摘要：畜禽養(yǎng)殖和水稻種植是溫室氣體甲烷（CH4）的重要排放源。甲烷氧化菌是大氣CH4的重要匯，從垃圾填埋場覆土中分離出1株甲烷氧化菌JW535，經(jīng)生理生化、16S rRNA及平均核苷酸一致性分析，鑒定其為皮特不動桿菌（Acinetobacter pittii）。批式培養(yǎng)試驗表明，與對照菌株Methylosinus trichosporium OB3b相比，培養(yǎng)120 h后，JW535的D600 nm和CH4氧化效率均顯著高于對照（Plt;0.05），分別為0.48和83%。采用三代PacBio結(jié)合二代Illumina全基因組測序解析了JW535的CH4氧化代謝通路，其基因組大小為8 012 886 bp，經(jīng)直系同源蛋白數(shù)據(jù)庫（COG）和基因組百科全書數(shù)據(jù)庫（KEGG）注釋到的基因分別為4 916、3 073個。JW535全基因組序列中注釋到甲烷氧化單加氧酶、甲醇脫氫酶和甲酸脫氫酶的編碼基因pmoA、mxaJ和fdoI，推測其具有相對完整的CH4異化代謝通路。JW535同化代謝與絲氨酸循環(huán)有關(guān)，且具有完整的三羧酸循環(huán)。基于JW535的pmoA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析出其pmoA為低CH4親和力型，其pmoA蛋白含有AMO氨單加氧酶，在進化中相對保守。本研究解析了Acinetobacter pittii JW535的甲烷氧化代謝通路，可為進一步豐富和完善甲烷氧化菌種資源、減少農(nóng)業(yè)CH4排放提供理論和數(shù)據(jù)支持。

關(guān)鍵詞：皮特不動桿菌；甲烷氧化；pmoA；全基因組學(xué)分析

中圖分類號：X172；X511文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2025）02-0229-11

大氣中溫室氣體濃度不斷上升是全球氣候變暖的關(guān)鍵驅(qū)動因素［1］。甲烷（CH4）在100年內(nèi)全球變暖潛能值（GWP）高達CO2的28倍［2］，在發(fā)布的《全球甲烷評估報告》中顯示，有60%的CH4排放來源于人為活動，其中農(nóng)業(yè)的CH4排放占40%，主要為畜禽養(yǎng)殖業(yè)和水稻種植業(yè)［3］。在稻田淹水期間，由于微生物、動物或植物根系的O2消耗，土壤形成了厭氧環(huán)境，這種環(huán)境促使產(chǎn)甲烷菌利用土壤中的有機物進行發(fā)酵，從而產(chǎn)生CH4氣體［4］。甲烷氧化菌是大氣中CH4重要的匯。厭氧產(chǎn)甲烷菌產(chǎn)生的CH4有30%～90%被甲烷氧化菌消耗［5］，甲烷氧化菌對全球CH4減排的貢獻率高達 10%～20%［6-7］。

根據(jù)甲烷氧化菌碳同化途徑可將甲烷氧化菌分為Ⅰ型、Ⅱ型、X型和其他四大類。Ⅰ型甲烷氧化菌屬于γ變形菌綱，其碳同化途徑為核酮糖單磷酸（RuMP）途徑［8］，Methylocicrobium［9］、Methylococcus和Methylocaldum［10］等均屬于此類甲烷氧化菌。Ⅱ型甲烷氧化菌屬于α變形菌綱，其利用絲氨酸（Serine）途徑進行碳同化，代表菌株為Methylosinus trichosporium OB3b［11］。X型甲烷氧化菌也屬于γ變形菌綱，能夠利用RuMP、Serine[JP3]和卡爾文循環(huán)（CBB循環(huán)）進行碳同化，代表菌株為Methylococcus capsulatus （Bath）［12］。此外，由嗜熱嗜酸菌組成的疣微菌門（Verrucomicrobia）其碳同化途徑與上述均不同，是先將CH4轉(zhuǎn)化為CO2，再利用CBB循環(huán)同化CO2［13］。

甲烷氧化菌氧化CH4的異化過程是在好氧條件下，通過一系列酶的催化作用將CH4轉(zhuǎn)化為CO2和水。甲烷氧化單加氧酶（MMO）能夠?qū)H4催化生成甲醇［14］，分為顆粒型單加氧酶（pMMO）和可溶性單加氧酶（sMMO） 2類。其中，pMMO普遍存在于已知的好氧甲烷氧化菌中［15］，由pmoA基因調(diào)控。pMMO分為底物低親和力型和高親和力型［16］。Baani等研究發(fā)現(xiàn)，Ⅱ型甲烷氧化菌Methylocystis sp.SC2具有2種不同的甲烷氧化單加氧酶pMMO，分別為pMMO1和pMMO2。其中pMMO1僅在甲烷混合比高于600 ppmv時才會進行CH4氧化。而pMMO2即使大氣中CH4含量極低的痕量水平，也能夠有效地進行CH4氧化［17］。CH4在MMO的作用下被氧化為甲醇，隨后甲醇脫氫酶（MDH）進一步將其氧化為甲醛。甲醛氧化共有甲醛脫氫酶氧化甲醛氧化、谷胱甘肽依賴性甲醛氧化、四氫葉酸（H4F）依賴性甲醛氧化、四氫甲基蝶呤（H4MPT）依賴性甲醛氧化4種異化途徑［18］。

鑒于甲烷氧化菌在CH4減排領(lǐng)域的重要作用，篩選甲烷氧化菌菌種將其用于減少農(nóng)業(yè)CH4排放，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)溫室氣體減排具有極其重要的意義。筆者所在課題組從垃圾填埋場覆土中分離出1株具備CH4氧化功能的Acinetobacter pittii JW535（簡稱JW535），目前關(guān)于皮特不動桿菌氧化CH4的研究尚未見報道，其CH4氧化代謝通路也尚不清晰。因此本研究采用全基因組學(xué)解析該菌株的CH4氧化功能基因和CH4氧化代謝通路，可進一步豐富和完善甲烷氧化菌菌種資源庫，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)溫室氣體CH4減排提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1菌株來源供試甲烷氧化菌Acinetobacter pittii JW535，2019年6月30日分離自保定市蓮池區(qū)渣土垃圾管理處垃圾衛(wèi)生填埋覆土，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC No.25749）。供試對照甲烷氧化菌Methylosinus trichosporium OB3b（簡稱OB3b），由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)楊松教授提供。

1.1.2培養(yǎng)基

硝酸鹽無機鹽培養(yǎng)基（NMS）［19］，用于甲烷氧化菌JW535培養(yǎng)。其中含大量元素溶液MgSO4·7H2O 1.0 g/L、KNO3 1.0 g/L、Na2HPO4·12H2O 0.72 g/L、KH2PO4 0.27 g/L、CaCl2·2H2O 0.13 g/L、乙二胺四乙酸鐵鈉（Fe-EDTA）0.005 g/L，含微量元素溶液Na2-EDTA 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.2 g/L、H3BO3 0.03 g/L、CoCl2·6H2O 0.02 g/L、CuSO4·5H2O 0.03 g/L、ZnSO4·7H2O 0.01 g/L、MnCl2·4H2O 0.003 g/L、Na2MoO4·2H2O 0.003 g/L、NiCl2·6H2O 0.002 g/L。每1 L大量元素溶液中加入1 mL微量元素溶液完全混合，調(diào)pH值為6.8～7.0。

硝酸鹽無機鹽培養(yǎng)基1（NMS1）［20］，用于甲烷氧化菌OB3b培養(yǎng)。其中含大量元素溶液KNO3 1.0 g/L、MgSO4·7H2O 1.0 g/L、CaCl2·2H2O 0.134 g/L、KH2PO4 0.25 g/L、Na2HPO4·12H2O 0.7 g/L，含微量元素溶液Na2-EDTA 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 1.0 g/L、Fe-EDTA 0.75 g/L、ZnSO·7H2O 0.8 g/L、MnCl2·4H2O 0.005 g/L、H3BO3 0.03 g/L、CoCl2·6H2O 0.05 g/L、Cu-EDTA 0.4 g/L、CuCl·2H2O 0.6 g/L、NiCl2·6H2O 0.002 g/L、NaMoO·2H2O 0.05 g/L。每1 L大量元素溶液中加入2 mL微量元素溶液完全混合，調(diào)pH值至7.0。

NMS和NMS1固體培養(yǎng)基的制備，在上述液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入15～20 g瓊脂，隨后在121 ℃滅菌鍋中進行滅菌處理，滅菌時間為20 min，放置超凈臺待用。

1.2試驗方法

1.2.1菌種鑒定

用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取純化菌株JW535的DNA，利用通用引物27F和1492R進行PCR擴增［21］，擴增后的產(chǎn)物送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將16S rRNA基因序列進行同源性分析，并通過MEGA 6.0軟件，采用鄰接（Neighbor-Joining）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［22］，以深入了解JW535的進化關(guān)系。

1.2.2生理生化分析

根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［23］進行革蘭氏染色、吲哚試驗、脲酶測定試驗、產(chǎn)H2S試驗、甲基紅試驗、接觸酶試驗、檸檬酸鹽利用試驗以及明膠液化試驗。

1.2.3生長曲線和甲烷氧化能力測定

以甲烷氧化菌OB3b為對照菌株，采用批式培養(yǎng)試驗，測定分析JW535的生長和CH4氧化能力。將活化后的JW535和OB3b菌株菌液（D600 nm=1.0）各5 mL，分別接種于裝有45 mL相應(yīng)培養(yǎng)基的250 mL血清瓶中。密封后抽出40 mL空氣，充入40 mL純CH4。置于30 ℃、120 r/min搖床中進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，每隔12 h測定液相D600 nm值和氣相CH4濃度。將測得的D600 nm數(shù)據(jù)利用Origin 2022的Logistic生長動力學(xué)模型進行細(xì)胞生長曲線擬合，計算公式如下：

Y=A2+（A1-A2）/［1+（X/X0）P］。

式中：X為細(xì)胞生長時間，h；Y為菌體細(xì)胞光密度值；A1為發(fā)酵液起始濃度，mg/L；A2為發(fā)酵液最終濃度，mg/L；P表示細(xì)胞生長指數(shù)；X0表示最大比生長速率比例常數(shù)，h-1。

1.2.4全基因組測序及分析方法

將培養(yǎng)至對數(shù)期的JW535菌體收集后，送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行全基因組測序。采用三代PacBio結(jié)合二代Illumina的測序方式，將得到的基因組序列與直系同源蛋白數(shù)據(jù)庫（COG）、基因本體數(shù)據(jù)庫（GO）、京都基因和基因組百科全書數(shù)據(jù)庫（KEGG）［24］等進行對比，得到相應(yīng)的功能注釋信息。為了提高菌株鑒定的準(zhǔn)確性，基于全基因組測序數(shù)據(jù)，使用OrthoANI Tool v0.93.1，將菌株JW535與其他菌株進行平均核苷酸一致性（ANI）比對［25］。

1.2.5菌株JW535的pmoA基因同源蛋白比較分析

在Uniprot數(shù)據(jù)庫上選擇不同菌株的pmoA基因蛋白序列，將樣品序列與數(shù)據(jù)庫中的同源序列使用MEGA 11.0軟件，應(yīng)用鄰接法構(gòu)建pmoA基因系統(tǒng)發(fā)育樹［26］。利用MEME在線比對（http：//meme-suite.org/tools/meme）對氨基酸序列保守基序進行分析［27］。通過NCBI網(wǎng)站CDD數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）預(yù)測同源蛋白保守結(jié)構(gòu)域［28］，然后用TBtools軟件進行可視化分析。通過ClustalW在線比對工具（https：//www.genome.jp/tools-bin/clustalw）進行蛋白序列比對［29］，通過SnapGene軟件進行可視化分析。批式培養(yǎng)試驗頂空CH4濃度采用氣相色譜儀（Agilent 6820）測定，以高純氮氣（99.999%）為載氣，ECD檢測器，柱箱溫度為55 ℃，前檢測器溫度為250 ℃，后檢測器溫度為330 ℃［30］。菌體生長量D600 nm采用多功能酶標(biāo)儀（Thermo scientific FC）在波長600 nm處測定。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010整理及作圖，用SPSS 20.0的獨立樣本t檢驗進行方差分析（α=0.05）。

2結(jié)果與分析

2.1菌株JW535的生理生化及分子生物學(xué)鑒定

菌株JW535在NMS固體培養(yǎng)基上的形態(tài)特征如圖1所示，白色不透明，邊緣整齊，表面光滑，直徑為0.5～1.2 mm。菌株JW535為革蘭氏陰性，產(chǎn)H2S試驗、脲酶、吲哚試驗為陰性；甲基紅試驗、接觸酶試驗、檸檬酸鹽利用試驗、淀粉水解試驗和明膠液化試驗均為陽性。

基于菌株JW535的16S rRNA測序數(shù)據(jù)，成功構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。菌株JW535與Acinetobacter pittii相似性＞99%，因此將該菌株初步命名為Acinetobacter pittii JW535（NCBI登錄號為OR807728）。

為了進一步明確JW535的系統(tǒng)發(fā)育位置，基于全基因組測序結(jié)果進行ANI分析，結(jié)果見圖3。菌株JW535與Acinetobacter pittii PHEA-2的ANI值高達96.43%，與Acinetobacter pittii strain ABC的ANI值達96.41%，該結(jié)果不僅與16S rRNA基因序列比對結(jié)果相吻合，而且在精確度上更勝一籌，因此可以確定菌株JW535屬于Acinetobacter屬的菌株。

2.2菌株JW535生長曲線和甲烷氧化能力

本研究以應(yīng)用最為廣泛的甲烷氧化菌Methylosinus trichosporium OB3b為對照菌株，開展批式培養(yǎng)試驗，分析菌株培養(yǎng)過程的D600 nm和CH4氧化效率，結(jié)果見圖4。菌株JW535和OB3b的D600 nm值均在第84 h達到最大，分別為0.48和0.38。Logistic生長動力學(xué)模型分析結(jié)果表明：JW535的停滯期、對數(shù)增長期和穩(wěn)定期均晚于對照菌株OB3b。以停滯期為例，對照菌株OB3b的停滯期為4.84 h，而JW535的停滯期要長一些，為6.46 h。但是，菌株JW535具有更高的生長速率，對照菌株OB3b的最大比生長速率（μmax）為0.008 09/h，而JW535的μmax為0.009 53/h。綜上，在相同培養(yǎng)條件下，菌株JW535具有更加優(yōu)異的生長能力。

由圖4可知，在0～36 h，菌株JW535的CH4氧化效率低于對照菌株OB3b。例如在第36 h，JW535和OB3b的CH4氧化效率分別為57%、61%。48 h時CH4氧化效率接近。在48 h后，菌株JW535的CH4氧化效率高于對照菌株OB3b，到培養(yǎng)結(jié)束時，JW535和OB3b的CH4氧化效率分別為83%、80%。從總體來看，JW535也具有更為優(yōu)異的CH4氧化能力。

2.3基于全基因組學(xué)的菌株JW535甲烷氧化代謝通路分析

2.3.1全基因組測序基本信息

采用三代PacBio結(jié)合二代Illumina的測序方式進行JW535全基因組測序， 全基因組圖見圖5。菌株JW535的基因組由2個染色體、5個質(zhì)粒組成?；蚪M大小為 8 012 886 bp，G+C含量為50.89%，共注釋到 8 010 個蛋白質(zhì)編碼序列，經(jīng)COG和KEGG注釋到的基因分別為4 916、3 073個。JW535基因組中含有21個rRNA操縱子，分別由7個5S rRNA、7個16S rRNA、7個23S rRNA組成，其還含有122個tRNAs基因，分別轉(zhuǎn)運Ala、Arg、Asn、Asp等20種不同的氨基酸。

2.3.2菌株JW535甲烷氧化代謝通路

2.3.2.1甲烷異化過程

基于全基因組學(xué)分析，預(yù)測了JW535的CH4氧化異化途徑（圖6）。通過對JW535的代謝通路分析和功能基因注釋，注釋到編碼顆粒性甲烷氧化單加氧酶基因pmoA、編碼甲醇脫氫酶基因mxaJ、編碼甲酸脫氫酶基因fdoI，分別參與CH4到甲醇、甲醇到甲醛及甲酸到CO2的氧化過程。

如前所述，已知的甲醛氧化過程共有4種途徑，對于甲醛脫氫酶氧化甲醛氧化途徑，JW535的全基因組信息并未直接注釋到甲醛脫氫酶基因fdhA，但是通過與Methanobacterium formicicum的fdhA基因進行同源性比較，注釋到2個同化硝化還原酶（編碼基因nasA），同源性分別為30.0%和30.9%，覆蓋度分別為98.4%和98.8%（表1），推測JW535的甲醛氧化也同樣可能由nasA調(diào)控；對于谷胱甘肽依賴性甲醛氧化途徑，JW535注釋到S-（羥甲基）谷胱甘肽脫氫酶基因frmA、S-甲?；入赘孰乃饷富騠rmB，但未注釋到S-（羥甲基）谷胱甘肽合酶基因gfa；對于四氫葉酸（H4F）依賴性甲醛氧化途徑，JW535注釋到亞甲基四氫葉酸脫氫酶編碼基因folD，亞甲基四氫葉酸水解酶編碼基因fchA，但未注釋到調(diào)控10-甲?；臍淙~酸生成甲酸的甲酰四氫葉酸合成酶基因fhs；對于四氫甲基蝶呤（H4MPT）依賴性甲醛氧化途徑，JW535注釋到亞甲基四氫葉酸酶基因mtdA、亞甲基四氫甲蝶呤環(huán)水解酶基因mch和甲?；淄檫秽摎涿富騠wdB，但未注釋到5，6，7，8-四氫甲蝶呤水解酶基因fae，經(jīng)與菌株Methanosarcina barkeri （DSM 804）的fae基因進行同源性比較，注釋到1個絲氨酸型羧肽酶（編碼基因dacC），其序列一致性為29.0%，覆蓋度為30.3%（表1）。綜上，推測菌株JW535將甲醛氧化可能是通過途徑①或途徑④來完成。

由以上分析可以看出，菌株JW535的全基因組信息能夠推測出較為完整的CH4異化代謝通路。Spanning等發(fā)現(xiàn)1株甲烷營養(yǎng)型分枝桿菌不具備傳統(tǒng)的MxaF型甲醇脫氫酶，其甲醇催化轉(zhuǎn)化為甲醛是由乙醇脫氫酶（adhD）催化完成［31］。Dunfield等在甲烷氧化菌Methylokorus infernorum Isolate V4中沒有注釋到甲醇脫氫酶和甲醛氧化過程中的四氫甲烷蝶呤酶，推測其甲醛氧化的途徑可能的是利用四氫葉酸酶類，未能驗證出一條完整的CH4代謝途徑，同樣其基因組信息也能預(yù)測出一個完整的三羧酶（TCA）循環(huán)［32］。

2.3.2.2甲烷同化過程

基于JW535的全基因組學(xué)信息，分析預(yù)測了其CH4氧化同化過程（圖7）。JW535的CH4同化主要與絲氨酸循環(huán)有關(guān)，相關(guān)基因包括mchA和fchA，以及甘油酸酯酶基因gckA、D-3-磷酸甘油酸脫氫酶基因eno、丙酰輔酶a羧化酶基因ppc、蘋果酸脫氫酶基因mdh等。但是，未注釋到hpr基因，通過與Blautia hydrogenotrophica DSM 10 507的hpr基因進行同源性比較，在JW535全基因組序列中注釋到1個羥丙酮酸還原酶（編碼基因ghrB）和2個D-3-磷酸甘油酸脫氫酶（編碼基因serA），其序列一致性分別為28.8%和34.1%～34.7%，覆蓋度分別為87.6%和87.3%～99.4%（表2）。此外，菌株JW535中也注釋到TCA循環(huán)所需要的所有酶的編碼基因， 如gltA、acnA、icd、sunAB等關(guān)鍵基因。因此，推測JW535的同化途徑很大可能為絲氨酸循環(huán)途徑。Pol等通過基因組分析甲烷氧化菌Acidimethylosilex fumarolicum SolV，注釋到許多與碳代謝相關(guān)的基因，推測該菌株可能同時利用Serine、H4MPT、RuMP等途徑進行碳固定［33］。

2.4菌株JW535的pmoA基因同源蛋白比較分析

2.4.1基于pmoA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

甲烷氧化菌將CH4氧化為甲醇是CH4氧化途徑的第1步，也是最關(guān)鍵的步驟。本研究構(gòu)建了基于pmoA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖8-a）。JW535中共注釋到3個pmoA基因序列，根據(jù)其在染色體的前后位置排序，分別命名為Acinetobacter pittii JW535 pmoA-1，Acinetobacter pittii JW535 pmoA-2和Acinetobacter pittii JW535 pmoA-3（下文簡稱pmoA-1、pmoA-2、pmoA-3）。上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫并獲得登錄號，依次為OR873561、OR873562、OR873563。從構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上看，pmoA-1，pmoA-2在系統(tǒng)發(fā)育樹上位置最相近，兩者與菌株Methylocystis sp.SC2的pmoA1親緣關(guān)系最近。此外pmoA-3與pmoA-1、pmoA-2在系統(tǒng)發(fā)育樹上的位置相距較遠(yuǎn)。

研究表明，Methylocystis sp.SC2的pmoA1基因在環(huán)境CH4濃度高于600 μL/L時才會表達［17］，由此推斷JW535適合應(yīng)用于垃圾填埋場、養(yǎng)殖場厭氧塘等CH4排放濃度較高的場所。

2.4.2pmoA基因同源蛋白保守基序

同源蛋白保守基序是具有高度相似性或同一性的蛋白序列。高度保守的分析序列中具有相同的保守基序（motif），每個motif用堿基表示，字母越多表示該位點越保守。本研究針對構(gòu)建pmoA基因系統(tǒng)發(fā)育樹選用的18個氨基酸序列保守基序進行分析，如圖 8-b所示。基于18個pmoA氨基酸序列共鑒定出10個保守序列，長度為6～50 aa，其中Motif1～Motif4、Motif 6這5個保守基序為上述18個pmoA蛋白所共有，因此推測這5個保守基序為pmoA結(jié)構(gòu)域的重要組成部分。JW535的pmoA-1和 pmoA-2基因都含有10個保守基序，與其親緣關(guān)系最近的Methylocystis sp.SC2含有6個保守基序，而Methylosinus trichosporium OB3b的pmoA1雖然與pmoA-1、pmoA-2基因親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，但所含有的保守基序數(shù)量一樣，并且大小和位置也基本一致。而pmoA-3基因共含有7個保守基序，其中有6個保守基序與pmoA-1和pmoA-2的大小和位置都保持一致。

2.4.3pmoA基因同源蛋白保守結(jié)構(gòu)域

保守結(jié)構(gòu)域是決定其蛋白家族有類似保守功能的區(qū)域，圖9為構(gòu)建pmoA基因系統(tǒng)發(fā)育樹的18個同源蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果。上述pmoA蛋白均含有AMO氨單加氧酶，菌株JW535的pmoA-1和pmoA-2的蛋白結(jié)構(gòu)域位于序列27～249 aa位置，該區(qū)域同樣編碼一種氨單加氧酶，負(fù)責(zé)將氨催化氧化成羧氨，再經(jīng)羧氨氧化還原酶催化為亞硝酸。

2.4.4pmoA基因同源蛋白序列對比

通過同源蛋白的多序列比對可以找出蛋白家族中的保守片段，并且這些保守片段都承擔(dān)著重要的功能。將構(gòu)建pmoA基因系統(tǒng)發(fā)育樹的18個蛋白序列進行比對（圖10），完全保守的氨基酸以黃色標(biāo)注，保守性＞95%的上面以2個點標(biāo)注。通過對比結(jié)果可知，這18個基因在氨單加氧酶AMO保守結(jié)構(gòu)域部分（位于序列27～249 aa）位置具有相對較高的一致性，說明該功能在進化上表現(xiàn)出相對保守性，具有高度的一致性。通過同源蛋白序列比對，為后續(xù)pmoA蛋白突變做準(zhǔn)備，準(zhǔn)確判斷出所選擇的突變位點是否保守。

此外，本研究通過分析pmoA基因的同源蛋白基序和同源蛋白保守結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)用于構(gòu)建pmoA的18個氨基酸序列均含有氨單加氧酶AMO。甲烷氧化單加氧酶（MMO）與氨單加氧酶（AMO）在結(jié)構(gòu)上呈現(xiàn)出高度的相似性。從進化的角度看，兩者擁有相近的氨基酸序列以及相似的蛋白復(fù)合體結(jié)構(gòu)，并且它們有共同作用的相同底物——CH4和NH3，并展現(xiàn)出類似的被抑制特性［34］。MMO具備將氨轉(zhuǎn)化為羥胺的能力，而AMO同樣能夠氧化CH4，兩者在功能上展現(xiàn)出交叉活性［35］。

3結(jié)論

從垃圾填埋場覆土中分離得到1株甲烷氧化菌JW535，結(jié)合生理生化、16S rRNA及ANI分析，鑒定其為皮特不動桿菌（Acinetobacter pittii）。

與應(yīng)用較為廣泛的甲烷氧化菌Methylosinus trichosporium OB3b相比，JW535不僅具有較高的比增長速率，還具有較高的CH4氧化能力。

基于全基因組學(xué)分析，解析了菌株JW535的CH4氧化代謝通路，JW535具有相對完整的CH4異化過程，而其CH4同化過程主要與Serine循環(huán)有關(guān)。

構(gòu)建了基于pmoA基因的JW535系統(tǒng)發(fā)育樹，JW535的pmoA基因為低CH4親和力型，同源蛋白保守基序較為穩(wěn)定，其pmoA蛋白均含有AMO氨單加氧酶，在進化上相對保守。

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