摘要：淮豆13是一個高產廣適多抗夏大豆品種，但百粒重偏低，為改良其百粒重性狀，利用EMS（甲基磺酸乙酯）處理4 kg淮豆13種子，并進行連續(xù)4個世代的表型考察及篩選，同時對其中1個質量性狀變異突變體進行了遺傳解析。結果表明，經過M2和M3 2個世代篩選，獲得了332個穩(wěn)定遺傳的突變體株系，涵蓋莖稈、花、種子等多種類型的突變；篩選得到多個粒重增加或減少的材料，其中包括3個百粒重達28 g左右的突變體，M4世代表型驗證表明這3個粒重增大突變體單株產量無顯著降低；此外，還鑒定得到了1個灰毛突變體，其農藝性狀與野生型無差異，測序比對分析結果顯示T基因第5 942位堿基替換導致了終止密碼子的出現(xiàn)，從而產生了灰毛表型。本研究成功地構造了變異豐富的淮豆13 EMS誘變突變體庫，且成功篩選得到了3個單株產量不顯著降低但百粒重顯著增加的突變體株系，以及發(fā)現(xiàn)了1個點突變導致的灰毛突變體；為后續(xù)淮豆13品種改良提供了有價值的育種種質資源，也為后續(xù)淮豆13農藝性狀遺傳機理解析提供了豐富的遺傳研究材料。

關鍵詞：淮豆13；EMS誘變；大豆；大粒；突變體

中圖分類號：S565.103文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2025）02-0128-08

甲基磺酸乙酯（EMS）誘變是一種有效的化學誘變方法，其作用原理是甲基磺酸乙酯使得DNA堿基烷基化而產生DNA序列改變，誘發(fā)點突變［1-3］。由于突變率較高，能打破基因連鎖，提高重組率，且突變體后代容易篩選，誘導突變的方式多為點突變，便于遺傳定位研究等諸多優(yōu)點，EMS誘變已成為多種作物人工誘變育種的成熟技術之一，已成功誘導并獲得多個農作物新種質［4-6］。

大豆種子大小是大豆重要的產量性狀之一，同時還在很大程度上影響大豆的商品性，由于市場偏好性，目前大籽粒大豆更受青睞。研究表明，多個生物學途徑參與了大豆種子大小調控的過程［7］，如泛素蛋白酶體途徑［8-10］、G蛋白［11］、轉錄因子［12］、植物激素［13］等，使得大豆種子大小相關研究變得復雜。由于大豆種子大小和大豆產量直接相關，解析大豆種子大小調控機制對于大豆育種意義重大。本研究使用EMS誘變創(chuàng)建大豆突變體庫，篩選大粒種子突變體，以期為后續(xù)大豆種子大小相關研究準備試驗材料。

淮豆13是江蘇徐淮地區(qū)淮陰農業(yè)科學研究所育成的1個夏大豆新品種，該品種具有諸多優(yōu)點，尤其在高產、廣適和多抗方面表現(xiàn)優(yōu)秀［14-15］。然而，該品種籽粒較小，百粒重為19 g左右，在大豆市場不具有價格優(yōu)勢。本研究利用EMS誘變淮豆13種子，創(chuàng)建突變體庫，旨在篩選多個淮豆13大粒突變體作為種質資源，用以改良淮豆13的籽粒大小。

1材料與方法

1.1供試材料

選擇江蘇徐淮地區(qū)淮陰農業(yè)科學研究所育成的夏大豆品種淮豆13為誘變材料；誘變濃度篩選預試驗以淮豆13、淮豆16和淮豆18為試驗材料。

1.2誘變處理條件

1.2.1誘變濃度篩選

預試驗：設定0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%共6個EMS誘變濃度處理淮豆13、淮豆16、淮豆18共3個夏大豆品種8 h，最終選擇誘變適宜濃度為0.4%，此時3個品種的發(fā)芽率都在40%左右。

1.2.2誘變處理

以預試驗篩選到的合適EMS誘變濃度，即0.4%EMS溶液處理已浸泡2 h的淮豆13大豆籽粒共4 kg（約20 000粒），8 h后使用硫代硫酸鈉溶液中止處理，然后使用流水沖洗4 h，晾干后立即播種。

1.3種植條件

2020年6月下旬，將處理好的淮豆13大豆種子播種于淮安現(xiàn)代農業(yè)高新科技園，秋天單株收獲，不作選擇；2021年將2020年收獲的單株種子種植成株行，每個單株種植1行，并種野生型材料作為對照，全生育期考察性狀并拍照記錄，秋天淘汰無任何明顯突變的株行，有明顯表型變異的株行全部單株收獲；2022年，將2021年收獲的單株每袋取20粒種植成株行，繼續(xù)驗證表型，并單株收獲，純化材料；2023年繼續(xù)將上一代收獲的材料種植成株行，驗證表型，純化材料。

1.4表型性狀調查及篩選

M2世代以野生型淮豆13為對照，每隔5 d調查記錄葉形、葉色、株高、花色、種子顏色、莢顏色、熟期等性狀；M3世代根據M2世代的篩選結果，進一步確定表型；M4世代主要詳細考察重要突變體的主要農藝性狀，探索各突變體的育種利用潛力。

1.5種子大小比較

本研究采用2種方法直觀地比較種子大小，其一是將30粒種子排成1排，比較每排的長度；其二是選擇一個直徑為5 cm的圓盤，用大豆種子裝滿圓盤，比較填滿圓盤時的大豆種子數量。

1.6灰毛突變體遺傳分析

從大豆基因組數據庫（https：//www.soybase.org/sgn/）中獲取大豆茸毛色控制基因T/t和Td/td的基因序列信息，并設計引物擴增灰毛突變體和野生型材料的啟動子和編碼區(qū)序列，送生物公司測序，測序結果使用SnapGene軟件比對分析。

2結果與分析

2.1突變體庫表型性狀分析

連續(xù)2個世代鑒定淮豆13 EMS誘變突變體庫表型，結果表明，M2世代共收獲452份材料，M3世代繼續(xù)鑒定，共有332份材料在M2和M3 2個世代中有明顯表型變異，由于許多突變體都是多器官同時存在變異，因此最終統(tǒng)計的突變類型總數達到了644份，所有突變體突變類型見表1，部分突變體照片見圖1。

2.1.1葉突變

在穩(wěn)定遺傳的突變體中，葉突變最多，包括苗期黃化（部分苗期死亡，部分后期返綠，部分不返綠）、全生育期整株淺黃、畸形葉以及多小葉等共計132份，占39.76%。

2.1.2莖突變

莖突變主要考察株高突變（莖稈粗細受種植密度影響較大，暫不考察），共發(fā)現(xiàn)高稈突變14份、矮稈突變26份。

2.1.3花突變

本突變體庫中并未發(fā)現(xiàn)紫花突變體，發(fā)現(xiàn)較多花期突變體，其中早花突變體34份、晚花突變體93份，其中發(fā)現(xiàn)1份超早花突變體，整株全生育期均表現(xiàn)為淺黃色，花期提前2周左右，生育期提前了10 d。

2.1.4莢突變

莢形突變中主要考察莢長、莢寬、莢厚，共計80份突變體在莢寬方面有顯著變異，56份突變體在莢長方面存在顯著變異，無厚薄莢突變體。

2.1.5種子突變

本研究重點考察了種子突變，共發(fā)現(xiàn)50份小粒突變和29份大粒突變，77份突變體存在裂皮變異。

2.1.6其他突變

發(fā)現(xiàn)1個灰毛突變株系，46個突變株系會分離出完全不育的單株，6個突變株系極易發(fā)生倒伏。

2.2淮豆13粒重突變體表型鑒定

淮豆13是一個綜合農藝性狀優(yōu)良的夏大豆品種，擁有高產多抗廣適等多個優(yōu)點，然而其百粒重較低，為19 g，為找到較好的大粒突變體用作種質資源來改良該品種，本研究重點關注了突變體庫中的粒重突變體。突變體庫M2世代共收獲452份材料，其百粒重介于10.2～31.2 g之間（圖2）。其中，百粒重介于10～14 g的材料共5份，占比為1.1%；百粒重介于＞14～18 g的材料共79份，占比為17.5%；百粒重介于＞18～22 g的材料共277份，占比為61.3%；百粒重介于＞22～26 g的材料共79份，占比為17.5%；百粒重介于＞26～30 g的材料共10份，占比為2.2%；百粒重介于＞30～34 g的材料共2份，占比為0.4%。

M2世代共鑒定出3個百粒重極顯著增加的大粒突變體，其中突變體CM13-6百粒重為31.15 g，和野生型材料（CK）20.87 g相比，百粒重提高49.26%；突變體CM13-10百粒重為30.27 g，對比野生型提高了45.04%；突變體CM13-21百粒重為27.22 g，對比野生型提高了30.43%。M3世代考種結果也進一步驗證了這一結果，這3個突變體百粒重都顯著高于野生型材料。這3個突變株系在M2和M3世代的百粒重見圖3。

M3世代鑒定了這3個突變株系和另外1個突變株系CM13-28的豆莢尺寸，發(fā)現(xiàn)這4個突變株系在莢長莢寬方面與野生型都有顯著性差異，在莢厚方面差異不顯著。這4個突變株系的豆莢和豆莢尺寸見圖4。

綜合以上結果，通過EMS誘變創(chuàng)制的淮豆13突變體庫在粒重方面變異較大，經過連續(xù)2個世代的考種鑒定，獲得了3個能穩(wěn)定遺傳的大粒突變株系，且這3個大粒突變株系的莢長和莢寬變化顯著，莢厚變化不顯著。

2.3M4世代3個大粒突變株系的考種表現(xiàn)

由于前2個世代可能突變位點并未純合，不利于準確地考種分析，以及后續(xù)遺傳分析，M4世代繼續(xù)單株種植突變體庫材料。

為了育種實用性，考種的重點是這3個大粒突變株系，全面的考種分析結果（圖5）顯示：在株型性狀方面，即株高、底莢高度、分枝數、節(jié)數，除了株系CM13-10與野生型材料有顯著差異外，另外2個突變體株系和野生型材料差異不顯著。其中CM13-10的株高為55.5 cm，極顯著低于株高為82 cm的野生型材料；底莢高度和分枝數與野生型材料差異不大；節(jié)數為11節(jié)，極顯著少于14.5節(jié)的野生型材料。綜上所述，突變體株系CM13-6和CM13-21在株型方面變異不大，突變體株系CM13-10在株型方面變異較大，尤其是在株高和節(jié)數方面顯著降低。

針對與產量密切相關的4個性狀（即有效莢數、單株粒數、百粒重、單株粒重）的考種分析，發(fā)現(xiàn)這3個突變株系的百粒重都極顯著高于野生型材料，單株粒數和有效莢數都顯著或極顯著低于野生型材料，單株粒重與野生型材料相比無顯著差異。其中，CM13-6的百粒重為28.39 g，與野生型材料21.61 g相比增加了31.37%，CM13-10的百粒重為29.08 g，與野生型材料相比增加了34.57%，CM13-21 的百粒重為26.92 g，與野生型材料相比增加了24.57%，說明這3個突變體百粒重增大的表型是能穩(wěn)定遺傳的。然而這3個突變體在有效莢數和單株粒數方面卻極顯著低于野生型材料，其中突變株系CM13-10的有效莢數和單株粒數降低最多，CM13-21的有效莢數和單株粒數降低最少。

這3個突變株系單株產量的考種結果顯示，這3個突變株系的單株產量與野生型材料相比有少量降低，然而降低幅度不顯著，說明這3個突變體在育種方面具有一定的利用潛力，后期可以用來改良淮豆13的種子大小。

2.4灰毛突變體初步遺傳分析

大豆茸毛色可大致分為3種類型，即棕毛、淺棕毛和灰毛，主要由2對基因（T/t和Td/td）參與調控。其中棕毛基因型為TT TdTd，淺棕毛基因型為TT tdtd和Tt tdtd，灰毛基因型為tt TdTd、ttTdtd或tt tdtd［16-17］。本研究共發(fā)現(xiàn)1個灰毛突變株系，植株照片見圖6。

測序結果（圖7）顯示，T基因第5 942位外顯子區(qū)域存在1個單核苷酸多態(tài)性（SNP）變異，使得T基因第308位絲氨酸密碼子突變?yōu)榻K止密碼子，翻譯提前結束，產生了無功能的類黃酮-3′-羥基化酶，從而產生了灰毛表型。

3結論與討論

3.1成功構建淮豆13 EMS誘變突變體庫

創(chuàng)制突變體是種質資源創(chuàng)新的有效途徑之一，也是植物功能基因組研究的有力工具之一［18-19］。目前，利用誘變技術已經在擬南芥、小麥、水稻、玉米、油菜、大豆等多種作物中構建了突變體庫，并在功能基因組研究和作物育種中發(fā)揮了重要的作用。王迪等利用N-甲基-N-亞硝基脲（MNU）化學誘變粳稻品種淮稻5號，從中篩選得到了512個表型穩(wěn)定的突變體，并利用MutMap技術定位到了多個突變位點，為解析淮稻5號農藝性狀提供了豐富的研究材料［20］。Slade等利用EMS技術誘變六倍體小麥，從中篩選得到了多個Waxy基因突變體，并利用重組技術獲得了有生產利用價值的糯粒小麥［21］。連曉榮等利用EMS誘變鄭58自交系花粉，獲得多個農藝性狀變異的突變體，為玉米遺傳育種提供了豐富的種質資源［22］。吳志醫(yī)等通過低硫環(huán)境篩選南農86-4和南農94-16 EMS誘變突變體庫，從中篩選得到了2個低硫敏感突變體和2個低硫耐受突變體，為研究大豆低硫調控機制以及培育低硫耐受大豆提供了材料［23］。本研究利用EMS誘變夏大豆品種淮豆13，共獲得了332份穩(wěn)定遺傳的突變體材料，突變范圍涵蓋了各個組織器官，創(chuàng)制了豐富的變異，為后續(xù)研究淮豆13農藝性狀的遺傳機制提供了材料。

3.2成功篩選得到3個有較大育種和遺傳學研究利用潛力的大粒突變體

大豆籽粒消費市場更青睞大籽粒大豆，市面上大籽粒大豆單價更高，為提高品種競爭力，有必要改良優(yōu)良品種的小籽粒表型?；炊?3是江蘇省主推的夏大豆品種之一，該品種產量優(yōu)勢明顯，2015年生產試驗平均產量為221.74 kg/667 m2，居首位，較對照徐豆13增產7.45%，多年推廣種植反饋良好；由于其母本為江蘇本地主推品種淮豆4號，父本為美國大豆品種Forrest，使得該品種具有較廣的遺傳基礎，具有良好的適應性，能跨多個緯度推廣種植，且對旱澇等災害都有良好的抗性［14-15］。然而該品種的百粒重為19 g左右，不能完全適應目前的大豆籽粒消費市場需求。本研究經過3個世代的嚴格篩選，從淮豆13突變體庫中篩選得到了3個籽粒顯著增大的突變體，百粒重都在25 g以上，可以很好地滿足市場需求，同時，考種數據表明，這3個突變體除了CM13-10植株表現(xiàn)為矮小，另外2個突變體在株型方面與野生型差異不顯著；同時，這3個突變體雖然單株粒數有較大程度地減少，但其單株粒重卻與野生型相比下降不顯著，這說明這3個突變體材料都有較好的育種利用潛力。下個世代可以進一步關注這3個品種的田間抗性表現(xiàn)以及產量表現(xiàn)，以更好地明確這3個突變體的育種利用潛力；此外，通過與傳統(tǒng)育種技術結合，使用突變體材料與野生型材料雜交，通過篩選雜交后代，也有較大可能打破大?；蚺c其他基因的連鎖，使得在提高淮豆13籽粒大小的同時，盡量減小對其他農藝性狀的影響。

此外，后續(xù)研究將重點關注這3個突變體大粒突變位點的基因定位，以及調控機制研究，后續(xù)工作的重點將集中在淮豆13籽粒大小調控機制的解析上面。

3.3點突變產生了灰毛表型

茸毛色是描述大豆特征的一個基本質量性狀，該表型由2對基因調控，其中T基因編碼類黃酮-3′-羥基化酶，該基因隱性時植株表現(xiàn)為灰毛表型，當該基因顯性時，可表現(xiàn)為棕毛或者淺棕毛，此時主要受Td/td基因調控，TdTd和Tdtd表現(xiàn)為棕毛，tdtd表現(xiàn)為淺棕毛［16-17］。本研究發(fā)現(xiàn)1個灰毛突變體，與野生型相比，除了表現(xiàn)為灰毛性狀外無其他差異。測序分析結果顯示T基因第5 942位SNP變異造成第308位絲氨酸密碼子突變?yōu)榻K止密碼子，使得翻譯提前終止，而無法產生具有活性的類黃酮-3′-羥基化酶，從而產生了灰毛表型。本研究進一步驗證了EMS誘變產生點突變從而改變質量性狀的可能性。

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