn)錄本文庫，進(jìn)行有參轉(zhuǎn)錄組測序。

1.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的處理與分析

采用DESeq2 1.20.0軟件，以Padj＜0.05且|log2（Fold Change）|＞1作為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因；采用clusterProfiler 3.8.1軟件以Padj＜0.05作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行富集分析，并采用R 3.5.0軟件的ggplot2包繪制差異基因火山圖。

1.4 基因多態(tài)性分析

根據(jù)GenBank收錄的雞PLIN1基因（登錄號：NC_052541）序列使用Primer Premier 3.0軟件設(shè)計引物，擴(kuò)增PLIN1基因第8外顯子序列。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司（下文稱生工公司）合成，引物信息見表2。使用生工公司試劑盒提取120只樣本胸肌組織DNA保存。以提取的DNA為模板，用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系（20μL）：2.5× Taq PCR mix 10 μL，10μmol/L上、下游引物各1μL，DNA模板1μL，超純水7μL。反應(yīng)程序：94℃10 min；94℃40 s，60℃400 s，72℃40 s，35個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物連同樣本DNA送生工公司測序。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel軟件整理數(shù)據(jù)，采用SPSS 26.0軟件的單因素方差分析對各分組屠體指標(biāo)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。序列對比采用SnapGene 6.0.2軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 燕山紅玉肉雞轉(zhuǎn)錄組測序分析

通過對燕山紅玉肉雞胸肌組織RNA的上機(jī)測序，共構(gòu)建6個轉(zhuǎn)錄組文庫，分為XJG組（XJG1、XJG2、XJG3）和XJD組（XJD1、XJD2、XJD3）。經(jīng)過原始數(shù)據(jù)的過濾、測序錯誤率的檢查以及GC含量的分析，獲取了用于后續(xù)分析的高質(zhì)量數(shù)據(jù)。具體數(shù)據(jù)匯總?cè)绫?所示。測序數(shù)據(jù)符合要求。

差異表達(dá)基因分析結(jié)果（圖1）顯示，XJG組和XJD組樣品間的顯著差異表達(dá)的基因中有189個基因上調(diào)表達(dá)，40個基因下調(diào)表達(dá)。

對上調(diào)表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析，顯著性前20的通路如圖2所示，涉及Lysosome（溶酶體）、Phagosome（吞噬體）、Cytokine-cytokine recep-tor interaction（細(xì)胞因子—細(xì)胞因子受體相互作用）等通路。查閱KEGG數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，富集的基因主要參與PPAR信號通路，包含PLTP、FABP、LPL、PLIN1基因（圖3）。研究表明PPAR信號通路對個體骨骼肌和肝臟脂肪的發(fā)育有重要影響，其作用后期均有PLIN1基因參與，最終影響脂肪細(xì)胞分化，推測PLIN1基因在燕山紅玉肉雞脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)中具有重要意義。

2.2 燕山紅玉肉雞PLIN1基因多態(tài)性分析

對燕山紅玉肉雞PLIN1基因第8外顯子序列進(jìn)行基因多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)有一處多態(tài)位點(diǎn)，為c.258G＞A，涉及3種基因型，分別為GG型、AG型和AA型（圖4）。與UCSC數(shù)據(jù)庫（University ofCalifornia， Santa Cruz）對比發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與rs731147932一致，染色體位置為chr10：13267212。多態(tài)位點(diǎn)在試驗(yàn)燕山紅玉肉雞群體中的基因型和等位基因頻率以及Hardy - Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果見表4。GG基因型在公、母雞群體中均為頻率最高者，其次為AG基因型，最低的為AA基因型，可見GG基因型和G等位基因優(yōu)勢較明顯；Hardy-Weinberg檢驗(yàn)表明燕山紅玉肉雞公母群體在該多態(tài)位點(diǎn)均處于遺傳平衡狀態(tài)（P＞0.05）。

2.3 燕山紅玉肉雞屠宰性狀分析

對120只燕山紅玉肉雞各屠宰性狀指標(biāo)進(jìn)行描述統(tǒng)計，結(jié)果（表5）顯示，性別因素對各屠宰性狀指標(biāo)均具有極顯著影響（P＜0.01），可知該品種雞生長性能受性別影響極大。

2.4 燕山紅玉肉雞PLIN1基因多態(tài)性與屠宰性狀關(guān)聯(lián)分析

對燕山紅玉肉雞PLIN1基因多態(tài)位點(diǎn)（c.258G＞A）3種基因型與各屠宰性狀進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果（表6）表明，PLIN1基因多態(tài)位點(diǎn)c.258G＞A不同基因型對燕山紅玉肉雞公雞肝重和母雞心重有顯著影響（P＜0.05），對其他屠宰性狀均無顯著影響。

對差異顯著的肝重和心重進(jìn)行多重比較，結(jié)果（表6）表明，在公雞群體中，AG基因型樣本的肝重顯著高于GG基因型樣本，且AA基因型樣本與AG基因型和GG基因型差異均不顯著：在母雞群體中，AA基因型樣本的心重顯著高于GG基因型和AG基因型樣本，且GG基因型和AG基因型樣本的心重差異不顯著。因此在公雞群體中可以將AG基因型視為有利基因型，母雞群體中可以將AA基因型視為有利基因型，可據(jù)此進(jìn)行人工干預(yù)育種實(shí)現(xiàn)性狀改良。

3 討論與結(jié)論

轉(zhuǎn)錄組測序在畜禽研究中已廣泛應(yīng)用。Li等通過轉(zhuǎn)錄組測序鑒定出參與新疆棕牛和哈薩克牛脂肪與肌肉生成相關(guān)的差異表達(dá)基因：McDaneld等通過對豬不同時期的肌肉組織轉(zhuǎn)錄組測序，鑒定出與肌肉發(fā)育相關(guān)的miRNA；Yal-cintan等通過對羔羊不同肌肉部位轉(zhuǎn)錄組測序鑒定出影響其肉質(zhì)的候選基因。

研究發(fā)現(xiàn)PLIN主要在脂肪組織中表達(dá)，但PLIN的表達(dá)水平與人肥胖之間的關(guān)聯(lián)受多種因素的調(diào)節(jié)，具體關(guān)系目前尚未確定。在畜禽中，對豬、牛、羊、鵝、鴨的檢測結(jié)果均發(fā)現(xiàn)PLIN基因?qū)χ鞠嚓P(guān)部位的發(fā)育有顯著或極顯著影響。同時有研究表明，PLIN1基因的表觀遺傳修飾可能在雞脂肪發(fā)育中對脂肪細(xì)胞的肥大起著重要作用。趙小玲研究表明，雞PLIN基因的表達(dá)量與皮脂厚度和肌內(nèi)脂肪含量密切相關(guān)。此外周艷等也發(fā)現(xiàn)，PLIN1基因與雞的屠宰性狀及脂肪沉積有關(guān)。以上研究表明，PLIN1基因的表達(dá)對雞個體生長及發(fā)育具有一定的影響。

本試驗(yàn)對燕山紅玉肉雞胸肌重量高和低的兩組樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，通過差異表達(dá)基因篩選和KEGG富集分析確定PLIN1基因在燕山紅玉肉雞脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)中具有重要意義。通過序列比對發(fā)現(xiàn)，PLIN1基因第8外顯子有一處與屠宰性狀顯著相關(guān)的多態(tài)位點(diǎn)c．258G＞A（rs731147932），產(chǎn)生GG、AG、AA三種基因型，公雞群體中可以將AG基因型視為有利基因型，母雞群體中可以將AA基因型視為有利基因型，該基因可作為改良燕山紅玉肉雞屠宰性狀的候選基因。

基金項(xiàng)目：河北省現(xiàn)代種業(yè)科技創(chuàng)新專項(xiàng)“雞現(xiàn)代種業(yè)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)”（21326303D-5）