摘要：為了系統(tǒng)地研究煙草煙堿相關(guān)合成、運(yùn)輸、調(diào)控基因在不同組織器官的表達(dá)情況，以K326苗期7～75 d和盛花期的組織器官樣品為材料，采用熒光定量PCR的方法，通過對煙堿合成、運(yùn)輸、調(diào)控基因表達(dá)量的測定，探究煙堿相關(guān)基因的表達(dá)模式。表達(dá)模式分析結(jié)果表明，煙堿合成基因NtAO、NtQS、NtQPT1、NtQPT2、NtADC、NtMPO1、NtMPO2、NtSPDS、NtBBLa，煙堿轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtJAT1、NtJAT2、NtMATE1、NtMATE2、NtGEF，煙堿調(diào)控基因NtMYC2a、NtMYC2b、NtERF32、NtERF91、NtARF6、NtLNP1、Nt-miRNA2635為組成型表達(dá)，在各組織中均有表達(dá)；而煙堿合成基因NtPMTa1、NtA622，煙堿轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtNUP1和煙堿調(diào)控基因NtERF189在根中特異高表達(dá)，在其他組織部位表達(dá)量極低或幾乎不表達(dá)。

關(guān)鍵詞：煙堿；合成基因；轉(zhuǎn)運(yùn)基因；調(diào)控基因；熒光定量；表達(dá)模式

中圖分類號：S572.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2025）02-0023-11

煙堿別稱尼古丁，是煙草次生代謝的產(chǎn)物，是影響煙葉品質(zhì)最重要的化學(xué)成分［1］，因此探究煙堿合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、調(diào)控相關(guān)基因在煙草不同時期的表達(dá)模式，有助于系統(tǒng)地研究煙堿的代謝通路，為研究相關(guān)基因功能提供理論依據(jù)。目前，有關(guān)對煙堿合成、調(diào)控的研究大都只局限于根部，而煙葉煙堿是從根部合成通過木質(zhì)部向上傳遞，最終儲存在葉片的液泡中。因此，對根、莖、葉這3個組織部位進(jìn)行整體的研究十分重要。

煙堿只在煙草根系中合成，其他組織器官沒有合成煙堿的能力，而根尖皮層、表皮細(xì)胞及圍繞維管束的薄壁細(xì)胞是煙堿合成的主要部位［2］。從結(jié)構(gòu)上看，煙堿分子由1個吡啶環(huán)和1個吡咯環(huán)組成［3］。從煙堿的合成途徑（圖1）來看，合成吡啶環(huán)的起始物為精氨酸，在精氨酸脫羧酶（ADC）、腐胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶（PMT）、N-甲基腐胺氧化酶（MPO）作用下形成煙堿合成的前體物質(zhì)N-甲基吡咯烷鹽，吡咯環(huán)形成的前體物質(zhì)為天門冬氨酸和三磷酸甘油醛，二者在喹啉酸合酶（QS）、喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（QPT）的作用下形成3，6-二氫煙酸。N-甲基吡咯烷鹽和3，6-二氫煙酸在類異黃酮還原酶（A622）、小檗堿橋接酶（BBL）作用下形成煙堿。在煙堿合成途徑中亞精胺合成酶（SPDS）能夠使鳥氨酸的轉(zhuǎn)化物腐胺轉(zhuǎn)化為亞精胺，經(jīng)過一系列途徑最終形成其他生物堿［4］。煙堿在根組織中產(chǎn)生后，被轉(zhuǎn)移到植物的地上部分，最后聚集在葉片的中央液泡內(nèi)。在這一過程中多藥與毒素外排家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（MATE）、茉莉酸誘導(dǎo)煙堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（JAT）參與煙堿轉(zhuǎn)運(yùn)［5］。首先根細(xì)胞中合成的煙堿一部分沉積在根部細(xì)胞液泡中，另一部分通過質(zhì)膜定位蛋白運(yùn)輸?shù)劫|(zhì)外體，通過木質(zhì)部向地上部運(yùn)輸，在葉細(xì)胞質(zhì)膜處被吸收，最后通過張力體定位蛋白輸送至液泡。高濃度煙堿在根中積累，會對自身產(chǎn)生不利影響，而MATE能夠調(diào)控根部液泡內(nèi)煙堿平衡。煙堿在葉片中的轉(zhuǎn)運(yùn)主要受到JAT的調(diào)控［6］。除煙堿的合成轉(zhuǎn)運(yùn)基因外，還會受到多種激素的調(diào)控，如茉莉酸、生長素、乙烯等。

目前在生產(chǎn)中影響煙葉中煙堿含量的因素主要為遺傳因素和環(huán)境因素。環(huán)境因素主要是光、溫、水、肥以及一些農(nóng)藝措施，如打頂抹杈、施肥等，但煙堿含量主要受遺傳影響［7］。因此本研究通過qRT-PCR技術(shù)測定煙堿合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、調(diào)控基因在煙草K326不同組織中的表達(dá)量，并分析表達(dá)模式，旨在為研究煙堿完整代謝通路提供參考，為研究煙堿代謝相關(guān)基因功能提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料選用普通煙草品種K326，試驗(yàn)材料與設(shè)備均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)育種實(shí)驗(yàn)室提供。2022年3月播種K326，將種子撒播在混合基質(zhì)（營養(yǎng)土與蛭石體積比為1 ∶1）中。培養(yǎng)箱設(shè)置：光照16 h，溫度 28 ℃，相對濕度70%；黑暗8 h，溫度18 ℃，相對濕度70%。待煙苗萌發(fā)后，取7、14、21、30、45、60、75 d 的組織樣品（7、14 d取整株，其他時間取根、莖部、葉片）置于液氮中速凍 15 min，隨后放入-80 ℃冰箱中保存。大田試驗(yàn)樣品于2022年種植于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)，在煙株盛花期取花、蕾、萼片、上部葉、中部葉、下部葉組織樣品，置于液氮中速凍，隨后放入-80 ℃冰箱中保存。

1.2植物總RNA提取

將組織樣品放入液氮中使用滅菌后的研缽充分研磨，根據(jù)北京索萊寶科技有限公司的植物總RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行RNA提取，使用超微量分光光度計（賽默飛世爾科技）測量獲得的RNA樣品的濃度。將所提RNA 放入-80 ℃冰箱保存。使用Vazyme" HiScript Ⅱ Reverse Transcriptase 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，取模板RNA 2 μL，4×g DNA wiper Mix 4 μL，RNase-free ddH2O 4 μL，在42 ℃反應(yīng)2 min；隨后加入5×HiScript Ⅱ qRT SuperMix Ⅱ 4 μL，在 50 ℃ 反應(yīng)15 min，85 ℃反應(yīng)5 s。

1.3基因序列查找以及引物設(shè)計

基因序列通過NCBI獲得，使用DNASTAR找到目的基因序列的CDS序列，并在茄科基因組數(shù)據(jù)庫（https：//solgenomics.net/）中BLAST對應(yīng)的K326的序列。利用Primer 3.0在線軟件（https：//www.primer3plus.com）設(shè)計特異引物（表1）。

1.4熒光定量以及表達(dá)模式分析

熒光實(shí)時定量PCR采用南京諾唯贊生物科技股份有限公司的Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix，采用20 μL體系：2×Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，模板0.4 μL，上下游引物物共 0.8 μL，加入ddH2O 至20 μL。內(nèi)參基因?yàn)?6S（F：5′-GAAGAAGGTCCCAAGGGTTC-3′；R：5′-TCTCCCTTTAACACCAACGG-3′）。使用實(shí)時熒光定量PCR儀（Eppendorf，德國）進(jìn)行定量，每個樣品做3次技術(shù)重復(fù)。熒光實(shí)時定量PCR程序：95 ℃ 預(yù)變性30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；95 ℃ 15 s；60 ℃ 60 s； 95 ℃ 15 s。采用2-ΔΔCT法計算基因相對表達(dá)量。

表達(dá)模式分析使用的柱狀圖由Origin 2019繪制，煙草矢量圖由PowerPoint繪制，熱圖以及卡通熱圖由TBtools繪制。

2結(jié)果與分析

2.1煙堿合成相關(guān)基因的表達(dá)模式分析

參與吡咯環(huán)合成的基因均為組成型表達(dá)，天冬氨酸氧化酶（AO）在煙堿合成通路中的主要作用是將煙堿合成的前體物質(zhì)L-天冬氨酸氧化為α-亞氨基琥珀酸［8］。由圖2-A可知，NtAO在各組織器官中均有表達(dá)，在苗期和盛花期的表達(dá)無明顯差異，在苗期各時期根部表達(dá)量高于葉片，葉片中的表達(dá)量高于莖部。由圖2-B可知，NtQS在苗期的表達(dá)量高于盛花期各部位的表達(dá)量，在盛花期花、蕾、萼片中的表達(dá)量較低，葉片中的表達(dá)量較高；在苗期各組織部位中均有較高的表達(dá)量，但在各器官之間沒有明顯差異。在煙堿合成途徑中，喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（QPT）參與喹啉酸形成煙酸的反應(yīng)過程，是整個吡咯環(huán)形成最重要的步驟［9］。前人的研究表明，QPT不僅是煙堿合成途徑中的關(guān)鍵酶，還對種子萌發(fā)、生長發(fā)育有著顯著的影響［10］。由圖 2-C 可知，NtQPT1在苗期的表達(dá)量高于盛花期，其中盛花期在上部葉和蕾中表達(dá)量最高；而在苗期葉片中的表達(dá)量高于根部，根部表達(dá)量高于莖部。由圖2-D可知，NtQPT2在苗期的表達(dá)量高于盛花期，在盛花期各組織器官中表達(dá)量較低；在苗期根中的表達(dá)量最高，且明顯高于莖和葉片，NtQPT2在莖和葉片中的表達(dá)水平相當(dāng)，并無明顯差異。

參與吡啶環(huán)合成的基因不僅有組成型表達(dá)，也有特異性表達(dá)。精氨酸脫羧酶（ADC）主要負(fù)責(zé)精氨酸轉(zhuǎn)化［11］。由圖2-E可知，NtADC在各組織器官中均有表達(dá)，在苗期葉片中的表達(dá)量高于盛花期葉片，盛花期在萼片中表達(dá)量較高；而在苗期根、葉中有較高的表達(dá)，在莖部表達(dá)量最低。腐胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶（PMT）在煙堿合成途徑中主要參與吡啶環(huán)的合成，是腐氨轉(zhuǎn)化為N-甲基腐胺的關(guān)鍵酶［12］。由圖2-F可知，NtPMTa1在根中高表達(dá)，在其他組織部位表達(dá)極低或不表達(dá)，有研究表明，NtPMTa1在根部特異性表達(dá)，且NtPMTa1的表達(dá)降低，葉片煙堿的含量降低，本研究結(jié)果與前人的研究結(jié)果［13］基本一致。同樣作為參與腐胺合成的基因NtSPDS則能夠在各時期均檢測到，由圖2-G可知，NtSPDS在苗期葉片中的表達(dá)高于盛花期，在盛花期蕾中表達(dá)量最高，且明顯高于其他組織部位；而苗期葉片和莖中的表達(dá)量略微高于根部。由圖 2-H、2-I可知，NtMPO1和NtMPO2兩者表達(dá)模式相似，主要在根中表達(dá)，在莖部和葉片中也能檢測到微量的表達(dá)，不同的是，NtMPO2在蕾和萼片中也有較高的表達(dá)。

吡啶環(huán)和吡咯環(huán)的結(jié)合主要依靠類異黃酮還原酶（A622）和小檗堿橋接酶（BBL）發(fā)揮作用［14-15］。打頂后NtA622在各部位葉片中的表達(dá)量明顯，而在打頂前，表達(dá)量極低或表現(xiàn)為不表達(dá)［16］。由圖2-J可知，NtA622主要在根中表達(dá)，莖部中也能檢測到微量的表達(dá)，在其他組織器官中都不表達(dá)。BBLa參與了煙堿生物合成中吡啶環(huán)縮合反應(yīng)之后的氧化步驟［17］，NtBBLa為組成型表達(dá)，盛花期在各組織器官中的表達(dá)量明顯高于苗期，苗期則主要在葉片中表達(dá)（圖2-K）。

對煙堿合成通路的基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測，煙堿雖然在根部合成，但參與煙堿合成的基因大多為組成型表達(dá)，如NtAO、NtQS、NtQPT1、NtQPT2、NtADC、NtMPO1、NtMPO2、NtSPDS、NtBBLa，其中部分煙堿合成基因主要在根部表達(dá)，如NtQPT2、NtMPO1、NtMPO2，另外一部分則在葉片中表達(dá)量較高，如NtQPT1、NtADC、NtSPDS、NtBBLa。而NtPMTa1和NtA622為根部特異性表達(dá)。

為了比較同一部位中煙堿合成基因之間的差異，將煙堿合成基因在同一器官中的相對表達(dá)量以熱圖的形式呈現(xiàn)出來。如圖3所示，NtQPT2在根莖葉中均有較高程度的表達(dá)，而NtBBLa和NtMPO2在根莖葉中表達(dá)程度普遍較低。除NtQPT2外，參與煙堿吡咯環(huán)合成基因（NtAO、NtQS、NtQPT1、NtQPT2）在根中的表達(dá)量明顯低于參與吡啶環(huán)合成基因（NtPMTa1、NtMPO1、NtMPO2），在莖部和葉片中則相反，吡咯環(huán)合成基因表達(dá)略高于吡啶環(huán)合成基因。

2.2煙堿轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)模式分析

煙堿的轉(zhuǎn)運(yùn)過程主要分為葉片轉(zhuǎn)運(yùn)和根部轉(zhuǎn)運(yùn)，前人的研究表明JAT蛋白主要在葉子中充當(dāng)質(zhì)子反轉(zhuǎn)運(yùn)體，負(fù)責(zé)在液泡中卸載和沉積生物堿，從而在尼古丁易位中起重要作用［18］。煙堿在煙草植物的根組織中生物合成，并通過木質(zhì)部運(yùn)輸?shù)饺~子。一旦到達(dá)葉子，煙堿就會通過張力體定位蛋白JAT2運(yùn)輸?shù)饺~子的液泡腔，并在液泡內(nèi)積累［19］。由圖4-A、圖4-B可知，NtJAT1和NtJAT2均為組成型表達(dá)，但在煙草中的表達(dá)模式并不相同。NtJAT1在苗期的相對表達(dá)量高于盛花期，但表達(dá)模式呈現(xiàn)出主要在葉片中表達(dá)；盛花期在葉片和萼片中相對表達(dá)量較高；在苗期葉片和根中相對表達(dá)量較高。NtJAT2同樣表現(xiàn)為在葉片中高表達(dá)，不同的是，NtJAT2在根中相對表達(dá)量較低，但在蕾中表達(dá)較高。煙堿在根中的轉(zhuǎn)運(yùn)主要依靠MATE蛋白，NtMATE1和NtMATE2在根中特異性表達(dá)并定位于液泡膜上［20］。前人的研究證明，MATE蛋白的功能是控制煙堿在根細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)與液泡之間的跨膜運(yùn)輸［21］。由圖4-C、圖4-D可知，NtMATE1、NtMATE2表達(dá)模式相似，即主要在根中表達(dá)， 但在其他組織器官中也能夠檢測到微量的表達(dá)。

煙堿的轉(zhuǎn)運(yùn)過程還包含其他蛋白的參與，如控制囊泡運(yùn)輸?shù)男〉鞍譔tGEF和質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白NtNUP1。鳥苷酸交換因子（GEF）是控制囊泡運(yùn)輸?shù)男〉鞍祝?2］。由圖4-E可知，NtGEF為組成型表達(dá)，在盛花期與苗期的相對表達(dá)量并無明顯差異。盛花期在蕾中表達(dá)量較高，在苗期葉片中的表達(dá)量相對較高。煙堿攝取滲透酶（NUP）屬于嘌呤攝取滲透酶（PUP）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，位于質(zhì)膜上，參與質(zhì)外體煙堿進(jìn)入煙草根細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的運(yùn)動，這一過程影響煙堿代謝和根系生長［23］。由圖4-F可知，NtNUP1主要在根部表達(dá)，在其他組織器官中也能夠檢測到微量的表達(dá)。

為了比較同一部位中煙堿轉(zhuǎn)運(yùn)基因之間的差異，將煙堿轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因分別在根、莖、葉中的相對表達(dá)量制作成熱圖，如圖5所示，在根中NtNUP1相對表達(dá)量最高，NtJAT2在根中的相對表達(dá)量最低（圖5-A）。NtNUP1和NtGEF在莖中相對表達(dá)量較高，NtMATE1和NtMATE2在莖中相對表達(dá)量最低（圖5-B）。葉片中NtJAT1和NtJAT2相對表達(dá)量較高，NtMATE1和NtMATE2相對表達(dá)量最低（圖5-C）。

2.3煙堿調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)模式分析

MYC2是擬南芥中的一種基本的螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）轉(zhuǎn)錄因子，其同系物通過直接結(jié)合其 G-box來廣泛調(diào)節(jié)茉莉酸響應(yīng)基因的表達(dá)［24］。在煙草中，煙草轉(zhuǎn)錄因子NtMYC2a和NtMYC2b與NtJAZ1形成核復(fù)合物，以調(diào)節(jié)茉莉酸進(jìn)而誘導(dǎo)煙堿生物合成［25］。有研究表明，MeJA處理調(diào)控茉莉酸合成，茉莉酸信號通路的基因在葉中表達(dá)相較于根部更為顯著［26］。由圖6-A、圖6-B可知，NtMYC2a和NtMYC2b在煙株各組織中表達(dá)模式相似，均為組成型表達(dá)。其中NtMYC2a和NtMYC2b主要在葉片中表達(dá)，但不同的是NtMYC2a在苗期葉片中的相對表達(dá)量高于盛花期，而NtMYC2b在盛花期葉片中的相對表達(dá)量略高于苗期。此外，NtMYC2a在盛花期葉片中的相對表達(dá)量隨著葉位下降逐漸降低，而NtMYC2b沒有這樣的趨勢。NtMYC2a在蕾中相對表達(dá)量較高，而NtMYC2b在蕾中相對表達(dá)量較低。

乙烯響應(yīng)因子（ERF）的表達(dá)模式如圖6-C、圖6-D、圖6-E所示。由圖6-C可知，NtERF32在苗期的相對表達(dá)量明顯高于盛花期，苗期主要在莖部和葉片中表達(dá)，在其他組織部位也能夠檢測到NtERF32的表達(dá)，但表達(dá)水平較低。前人的研究表明，NtERF91能夠特異結(jié)合NtPMT和NtQPT上的啟動子元件，過表達(dá)NtERF91能夠增加煙堿合成基因（NtPMT、NtQPT）的表達(dá)，從而增加煙堿的合成［27］。由圖6-D可知，NtERF91也為組成型表達(dá)，在盛花期和苗期的表達(dá)并無差異，但在盛花期和苗期均顯示NtERF91在葉片中相對表達(dá)量較高。NtERF91在莖部和根中表達(dá)水平無明顯差異，但在花、蕾、萼片中相對表達(dá)量較低。NtERF91在盛花期葉片中的相對表達(dá)量隨著葉位下降逐漸降低。有研究表明，NtERF189的表達(dá)實(shí)際上可能是由NtNUP1介導(dǎo)的［28］。由圖6-E可知，NtERF189的表達(dá)模式表現(xiàn)為根部的特異性高表達(dá)，在其他組織器官中表達(dá)極低或幾乎不表達(dá)。

有研究表明，NtARF6介導(dǎo)的生物堿積累可能通過抑制JA生物合成并結(jié)合激活JA與其他信號通路（如ETH、ABA和SA）之間的拮抗相互作用來實(shí)現(xiàn)，NtARF6對煙堿的積累有負(fù)調(diào)控作用［29］。由圖6-F可知，NtARF6為組成型表達(dá)，在苗期根、莖、葉中的相對表達(dá)量無明顯差異， 在盛花期的花和萼片中

有明顯的高表達(dá)，盛花期在上部葉的相對表達(dá)量高于中部葉，在中部葉的相對表達(dá)量高于下部葉。由圖6-G可知，NtLNP1在葉片中的相對表達(dá)量較高，且在盛花期的相對表達(dá)量高于苗期，同時還發(fā)現(xiàn)在上部葉的相對表達(dá)量高于中部葉，在中部葉的相對表達(dá)量高于下部葉。通過對圖6-H分析可以發(fā)現(xiàn)，Nt-miRNA2635在苗期的相對表達(dá)量較高，其中在葉片中的相對表達(dá)量最高。在盛花期各組織中以及煙苗萌發(fā)后7、14 d未檢測到該基因的表達(dá)。

將煙堿調(diào)控相關(guān)基因分別在根、莖、葉中的相對表達(dá)量制作成熱圖，如圖7所示，在根中ERF家族的NtERF91和NtERF189相對表達(dá)量較高， NtLNP1和Nt-miRNA2635相對表達(dá)量較低。在莖部和葉片中，NtMYC2a、NtMYC2b、NtERF32相對表達(dá)量較高，NtERF189、NtLNP1和Nt-miRNA2635相對表達(dá)量較低。

3討論

煙堿合成基因NtPMTa1和NtA622在根部特異性高表達(dá)（圖8），前人已經(jīng)證實(shí)PMT僅能在煙草根部檢測到活性，是參與煙堿生物合成的關(guān)鍵限速酶，煙草根部NtPMT的表達(dá)與煙堿的合成有正相關(guān)關(guān)系，這與前人的研究結(jié)果［13］一致。NtA622也在根部有特異性表達(dá)，因此該基因可能在煙堿合成途徑中也同樣具有關(guān)鍵限速作用。Mizusaki等從煙草根粗提取物中純化30倍的PMT，其腐胺的Km相對較高，表明煙草PMT與其底物腐胺的親和力相對較低［30］。因此可以推斷NtPMTa1雖然在根中特異表達(dá)，但由于活性較低，對合成通路后端NtA622的反應(yīng)有明顯的限速。煙堿合成基因NtADC、NtQPT1、NtQPT2在根部也有較高程度的表達(dá)，說明在合成途徑中吡咯環(huán)的合成中NtQPT發(fā)揮著重要的作用，而在吡啶的合成中NtADC、NtPMTa1有著重要的作用。

煙堿轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtNUP1定位于質(zhì)膜上，相較于其他生物堿能夠特異轉(zhuǎn)運(yùn)煙堿，其在根中轉(zhuǎn)錄水平最高，NtNUP1的下調(diào)能夠降低煙株的總生物堿水平，并且根部生長也受到影響［28］。本研究中NtNUP1在根部特異高表達(dá)與之一致，說明該基因可能主要參與了煙堿在根部的轉(zhuǎn)運(yùn)。煙堿調(diào)控基因NtERF189也在根中有特異高表達(dá)，說明NtERF189可能對煙堿的合成有調(diào)控作用，前人的研究證明，NtERF189敲除后煙株葉面煙堿水平急劇降低，過表達(dá)后煙株葉面煙堿含量顯著增加，但煙株的營養(yǎng)生長受到了抑制［31］。說明兩者在根中對煙堿都有正向調(diào)節(jié)作用，但是在煙草的生長發(fā)育方面可能存在著拮抗作用。

前人的研究證明，轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtGEF主要控制囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)，而煙堿在細(xì)胞器之間的轉(zhuǎn)運(yùn)主要是依靠囊泡，但該基因目前在煙草中研究較少［32］。在本研究中，鳥苷酸交換因子NtGEF在各部位均有表達(dá)，但在葉片中有著較高程度的表達(dá)，且苗期和盛花期在葉片中的表達(dá)無明顯差異，由此可以推測NtGEF可能參與了煙堿的轉(zhuǎn)運(yùn)，這種轉(zhuǎn)運(yùn)方式可能在葉片細(xì)胞中發(fā)生的更加頻繁，且在葉片中的轉(zhuǎn)運(yùn)在不同時期煙株中的差異較小，不容易受到煙株生長的影響。從圖9中NtGEF在不同部位葉片中的表達(dá)來看，NtGEF的表達(dá)可能受到不同葉位影響。

使用茉莉酸甲酯處理煙苗根部，煙堿調(diào)控基因NtERF91在根中高表達(dá)［27］，而本研究中NtERF91在各時期葉片中的表達(dá)量相對較高，可能是由于前者只對根部進(jìn)行處理，葉片受到茉莉酸甲酯的影響較小，所以葉片中NtERF91的表達(dá)差異可能會不明顯。若使用茉莉酸甲酯處理葉片，NtERF91的表達(dá)情況以及對煙堿合成情況的影響有待進(jìn)一步研究。

煙堿調(diào)控基因NtLNP1和Nt-miRNA2635在煙草中研究較少，基因功能也有待進(jìn)一步挖掘，在本研究中NtLNP1主要在葉片中表達(dá)，有研究表明，敲除NtLNP1基因能夠顯著降低葉片中煙堿含量，因此可能對煙堿在葉片中的積累產(chǎn)生正向的影響［33］。從圖9中NtLNP1在葉片中的表達(dá)可以推測，該基因可能主要在營養(yǎng)生長后期葉片中發(fā)揮作用。相關(guān)研究證明，過表達(dá)Nt-miRNA2635能夠抑制煙堿代謝通路的靶基因，從而使葉片煙堿含量降低［34］。本研究中Nt-miRNA2635僅在苗期葉片中表達(dá)，因此該基因可能只在煙草生長前期發(fā)揮作用。

4結(jié)論

煙草葉片煙堿含量主要受到遺傳因素影響。本研究使用烤煙品種K326不同時期組織器官為材料，對煙堿相關(guān)的25個合成、 轉(zhuǎn)運(yùn)和調(diào)控基因的相對表達(dá)量進(jìn)行測定，結(jié)果表明在測定的25個基因中有21個基因?yàn)榻M成型表達(dá)，分別為NtAO、NtQS、NtADC、NtMPO1、NtMPO2、NtSPDS、NtQPT1、NtQPT2、NtBBLa、NtJAT1、NtJAT2、NtMATE1、NtMATE2、NtGEF、NtARF6、NtERF91、NtERF32、NtMYC2a、NtMYC2b、NtLNP1、Nt-miRNA2635，有4個基因在根部特異高表達(dá)，分別為NtPMTa1、NtA622、NtNUP1、NtERF189。煙堿合成基因NtPMT和NtA622在根部特異表達(dá)，說明兩者在煙堿的合成過程中發(fā)揮著非常關(guān)鍵的作用；煙堿轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtNUP1在根中特異表達(dá)，說明該基因可能主要參與煙堿在根中轉(zhuǎn)運(yùn)的過程，而煙堿在莖、葉中的轉(zhuǎn)運(yùn)過程受其他基因影響；煙堿調(diào)控基因NtERF189在根中特異表達(dá)，說明該基因可能對煙堿的合成進(jìn)行調(diào)控。研究結(jié)果可為系統(tǒng)研究煙堿代謝通路提供參考，為研究煙堿代謝相關(guān)基因功能提供理論依據(jù)。

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