摘要：為研究青花菜自交不親和反應(yīng)過程中最適內(nèi)參基因與自交不親和相關(guān)基因的表達(dá)，以青花菜自交不親和系BOP04-28-16開花期分別取不同器官、花的不同組織部位、不同發(fā)育時期的花蕾和不同授粉時期柱頭4個組合為試驗材料，利用實時熒光定量PCR技術(shù)及3個RT-qPCR分析軟件GeNorm、NormFinder和BestKeeper檢測了17個候選內(nèi)參基因分別在4個組合中的表達(dá)水平。結(jié)果表明，在不同組織部位中的穩(wěn)定內(nèi)參基因為UBC7、Actin-1、UBC9；在花的不同部位中穩(wěn)定的內(nèi)參基因為DNAJ、Tubα-3；在不同發(fā)育時期花蕾中穩(wěn)定的內(nèi)參基因為Actin-7、UBC7、Actin-3；在4個不同授粉時期柱頭中穩(wěn)定的內(nèi)參基因為Actin-7、His。綜合分析認(rèn)為，UBC7和Actin-7為青花菜SI中最適合的內(nèi)參基因組合，并以其分別分析青花菜柱頭S位點受體激酶基因（SRK）在花的不同組織部位和不同授粉時期柱頭的表達(dá)水平進(jìn)行驗證篩選的可靠性，結(jié)果顯示SRK基因在柱頭中特異表達(dá)，并且與柱頭的發(fā)育成熟性成正相關(guān)。研究結(jié)果為開展青花菜自交不親和相關(guān)基因的表達(dá)特征分析提供了穩(wěn)定的內(nèi)參基因，為后續(xù)開展關(guān)鍵基因的挖掘、利用以及自交不親和分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)解析奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：青花菜；自交不親和；內(nèi)參基因；SRK

中圖分類號：S635.301文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2025）02-0034-10

青花菜（Brassica oleracea var. italica）別稱西藍(lán)花，是十字花科蕓薹屬甘藍(lán)種的變種，原產(chǎn)于地中海東部沿岸地區(qū)，營養(yǎng)價值十分豐富，被譽(yù)為“蔬菜皇冠”［1-2］。隨著人們生活水平的日益提高，對青花菜產(chǎn)品的需求逐年增加。近10年來，我國青花菜播種面積已超過10萬hm2，年產(chǎn)量約400萬t，這在保持我國蔬菜周年供應(yīng)和出口創(chuàng)匯方面起著關(guān)鍵作用［3］。雜種優(yōu)勢是提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)的重要途徑，開展青花菜雜種優(yōu)勢利用的研究，選育優(yōu)質(zhì)雜交種，是當(dāng)前青花菜育種的主攻方向，其中利用自交不親和系來生產(chǎn)雜種1代則是青花菜等十字花科作物雜種優(yōu)勢利用的重中之重［4-5］。

自交不親和性（self-incompatibility，SI）是指植物能產(chǎn)生功能正常的有生育能力的雌雄配子，但是自花授粉后不能結(jié)籽的現(xiàn)象［6-8］。青花菜屬于嚴(yán)重自交不親和作物，在青花菜親本繁種過程中需要人工剝蕾授粉，極大地增加了種子生產(chǎn)的成本和勞動強(qiáng)度［4-6］。隨著我國對青花菜自主品種選育的日益重視，自交不親和造成的青花菜親本繁育問題越發(fā)制約青花菜育種進(jìn)程，開展青花菜SI的相關(guān)分子機(jī)制研究尤為重要［4-7］。蕓薹屬植物自交不親和方面的研究發(fā)現(xiàn)，自交不親和反應(yīng)的發(fā)生與雌蕊柱頭組織的生長發(fā)育水平有著極為密切的關(guān)系［8-11］。現(xiàn)有關(guān)于自交不親和反應(yīng)的報道中重要基因主要包括2個方面：一方面是雌性識別因子S位點受體激酶（S-locus receptor kinase，SRK）基因［12］，另一方面是雄性識別因子S位點富半胱氨酸蛋白（S-locus cysteine-rich protein，SCR）基因和S位點蛋白11（S-locus protein 11，SP11）基因［13］。有報道表明，S位點糖蛋白（S-locus glycoprotein，SLG）基因和SRK等基因在柱頭組織特異性表達(dá)，并且隨著柱頭組織的發(fā)育成熟表達(dá)量會顯著上調(diào)［13-18］。因此準(zhǔn)確分析青花菜自交不親和相關(guān)基因在不同組織及柱頭不同發(fā)育階段的表達(dá)模式，對闡述相關(guān)基因在青花菜自交不親和及柱頭發(fā)育方面的功能是十分重要的。

實時熒光定量PCR（RT-qPCR）是一種用于評估基因表達(dá)量的通用技術(shù)，具有高重復(fù)性和高通量性［19-20］。大量研究表明，內(nèi)參基因的選擇不是固定不變的，在試驗材料及試驗條件不同的情況下研究者所選擇的內(nèi)參基因也是有所不同的，選擇的內(nèi)參基因是否適合可極大程度地影響RT-qPCR分析結(jié)果的準(zhǔn)確性［21-24］。具體則需要根據(jù)不同物種、不同試驗條件、不同組織器官和不同生長發(fā)育階段等因素分別進(jìn)行篩選和驗證內(nèi)參基因的可行性［20］。已有研究結(jié)果揭示了TUB4、DNAJ、UBQ和GAPDH等內(nèi)參基因涉及生物體的基本生化反應(yīng)過程（如中間代謝、蛋白翻譯等），并且被普遍應(yīng)用于各種植物之間的基因表達(dá)研究［25-28］。然而多數(shù)報道指出內(nèi)參基因的選擇具有相對性和非穩(wěn)定性［24-28］。在十字花科蔬菜中，已有的研究顯示甘藍(lán)中適用的內(nèi)參基因為Actin、Tip41和Tub-α6等，花椰菜中為SKIP16、ACT等［29-33］。但是，筆者所在課題組前期的研究顯示，適用于甘藍(lán)的內(nèi)參基因不適用于青花菜自交不親和相關(guān)基因的定量表達(dá)分析，因此推測青花菜自交不親和相關(guān)內(nèi)參基因的選擇與物種或基因型密切相關(guān)［29-34］?；诖耍狙芯吭谇嗷ú俗越徊挥H和識別反應(yīng)中系統(tǒng)地對候選內(nèi)參基因進(jìn)行篩選和驗證。

本研究根據(jù)已報道的內(nèi)參基因和筆者所在課題組已建立的青花菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，選取17個常見候選內(nèi)參基因［21-34］，使用GeNorm、NormFinder和BestKeeper等3個內(nèi)參基因篩選軟件進(jìn)行分析，比較了17個候選內(nèi)參基因在4個組合（青花菜不同器官、不同時期花蕾、花不同組織部位、不同授粉時期柱頭）中的表達(dá)情況［35-37］。利用篩選得到的內(nèi)參基因分析了青花菜自交不親和反應(yīng)中關(guān)鍵基因SRK的表達(dá)模式，驗證了最佳內(nèi)參基因的可靠性。研究結(jié)果以期為闡明SI相關(guān)基因的表達(dá)模式以及揭示SI的分子機(jī)制研究提供參考，同時為自交不親和的利用與克服提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗材料為筆者所在課題組保存的青花菜高代自交系BOP04-28-16，材料于2022年10月定植于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)金山基地。在次年4月青花菜開花期，分別取不同器官（根、莖、葉），花的不同組織部位（花梗、花托、萼片、花瓣、花藥、花絲、花期柱頭、子房），不同發(fā)育時期的花蕾（小于5 mm、大于 5 mm、完全花），不同授粉時期柱頭（蕾期柱頭、花期柱頭、自花授粉10 min柱頭、自花授粉30 min柱頭）為樣品。

1.2試驗方法

1.2.1試驗材料總RNA的提取和cDNA的合成

所有樣品的總RNA提取參照湖南艾科瑞公司提供的RNA提取試劑盒的說明書進(jìn)行。使用微量分光光度計對RNA的濃度與純度進(jìn)行檢測，最后使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。cDNA的合成參照湖南艾科瑞公司的Evo M-MLV RT Premix for qPCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進(jìn)行。

1.2.2候選內(nèi)參基因引物設(shè)計

在OligoArchitectTM Pyimer and probe Design網(wǎng)頁分別設(shè)計用于RT-qPCR的Actin-1、Actin-2、Actin-3、Actin-7、Tubα-6、TUBβ-4、UBC7、UBC9、UBQ、UKN1、CYP、DNAJ、EFα、EFβ、GAPDH、His、Tubα-3共17個候選內(nèi)參基因及SRK基因引物。引物相關(guān)信息見表1。

1.2.3候選內(nèi)參基因片段的PCR擴(kuò)增

以cDNA為模版， 利用所設(shè)計的候選內(nèi)參基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件參照試劑盒MegaFi Fidelity 2×PCR MasterMix說明書進(jìn)行，PCR產(chǎn)物最后使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，并分析產(chǎn)物大小，確定引物特異性。

1.2.4RT-qPCR分析

RT-qPCR分析包括候選內(nèi)參基因和SRK基因2個部分，SRK基因的RT-qPCR分析基于篩選獲得的內(nèi)參基因進(jìn)行開展。RT-qPCR 分析操作參照湖南艾科瑞公司的 SYBR Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒說明書進(jìn)行。每個樣品進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。

1.2.5數(shù)據(jù)分析

候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性利用GeNorm、NormFinder和BestKeeper等3款軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析［35-37］。GeNorm和NormFinder軟件需要輸入2-ΔΔCT值，即將Cq值轉(zhuǎn)換為相對表達(dá)量進(jìn)行分析；BestKeeper軟件則是以輸入原始數(shù)據(jù)（Cq值）分析［38］。3款軟件最后都是根據(jù)分析結(jié)果對各候選基因的穩(wěn)定性進(jìn)行排名，篩選出最適內(nèi)參基因。分析結(jié)果使用LightCycler"96 SW 1.1軟件、Minitab Statistical Software軟件、Microsoft Excel軟件、Photoshop CS5 Portable 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及作圖。

2結(jié)果與分析

2.1青花菜花蕾、柱頭及不同組織部位總RNA提取

分別提取不同器官（根、莖、葉），花的不同組織部位（花梗、花托、萼片、花瓣、花藥、花絲、花期柱頭、子房），不同發(fā)育時期的花蕾（小于5 mm、大于 5 mm、完全花），不同授粉時期柱頭（蕾期柱頭、花期柱頭、自花授粉10 min柱頭、自花授粉30 min柱頭）的總RNA。如圖1瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，所提取柱頭總RNA的18S條帶及28S條帶清晰，未發(fā)現(xiàn)明顯降解現(xiàn)象，適用于后續(xù)試驗。

2.2候選內(nèi)參基因的PCR擴(kuò)增分析

采用所提取葉片總RNA通過反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后，以葉片cDNA為模板對所設(shè)計的17對候選內(nèi)參基因引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果（圖2）顯示所設(shè)計候選內(nèi)參基因引物擴(kuò)增出的條帶清晰可見，并且單一無雜帶，適用于RT-qPCR的分析。

2.3候選內(nèi)參基因的RT-qPCR表達(dá)分析

分別對17個候選內(nèi)參基因進(jìn)行RT-qPCR檢測，結(jié)果顯示在所有樣品中，17個候選內(nèi)參基因的熔解曲線峰值明顯且單一，且擴(kuò)增曲線良好，可以滿足RT-qPCR的要求。候選內(nèi)參基因的表達(dá)量用Cq值表示，Cq值與基因的表達(dá)量成負(fù)相關(guān)，即Cq值越大，表達(dá)量越小。如圖3所示，內(nèi)參基因的Cq值在13～27之間，整體上UBC9的表達(dá)量較低（高Cq值），而EFα表達(dá)量較高（低Cq值）。大多數(shù)候選內(nèi)參基因的表達(dá)量Cq值分布比較集中，特別是Actin-1、Actin-7、UBC7等，說明其表達(dá)較為穩(wěn)定。

2.4候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的統(tǒng)計分析

2.4.1GeNorm軟件分析

GeNorm軟件判斷標(biāo)準(zhǔn)：表達(dá)相對穩(wěn)定的內(nèi)參基因其平均表達(dá)穩(wěn)定指數(shù)M值小于1.5，且M值越小，表達(dá)越穩(wěn)定，反之則表達(dá)不穩(wěn)定［38］。圖4-a中的結(jié)果表明，在青花菜不同器官中Actin-1、Actin-2是表達(dá)較為穩(wěn)定的內(nèi)參基因；在花的不同組織部位中EFα和EFβ是表達(dá)較為穩(wěn)定的內(nèi)參基因；在不同發(fā)育時期花蕾中Actin-7和UBC7是表達(dá)較為穩(wěn)定的內(nèi)參基因；在不同授粉時期柱頭中Actin-7和UKN1是表達(dá)較為穩(wěn)定的內(nèi)參基因。GeNorm軟件可以通過計算出的配對變異值Vn/Vn+1來選擇最適內(nèi)參基因數(shù)目，判定標(biāo)準(zhǔn)為當(dāng)Vn/Vn+1lt;0.15時，則最合適內(nèi)參基因的數(shù)量是n個，反之則需要n+1個［38］。圖5中結(jié)果顯示，花的不同組織部位組合的V2/V3比值小于0.15，表明該組合最適內(nèi)參基因的數(shù)目為2個。

2.4.2NormFinder軟件分析

NormFinder軟件計算原理與GeNorm軟件相似，但該軟件只能篩選出一個最合適的內(nèi)參基因［38］。由表2可知，NormFinder軟件得出在不同組織部位中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是UBC9；在花的不同部位中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是Actin-1；在不同發(fā)育時期花蕾中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因為Actin-7；在不同授粉時期柱頭中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因為UBC7。

2.4.3BestKeeper軟件分析

BestKeeper軟件分析判定原則為相關(guān)系數(shù)越大、標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)越小、內(nèi)參基因穩(wěn)定性越好，反之，穩(wěn)定性越差；當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)偏差＞1時，則該內(nèi)參基因表達(dá)不穩(wěn)定［38］。此軟件分析17個候選基因穩(wěn)定性結(jié)果為在不同組織部位中表達(dá)較為穩(wěn)定的是Actin-3和UBC9（表3）；在花的不同部位中表達(dá)較為穩(wěn)定的是Actin-3和DNAJ（表4），有7個基因： UKN1、UBC9、UBQ、EFβ、TUBβ-4、Tubα-6、GAPDH，不符合內(nèi)參基因穩(wěn)定性要求，即標(biāo)準(zhǔn)偏差大于1；在不同發(fā)育時期的花蕾中表達(dá)較為穩(wěn)定的是His和UBQ（表5）；在不同授粉時期柱頭中表達(dá)較為穩(wěn)定的是DNAJ和Tubα-6（表6），有2個基因GAPDH和UBQ不符合內(nèi)參基因穩(wěn)定性要求。

綜合分析顯示，GeNorm軟件和NormFinder軟件分析結(jié)果相近，最穩(wěn)定的基因組合為UBC7和Actin-7。BestKeeper軟件分析結(jié)果稍有不同，表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因為Actin-3和DNAJ，但UBC7排名也僅次于最優(yōu)選。3款軟件中也得到一致的最差結(jié)果：GAPDH和Actin-2，說明其最不適合作為青花菜SI的內(nèi)參基因。綜合3款軟件的分析結(jié)果，認(rèn)為UBC7和Actin-7為青花菜SI中最適合內(nèi)參基因組合。

2.5SRK在不同組織和不同發(fā)育時期柱頭的表達(dá)分析

SRK等基因在柱頭組織特異性表達(dá)，并且會隨著柱頭組織的發(fā)育成熟表達(dá)量顯著上調(diào)［39-41］。因此為驗證篩選到的內(nèi)參基因的可行性， 筆者所在課題組對SRK基因在不同組織和不同發(fā)育時期柱頭中的表達(dá)進(jìn)行了分析。當(dāng)以穩(wěn)定內(nèi)參基因Actin-7分析SRK的表達(dá)時，結(jié)果顯示SRK在柱頭組織中特異表達(dá)，且表達(dá)量與柱頭熟性成正相關(guān)，當(dāng)以UBC7作為內(nèi)參基因時，SRK表現(xiàn)出相似的表達(dá)模式（圖6）。但是當(dāng)以最不穩(wěn)定的Actin-2和GAPDH作為內(nèi)參基因時，SRK在蕾期柱頭高表達(dá)，顯著高于花期柱頭，與柱頭熟性成負(fù)相關(guān)（圖7），與已報道SRK基因的表達(dá)模式不吻合。上述結(jié)果說明，在青花菜自交不親和相關(guān)基因的熒光定量PCR研究中，采用Actin-7和UBC7作為內(nèi)參基因進(jìn)行分析是可靠的。

3討論與結(jié)論

青花菜自交不親和相關(guān)基因表達(dá)模式分析中，選擇合適的內(nèi)參基因是得到準(zhǔn)確的定量分析結(jié)果的重要前提［31-37］。有報道顯示，內(nèi)參基因的選擇會隨著物種或組織的變化而有著不同的選擇，如青花菜花蕾發(fā)育過程中穩(wěn)定的內(nèi)參基因是XLOC_000400/XLOC_008536和XLOC_039609/XLOC_021473，抵御逆境脅迫中的穩(wěn)定內(nèi)參基因是XLOC_010342和XLOC_007980［42-43］；甘藍(lán)柱頭發(fā)育過程中穩(wěn)定的內(nèi)參基因是Tubα-6、Actin，非生物脅迫試驗條件下適應(yīng)的內(nèi)參基因是EF1a、GAPC2和SAND［32，44-45］。然而，上述內(nèi)參基因不適用筆者所在課題組前期青花菜SI相關(guān)基因的熒光定量，具體表現(xiàn)為不同SI基因的表達(dá)模式分析結(jié)果顯示其在不同組織的表達(dá)特異性不顯著以及在SI識別反應(yīng)前后表達(dá)量無明顯差異等。因此本研究系統(tǒng)地在青花菜中對相關(guān)候選內(nèi)參基因進(jìn)行了統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示，在近緣物種相關(guān)研究中穩(wěn)定的內(nèi)參基因?qū)τ谇嗷ú硕圆⒉皇亲顑?yōu)選，如Actin-1、Actin-2、DNAJ、UKN1、Actin-3及Tubα-6等，其中Actin-2驗證為不穩(wěn)定。因此在開展具有組織特異性基因表達(dá)特征分析時應(yīng)基于本物種或組織預(yù)先開發(fā)適用的內(nèi)參基因，而簡單地引用其他物種的已有報道具有潛在的試驗誤差。本研究以青花菜自交不親和系為材料，利用實時熒光定量PCR技術(shù)及3個RT-qPCR分析軟件GeNorm、NormFinder和BestKeeper檢測了17個候選內(nèi)參基因分別在4個組合中的表達(dá)水平，篩選獲得了適用于青花菜自交不親和相關(guān)基因的內(nèi)參基因。

綜合GeNorm、NormFinder及BestKeeper分析結(jié)果，認(rèn)為在不同組織部位中的穩(wěn)定內(nèi)參基因為UBC7、Actin-1、UBC9，不穩(wěn)定內(nèi)參基因為GAPDH、UKN1、His；在花的不同部位中穩(wěn)定的內(nèi)參基因為DNAJ、Tubα-3，不穩(wěn)定的內(nèi)參基因為GAPDH、Tubα-6、 TUBβ-4； 在不同發(fā)育時期花蕾中穩(wěn)定的內(nèi)參基因為Actin-7、UBC7、Actin-3，不穩(wěn)定的內(nèi)參基因為Actin-2、Tubα-6、UBC9；在不同授粉時期柱頭中穩(wěn)定的內(nèi)參基因為Actin-7、His，不穩(wěn)定的內(nèi)參基因為UBQ、GAPDH、Actin-2。在數(shù)據(jù)分析過程中，發(fā)現(xiàn)依據(jù)3個內(nèi)參基因篩選軟件直接得出的結(jié)果，無法直接選擇出最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。有研究顯示GeNorm軟件和NormFinder軟件有時可以得到大體一致的結(jié)果，有時也會得到差別很大的結(jié)果［46-48］。在本研究中，GeNorm軟件和NormFinder軟件篩選出穩(wěn)定內(nèi)參基因基本一致（Actin-7和UBC7）。BestKeeper軟件得出了不同結(jié)果（表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因為 Actin-3 和DNAJ），但UBC7的排名也僅次于 Actin-3 和DNAJ。值得注意的是3款軟件一致認(rèn)為不穩(wěn)定內(nèi)參基因是GAPDH和Actin-2。因此本研究綜合考慮了3個軟件中的結(jié)果，最終選出在青花菜中穩(wěn)定的內(nèi)參基因是Actin-7和UBC7，不穩(wěn)定的內(nèi)參基因是GAPDH和Actin-2。對于3款軟件所得的結(jié)論存在的一些差異，這可能是軟件對于內(nèi)參基因穩(wěn)定性的算法不同造成的［24，35-38］。

此外，通過篩選到的內(nèi)參基因分析青花菜自交不親和反應(yīng)中扮演著重要角色的基因SRK的表達(dá)情況可以驗證所篩選到的內(nèi)參基因的可行性，使用Actin-7和UBC7的分析結(jié)果顯示SRK在柱頭組織中特異表達(dá)，表達(dá)量與柱頭熟性成正相關(guān)，這個驗證結(jié)果與預(yù)期的已報道的SRK基因表達(dá)模式較為一致，也表明了在SI反應(yīng)中SRK作為雌性識別因子的重要性［39-41］；而不穩(wěn)定的內(nèi)參基因GAPDH和Actin-2的使用導(dǎo)致了SRK表達(dá)模式相反的結(jié)果。基于以上信息，不建議在青花菜SI中使用這2個基因。

本研究基于17個候選內(nèi)參基因的表達(dá)特性，系統(tǒng)地評估了其在青花菜SI相關(guān)基因定量表達(dá)研究的適用性，篩選獲得了2個適用的內(nèi)參基因Actin-7和UBC7，并通過驗證已報道的SRK的表達(dá)分析來說明本研究篩選結(jié)果的可行性。研究結(jié)果為開展青花菜自交不親和相關(guān)基因的表達(dá)特征分析提供了穩(wěn)定的內(nèi)參基因，為后續(xù)開展關(guān)鍵基因的挖掘、利用以及自交不親和分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)解析奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

［1］林俊城，吳秋云，高燦紅，等. 青花菜硫、硒代謝競爭及其對保健功能的影響研究進(jìn)展［J］. 中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報，2011，33（4）：422-432.

［2］解鴻蕾，車文靜，蘇越， 等. 十字花科蔬菜的抗癌作用［J］. 食品安全導(dǎo)刊，2022（34）：172-175.

［3］李占省，戚如詩，劉玉梅，等. 我國青花菜生產(chǎn)布局、價格變化及趨勢［J］. 長江蔬菜，2021（4）：1-5.

［4］吳名. 利用分子標(biāo)記輔助選育甘藍(lán)型油菜自交不親和系［D］. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

［5］寇小培. 分子標(biāo)記輔助選育甘藍(lán)型油菜自交不親和系［D］. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

［6］鄭敏，朱陳曾，劉夢慈，等. 基于SRK基因序列分析的甘藍(lán)自交不親和系單倍型鑒定及驗證［J］. 中國蔬菜，2018（3）：32-39.

［7］許明超，黃倩，張康妮，等. 甘藍(lán)型油菜隱性細(xì)胞核雄性不育系LY31AB的選育及利用［J］. 浙江大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2023，49（4）：507-515.

［8］Takasaki T，Hatakeyama K，Suzuki G，et al. The S receptor kinase determines self-incompatibility in Brassica stigma［J］. Nature，2000，403（6772）：913-916.

［9］Murase K，Shiba H，Iwano M，et al. A membrane-anchored protein kinase involved in Brassica self-incompatibility signaling［J］. Science，2004，303（5663）：1516-1519.

［10］Horisaki A，Niikura S. Developmental and environmental factors affecting level of self-incompatibility response in Brassica rapa L.［J］. Sexual Plant Reproduction，2008，21（2）：123-132.

［11］藍(lán)興國，楊佳，趙昕，等. 羽衣甘藍(lán)ARC1的基因分離、表達(dá)及與SRK相互作用的分析［J］. 園藝學(xué)報，2011，38（12）：2342-2348.

［12］Kusaba M，Matsushita M，Okazaki K，et al. Sequence and structural diversity of the S locus genes [JP3]from different lines with the same self-recognition specificities in Brassica oleracea［J］. Genetics，2000，154（1）：413-420.

［13］Schopfer C R，Nasrallah M E，Nasrallah J B，et al. The male determinant of self-incompatibility in Brassica［J］. Science，1999，286（5445）：1697-1700.

［14］魏小春，姚秋菊，原玉香，等. 大白菜高代自交系S單元型的分布［J］. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，44（11）：109-113，119.

［15］Die J V，Román B，Nadal S，et al. Evaluation of candidate reference genes for expression studies in Pisum sativum under different experimental conditions［J］. Planta，2010，232（1）：145-53.

［16］Fu J X，Wang Y，Huang H，et al. Reference gene selection for RT-qPCR analysis of Chrysanthemum lavandulifolium during its flowering stages［J］. Molecular Breeding，2013，31（1）：205-215.

［17］王成. 不結(jié)球白菜自交不親和相關(guān)基因及轉(zhuǎn)錄組分析［D］. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.

［18］江漢民，劉莉莉，徐嘉藝，等. 青花菜高代自交系S單元型的鑒定及SRK基因表達(dá)分析［J］. 南開大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2018，51（3）：60-65.

［19］Gachon C，Mingam A，Charrier B. Real-time PCR：what relevance to plant studies？［J］. Journal of Experimental Botany，2004，55（402）：1445-1454.

［20］袁偉，萬紅建，楊悅儉. 植物實時熒光定量PCR內(nèi)參基因的特點及選擇［J］. 植物學(xué)報，2012，47（4）：427-436.

［21］Albuquerque G M R，F(xiàn)onseca F C A，Boiteux L S，et al. Stability analysis of reference genes for RT-qPCR assays involving compatible and incompatible Ralstonia solanacearum-tomato ‘Hawaii 7996’ interactions［J］. Scientific Reports，2021，11（1）：18719.

［22］孫靜. 鐵皮石斛qPCR內(nèi)參基因的篩選及開花相關(guān)基因的表達(dá)分析［D］. 南京：南京師范大學(xué)，2017.

［23］Song J H，Yang J，Pan F，et al. Differential expression of micro RNAs may regulate pollen development in Brassica oleracea［J］. Genetics and Molecular Research，2015，14（4）：15024-15034.

［24］de Spiegelaere W，Dern-Wieloch J，Weigel R，et al. Reference gene validation for RT-qPCR，a note on different available software packages［J］. PLoS One，2017，10（3）：e0122515.

［25］Leelatanawit R，Saetung T，Phuengwas S，et al. Selection of reference genes for quantitative real-time PCR in postharvest tomatoes（Lycopersicon esculentum）treated by continuous low-voltage direct current electricity to increase secondary metabolites［J］. International Journal of Food Science amp; Technology，2017，52（9）：1942-1950.

［26］張穎，陳婉婷，陳冉紅，等. 杉木實時熒光定量PCR分析中內(nèi)參基因的選擇［J］. 林業(yè)科學(xué)研究，2019，32（2）：65-72.

［27］Xiao" X L，Ma J B，Wang J R，et al. Validation of suitable reference genes for gene expression analysis in the halophyte Salicornia europaea by real-time quantitative PCR［J］. Frontiers in Plant Science，2015，5（1）：788.

［28］Delporte M，Legrand G，Hilbert J L，et al. Selection and validation of reference genes for quantitative real-time PCR analysis of gene expression in Cichorium intybus［J］. Frontiers in Plant Science，2015，6（1）：651.

［29］左同鴻.甘藍(lán)SI相關(guān)基因BoPUB3L和BoGSTL21的克隆與分析［D］. 重慶：西南大學(xué)，2020.

［30］張彤. 甘藍(lán)型油菜自交不親和反應(yīng)候選基因的功能研究及挖掘［D］. 湖北：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2018.

［31］郭怡婷，孫世英，趙文菊，等. 球莖甘藍(lán)qRT-PCR內(nèi)參基因的篩選及穩(wěn)定性驗證［J］. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2024，59（1）：144-152.

［32］李晗，李治龍，李曉嶼，等. 羽衣甘藍(lán)不同組織及柱頭發(fā)育實時熒光定量PCR內(nèi)參基因的篩選［J］. 植物研究，2016，36（4）：565-572.

［33］張冠，楊迎霞，陸國清，等. 花椰菜花球中花青素合成相關(guān)基因qRT-PCR內(nèi)參基因的篩選［J］. 分子植物育種，2024，22（9）：2938-2946.

［34］Yan X，Zhang Q L，Zou J，et al. Selection of optimized reference genes for qRT-PCR normalization in Xanthomonas campestris pv. campestris cultured in different media［J］. Current Microbiology，2019，76（5）：613-619.

［35］Vandesompele J，de Preter K，Pattyn F，et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes［J］. Genome Biology，2002，3（7）：RESEARCH0034.

［36］Andersen C L，Jensen J L，rntoft T F. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data：a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization，applied to bladder and colon cancer data sets［J］. Cancer Research，2004，64（15）：5245-5250.

［37］Pfaffl M W，Tichopad A，Prgomet C，et al. Determination of stable housekeeping genes，differentially regulated target genes and sample integrity：BestKeeper-Excel-based tool using pair-wise correlations［J］. Biotechnology Letters，2004，26（6）：509-515.

［38］吳建陽，何冰，杜玉潔，等. 利用geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件進(jìn)行內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析的方法［J］. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2017（5）：278-281.

［39］楊琳. 受體激酶SRK與FERONIA調(diào)控大白菜遠(yuǎn)緣雜交生殖隔離的分子機(jī)制［D］. 山東：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2023.

［40］張以忠，曾文藝，鄧琳瓊，等. 甘藍(lán)S-位點基因SRK、SLG和SP11/SCR密碼子偏好性分析［J］. 作物學(xué)報，2022，48（5）：1152-1168.

［41］Chen W D，Zhang B，Ren W J，et al. An identification system targeting the SRK gene for selecting S-haplotypes and self-compatible lines in cabbage［J］. Plants，2022，11（10）：1372-1372.

［42］裴徐梨，馮鵬宇，唐征，等. 青花菜花蕾發(fā)育LncRNAs內(nèi)參基因篩選［J］. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2023，52（1）：125-133.

［43］裴徐梨，焦鵬，荊贊革，等. 非生物脅迫下青花菜LncRNA內(nèi)參基因的篩選［J］. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2023，32（4）：593-599.

［44］Zeng A S，Xu Y Y，Song L X，et al. Validation of suitable reference genes for qRT-PCR in cabbage（Brassica oleracea L.）under different abiotic stress experimental conditions［J］. Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology，2021，30（1）：184-195.

［45］李浩霞，黃穩(wěn)娥，柳西寧，等. 枸杞實時熒光定量RT-qPCR內(nèi)參基因篩選與驗證［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2023，51（9）：41-51.

［46］穆德添，萬凌云，章瑤，等. 鉤藤管家基因篩選及生物堿合成相關(guān)基因的表達(dá)分析［J］. 生物技術(shù)通報，2023，39（2）：126-138.

［47］Lee J M，Roche J R，Donaghy D J，et al. Validation of reference genes for quantitative RT-qPCR studies of gene expression in perennial ryegrass（Lolium perenne L.）［J］. BMC Molecular Biology，2010，11（1）：8.

［48］Li H，Qin Y，Xiao X，et al. Screening of valid reference genes for real-time RT-qPCR data normalization in Hevea brasiliensis and expression validation of a sucrose transporter gene HbSUT3［J］. Plant Science，2011，181（2）：132-139.