摘要：淮豆13是一個(gè)高產(chǎn)廣適多抗夏大豆品種，但百粒重偏低，為改良其百粒重性狀，利用EMS（甲基磺酸乙酯）處理4 kg淮豆13種子，并進(jìn)行連續(xù)4個(gè)世代的表型考察及篩選，同時(shí)對(duì)其中1個(gè)質(zhì)量性狀變異突變體進(jìn)行了遺傳解析。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)M2和M3 2個(gè)世代篩選，獲得了332個(gè)穩(wěn)定遺傳的突變體株系，涵蓋莖稈、花、種子等多種類型的突變；篩選得到多個(gè)粒重增加或減少的材料，其中包括3個(gè)百粒重達(dá)28 g左右的突變體，M4世代表型驗(yàn)證表明這3個(gè)粒重增大突變體單株產(chǎn)量無(wú)顯著降低；此外，還鑒定得到了1個(gè)灰毛突變體，其農(nóng)藝性狀與野生型無(wú)差異，測(cè)序比對(duì)分析結(jié)果顯示T基因第5 942位堿基替換導(dǎo)致了終止密碼子的出現(xiàn)，從而產(chǎn)生了灰毛表型。本研究成功地構(gòu)造了變異豐富的淮豆13 EMS誘變突變體庫(kù)，且成功篩選得到了3個(gè)單株產(chǎn)量不顯著降低但百粒重顯著增加的突變體株系，以及發(fā)現(xiàn)了1個(gè)點(diǎn)突變導(dǎo)致的灰毛突變體；為后續(xù)淮豆13品種改良提供了有價(jià)值的育種種質(zhì)資源，也為后續(xù)淮豆13農(nóng)藝性狀遺傳機(jī)理解析提供了豐富的遺傳研究材料。

關(guān)鍵詞：淮豆13；EMS誘變；大豆；大粒；突變體

中圖分類號(hào)：S565.103文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2025）02-0128-08

甲基磺酸乙酯（EMS）誘變是一種有效的化學(xué)誘變方法，其作用原理是甲基磺酸乙酯使得DNA堿基烷基化而產(chǎn)生DNA序列改變，誘發(fā)點(diǎn)突變［1-3］。由于突變率較高，能打破基因連鎖，提高重組率，且突變體后代容易篩選，誘導(dǎo)突變的方式多為點(diǎn)突變，便于遺傳定位研究等諸多優(yōu)點(diǎn)，EMS誘變已成為多種作物人工誘變育種的成熟技術(shù)之一，已成功誘導(dǎo)并獲得多個(gè)農(nóng)作物新種質(zhì)［4-6］。

大豆種子大小是大豆重要的產(chǎn)量性狀之一，同時(shí)還在很大程度上影響大豆的商品性，由于市場(chǎng)偏好性，目前大籽粒大豆更受青睞。研究表明，多個(gè)生物學(xué)途徑參與了大豆種子大小調(diào)控的過(guò)程［7］，如泛素蛋白酶體途徑［8-10］、G蛋白［11］、轉(zhuǎn)錄因子［12］、植物激素［13］等，使得大豆種子大小相關(guān)研究變得復(fù)雜。由于大豆種子大小和大豆產(chǎn)量直接相關(guān)，解析大豆種子大小調(diào)控機(jī)制對(duì)于大豆育種意義重大。本研究使用EMS誘變創(chuàng)建大豆突變體庫(kù)，篩選大粒種子突變體，以期為后續(xù)大豆種子大小相關(guān)研究準(zhǔn)備試驗(yàn)材料。

淮豆13是江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所育成的1個(gè)夏大豆新品種，該品種具有諸多優(yōu)點(diǎn)，尤其在高產(chǎn)、廣適和多抗方面表現(xiàn)優(yōu)秀［14-15］。然而，該品種籽粒較小，百粒重為19 g左右，在大豆市場(chǎng)不具有價(jià)格優(yōu)勢(shì)。本研究利用EMS誘變淮豆13種子，創(chuàng)建突變體庫(kù)，旨在篩選多個(gè)淮豆13大粒突變體作為種質(zhì)資源，用以改良淮豆13的籽粒大小。

1材料與方法

1.1供試材料

選擇江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所育成的夏大豆品種淮豆13為誘變材料；誘變濃度篩選預(yù)試驗(yàn)以淮豆13、淮豆16和淮豆18為試驗(yàn)材料。

1.2誘變處理?xiàng)l件

1.2.1誘變濃度篩選

預(yù)試驗(yàn)：設(shè)定0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%共6個(gè)EMS誘變濃度處理淮豆13、淮豆16、淮豆18共3個(gè)夏大豆品種8 h，最終選擇誘變適宜濃度為0.4%，此時(shí)3個(gè)品種的發(fā)芽率都在40%左右。

1.2.2誘變處理

以預(yù)試驗(yàn)篩選到的合適EMS誘變濃度，即0.4%EMS溶液處理已浸泡2 h的淮豆13大豆籽粒共4 kg（約20 000粒），8 h后使用硫代硫酸鈉溶液中止處理，然后使用流水沖洗4 h，晾干后立即播種。

1.3種植條件

2020年6月下旬，將處理好的淮豆13大豆種子播種于淮安現(xiàn)代農(nóng)業(yè)高新科技園，秋天單株收獲，不作選擇；2021年將2020年收獲的單株種子種植成株行，每個(gè)單株種植1行，并種野生型材料作為對(duì)照，全生育期考察性狀并拍照記錄，秋天淘汰無(wú)任何明顯突變的株行，有明顯表型變異的株行全部單株收獲；2022年，將2021年收獲的單株每袋取20粒種植成株行，繼續(xù)驗(yàn)證表型，并單株收獲，純化材料；2023年繼續(xù)將上一代收獲的材料種植成株行，驗(yàn)證表型，純化材料。

1.4表型性狀調(diào)查及篩選

M2世代以野生型淮豆13為對(duì)照，每隔5 d調(diào)查記錄葉形、葉色、株高、花色、種子顏色、莢顏色、熟期等性狀；M3世代根據(jù)M2世代的篩選結(jié)果，進(jìn)一步確定表型；M4世代主要詳細(xì)考察重要突變體的主要農(nóng)藝性狀，探索各突變體的育種利用潛力。

1.5種子大小比較

本研究采用2種方法直觀地比較種子大小，其一是將30粒種子排成1排，比較每排的長(zhǎng)度；其二是選擇一個(gè)直徑為5 cm的圓盤，用大豆種子裝滿圓盤，比較填滿圓盤時(shí)的大豆種子數(shù)量。

1.6灰毛突變體遺傳分析

從大豆基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.soybase.org/sgn/）中獲取大豆茸毛色控制基因T/t和Td/td的基因序列信息，并設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增灰毛突變體和野生型材料的啟動(dòng)子和編碼區(qū)序列，送生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果使用SnapGene軟件比對(duì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1突變體庫(kù)表型性狀分析

連續(xù)2個(gè)世代鑒定淮豆13 EMS誘變突變體庫(kù)表型，結(jié)果表明，M2世代共收獲452份材料，M3世代繼續(xù)鑒定，共有332份材料在M2和M3 2個(gè)世代中有明顯表型變異，由于許多突變體都是多器官同時(shí)存在變異，因此最終統(tǒng)計(jì)的突變類型總數(shù)達(dá)到了644份，所有突變體突變類型見(jiàn)表1，部分突變體照片見(jiàn)圖1。

2.1.1葉突變

在穩(wěn)定遺傳的突變體中，葉突變最多，包括苗期黃化（部分苗期死亡，部分后期返綠，部分不返綠）、全生育期整株淺黃、畸形葉以及多小葉等共計(jì)132份，占39.76%。

2.1.2莖突變

莖突變主要考察株高突變（莖稈粗細(xì)受種植密度影響較大，暫不考察），共發(fā)現(xiàn)高稈突變14份、矮稈突變26份。

2.1.3花突變

本突變體庫(kù)中并未發(fā)現(xiàn)紫花突變體，發(fā)現(xiàn)較多花期突變體，其中早花突變體34份、晚花突變體93份，其中發(fā)現(xiàn)1份超早花突變體，整株全生育期均表現(xiàn)為淺黃色，花期提前2周左右，生育期提前了10 d。

2.1.4莢突變

莢形突變中主要考察莢長(zhǎng)、莢寬、莢厚，共計(jì)80份突變體在莢寬方面有顯著變異，56份突變體在莢長(zhǎng)方面存在顯著變異，無(wú)厚薄莢突變體。

2.1.5種子突變

本研究重點(diǎn)考察了種子突變，共發(fā)現(xiàn)50份小粒突變和29份大粒突變，77份突變體存在裂皮變異。

2.1.6其他突變

發(fā)現(xiàn)1個(gè)灰毛突變株系，46個(gè)突變株系會(huì)分離出完全不育的單株，6個(gè)突變株系極易發(fā)生倒伏。

2.2淮豆13粒重突變體表型鑒定

淮豆13是一個(gè)綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良的夏大豆品種，擁有高產(chǎn)多抗廣適等多個(gè)優(yōu)點(diǎn)，然而其百粒重較低，為19 g，為找到較好的大粒突變體用作種質(zhì)資源來(lái)改良該品種，本研究重點(diǎn)關(guān)注了突變體庫(kù)中的粒重突變體。突變體庫(kù)M2世代共收獲452份材料，其百粒重介于10.2～31.2 g之間（圖2）。其中，百粒重介于10～14 g的材料共5份，占比為1.1%；百粒重介于＞14～18 g的材料共79份，占比為17.5%；百粒重介于＞18～22 g的材料共277份，占比為61.3%；百粒重介于＞22～26 g的材料共79份，占比為17.5%；百粒重介于＞26～30 g的材料共10份，占比為2.2%；百粒重介于＞30～34 g的材料共2份，占比為0.4%。

M2世代共鑒定出3個(gè)百粒重極顯著增加的大粒突變體，其中突變體CM13-6百粒重為31.15 g，和野生型材料（CK）20.87 g相比，百粒重提高49.26%；突變體CM13-10百粒重為30.27 g，對(duì)比野生型提高了45.04%；突變體CM13-21百粒重為27.22 g，對(duì)比野生型提高了30.43%。M3世代考種結(jié)果也進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)果，這3個(gè)突變體百粒重都顯著高于野生型材料。這3個(gè)突變株系在M2和M3世代的百粒重見(jiàn)圖3。

M3世代鑒定了這3個(gè)突變株系和另外1個(gè)突變株系CM13-28的豆莢尺寸，發(fā)現(xiàn)這4個(gè)突變株系在莢長(zhǎng)莢寬方面與野生型都有顯著性差異，在莢厚方面差異不顯著。這4個(gè)突變株系的豆莢和豆莢尺寸見(jiàn)圖4。

綜合以上結(jié)果，通過(guò)EMS誘變創(chuàng)制的淮豆13突變體庫(kù)在粒重方面變異較大，經(jīng)過(guò)連續(xù)2個(gè)世代的考種鑒定，獲得了3個(gè)能穩(wěn)定遺傳的大粒突變株系，且這3個(gè)大粒突變株系的莢長(zhǎng)和莢寬變化顯著，莢厚變化不顯著。

2.3M4世代3個(gè)大粒突變株系的考種表現(xiàn)

由于前2個(gè)世代可能突變位點(diǎn)并未純合，不利于準(zhǔn)確地考種分析，以及后續(xù)遺傳分析，M4世代繼續(xù)單株種植突變體庫(kù)材料。

為了育種實(shí)用性，考種的重點(diǎn)是這3個(gè)大粒突變株系，全面的考種分析結(jié)果（圖5）顯示：在株型性狀方面，即株高、底莢高度、分枝數(shù)、節(jié)數(shù)，除了株系CM13-10與野生型材料有顯著差異外，另外2個(gè)突變體株系和野生型材料差異不顯著。其中CM13-10的株高為55.5 cm，極顯著低于株高為82 cm的野生型材料；底莢高度和分枝數(shù)與野生型材料差異不大；節(jié)數(shù)為11節(jié)，極顯著少于14.5節(jié)的野生型材料。綜上所述，突變體株系CM13-6和CM13-21在株型方面變異不大，突變體株系CM13-10在株型方面變異較大，尤其是在株高和節(jié)數(shù)方面顯著降低。

針對(duì)與產(chǎn)量密切相關(guān)的4個(gè)性狀（即有效莢數(shù)、單株粒數(shù)、百粒重、單株粒重）的考種分析，發(fā)現(xiàn)這3個(gè)突變株系的百粒重都極顯著高于野生型材料，單株粒數(shù)和有效莢數(shù)都顯著或極顯著低于野生型材料，單株粒重與野生型材料相比無(wú)顯著差異。其中，CM13-6的百粒重為28.39 g，與野生型材料21.61 g相比增加了31.37%，CM13-10的百粒重為29.08 g，與野生型材料相比增加了34.57%，CM13-21 的百粒重為26.92 g，與野生型材料相比增加了24.57%，說(shuō)明這3個(gè)突變體百粒重增大的表型是能穩(wěn)定遺傳的。然而這3個(gè)突變體在有效莢數(shù)和單株粒數(shù)方面卻極顯著低于野生型材料，其中突變株系CM13-10的有效莢數(shù)和單株粒數(shù)降低最多，CM13-21的有效莢數(shù)和單株粒數(shù)降低最少。

這3個(gè)突變株系單株產(chǎn)量的考種結(jié)果顯示，這3個(gè)突變株系的單株產(chǎn)量與野生型材料相比有少量降低，然而降低幅度不顯著，說(shuō)明這3個(gè)突變體在育種方面具有一定的利用潛力，后期可以用來(lái)改良淮豆13的種子大小。

2.4灰毛突變體初步遺傳分析

大豆茸毛色可大致分為3種類型，即棕毛、淺棕毛和灰毛，主要由2對(duì)基因（T/t和Td/td）參與調(diào)控。其中棕毛基因型為TT TdTd，淺棕毛基因型為TT tdtd和Tt tdtd，灰毛基因型為tt TdTd、ttTdtd或tt tdtd［16-17］。本研究共發(fā)現(xiàn)1個(gè)灰毛突變株系，植株照片見(jiàn)圖6。

測(cè)序結(jié)果（圖7）顯示，T基因第5 942位外顯子區(qū)域存在1個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP）變異，使得T基因第308位絲氨酸密碼子突變?yōu)榻K止密碼子，翻譯提前結(jié)束，產(chǎn)生了無(wú)功能的類黃酮-3′-羥基化酶，從而產(chǎn)生了灰毛表型。

3結(jié)論與討論

3.1成功構(gòu)建淮豆13 EMS誘變突變體庫(kù)

創(chuàng)制突變體是種質(zhì)資源創(chuàng)新的有效途徑之一，也是植物功能基因組研究的有力工具之一［18-19］。目前，利用誘變技術(shù)已經(jīng)在擬南芥、小麥、水稻、玉米、油菜、大豆等多種作物中構(gòu)建了突變體庫(kù)，并在功能基因組研究和作物育種中發(fā)揮了重要的作用。王迪等利用N-甲基-N-亞硝基脲（MNU）化學(xué)誘變粳稻品種淮稻5號(hào)，從中篩選得到了512個(gè)表型穩(wěn)定的突變體，并利用MutMap技術(shù)定位到了多個(gè)突變位點(diǎn)，為解析淮稻5號(hào)農(nóng)藝性狀提供了豐富的研究材料［20］。Slade等利用EMS技術(shù)誘變六倍體小麥，從中篩選得到了多個(gè)Waxy基因突變體，并利用重組技術(shù)獲得了有生產(chǎn)利用價(jià)值的糯粒小麥［21］。連曉榮等利用EMS誘變鄭58自交系花粉，獲得多個(gè)農(nóng)藝性狀變異的突變體，為玉米遺傳育種提供了豐富的種質(zhì)資源［22］。吳志醫(yī)等通過(guò)低硫環(huán)境篩選南農(nóng)86-4和南農(nóng)94-16 EMS誘變突變體庫(kù)，從中篩選得到了2個(gè)低硫敏感突變體和2個(gè)低硫耐受突變體，為研究大豆低硫調(diào)控機(jī)制以及培育低硫耐受大豆提供了材料［23］。本研究利用EMS誘變夏大豆品種淮豆13，共獲得了332份穩(wěn)定遺傳的突變體材料，突變范圍涵蓋了各個(gè)組織器官，創(chuàng)制了豐富的變異，為后續(xù)研究淮豆13農(nóng)藝性狀的遺傳機(jī)制提供了材料。

3.2成功篩選得到3個(gè)有較大育種和遺傳學(xué)研究利用潛力的大粒突變體

大豆籽粒消費(fèi)市場(chǎng)更青睞大籽粒大豆，市面上大籽粒大豆單價(jià)更高，為提高品種競(jìng)爭(zhēng)力，有必要改良優(yōu)良品種的小籽粒表型?；炊?3是江蘇省主推的夏大豆品種之一，該品種產(chǎn)量?jī)?yōu)勢(shì)明顯，2015年生產(chǎn)試驗(yàn)平均產(chǎn)量為221.74 kg/667 m2，居首位，較對(duì)照徐豆13增產(chǎn)7.45%，多年推廣種植反饋良好；由于其母本為江蘇本地主推品種淮豆4號(hào)，父本為美國(guó)大豆品種Forrest，使得該品種具有較廣的遺傳基礎(chǔ)，具有良好的適應(yīng)性，能跨多個(gè)緯度推廣種植，且對(duì)旱澇等災(zāi)害都有良好的抗性［14-15］。然而該品種的百粒重為19 g左右，不能完全適應(yīng)目前的大豆籽粒消費(fèi)市場(chǎng)需求。本研究經(jīng)過(guò)3個(gè)世代的嚴(yán)格篩選，從淮豆13突變體庫(kù)中篩選得到了3個(gè)籽粒顯著增大的突變體，百粒重都在25 g以上，可以很好地滿足市場(chǎng)需求，同時(shí)，考種數(shù)據(jù)表明，這3個(gè)突變體除了CM13-10植株表現(xiàn)為矮小，另外2個(gè)突變體在株型方面與野生型差異不顯著；同時(shí)，這3個(gè)突變體雖然單株粒數(shù)有較大程度地減少，但其單株粒重卻與野生型相比下降不顯著，這說(shuō)明這3個(gè)突變體材料都有較好的育種利用潛力。下個(gè)世代可以進(jìn)一步關(guān)注這3個(gè)品種的田間抗性表現(xiàn)以及產(chǎn)量表現(xiàn)，以更好地明確這3個(gè)突變體的育種利用潛力；此外，通過(guò)與傳統(tǒng)育種技術(shù)結(jié)合，使用突變體材料與野生型材料雜交，通過(guò)篩選雜交后代，也有較大可能打破大粒基因與其他基因的連鎖，使得在提高淮豆13籽粒大小的同時(shí)，盡量減小對(duì)其他農(nóng)藝性狀的影響。

此外，后續(xù)研究將重點(diǎn)關(guān)注這3個(gè)突變體大粒突變位點(diǎn)的基因定位，以及調(diào)控機(jī)制研究，后續(xù)工作的重點(diǎn)將集中在淮豆13籽粒大小調(diào)控機(jī)制的解析上面。

3.3點(diǎn)突變產(chǎn)生了灰毛表型

茸毛色是描述大豆特征的一個(gè)基本質(zhì)量性狀，該表型由2對(duì)基因調(diào)控，其中T基因編碼類黃酮-3′-羥基化酶，該基因隱性時(shí)植株表現(xiàn)為灰毛表型，當(dāng)該基因顯性時(shí)，可表現(xiàn)為棕毛或者淺棕毛，此時(shí)主要受Td/td基因調(diào)控，TdTd和Tdtd表現(xiàn)為棕毛，tdtd表現(xiàn)為淺棕毛［16-17］。本研究發(fā)現(xiàn)1個(gè)灰毛突變體，與野生型相比，除了表現(xiàn)為灰毛性狀外無(wú)其他差異。測(cè)序分析結(jié)果顯示T基因第5 942位SNP變異造成第308位絲氨酸密碼子突變?yōu)榻K止密碼子，使得翻譯提前終止，而無(wú)法產(chǎn)生具有活性的類黃酮-3′-羥基化酶，從而產(chǎn)生了灰毛表型。本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了EMS誘變產(chǎn)生點(diǎn)突變從而改變質(zhì)量性狀的可能性。

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