摘要 隨著結(jié)直腸癌發(fā)病率的持續(xù)攀升，患者群體呈年輕化趨勢(shì)。現(xiàn)有治療方案雖然能延長(zhǎng)生存期，卻不可避免地帶來(lái)嚴(yán)重的副作用，因此，開(kāi)發(fā)新型治療策略勢(shì)在必行。木犀草素（Luteolin， LUT）作為天然草藥活性成分，其廣譜抗腫瘤效應(yīng)在多種癌癥研究中得到了證實(shí)，然而其對(duì)結(jié)直腸癌的作用機(jī)制尚未明確。本研究從蛋白質(zhì)組-糖蛋白質(zhì)組協(xié)同調(diào)控角度揭示了LUT 對(duì)結(jié)直腸癌SW620 細(xì)胞的分子作用機(jī)制。采用蛋白質(zhì)組學(xué)分析鑒定出472 個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。功能富集分析顯示，下調(diào)蛋白質(zhì)主要參與氧化應(yīng)激反應(yīng)、mRNA處理、RNA 剪接以及肌動(dòng)蛋白纖維組織等關(guān)鍵生物過(guò)程，并涉及氧化磷酸化和過(guò)氧化物酶體通路；而上調(diào)蛋白質(zhì)則主要參與DNA 復(fù)制、蛋白質(zhì)折疊及rRNA 代謝等過(guò)程，與DNA 復(fù)制和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工通路密切相關(guān)。在糖蛋白質(zhì)組學(xué)層面，本研究發(fā)現(xiàn)了231 條差異表達(dá)的完整N-糖肽。對(duì)應(yīng)糖蛋白的功能富集分析表明， LUT 可能通過(guò)調(diào)節(jié)核組織、核膜組織和Fc 受體介導(dǎo)的刺激信號(hào)通路等生物過(guò)程，以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工和N-糖基化生物合成通路發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。關(guān)鍵互作網(wǎng)絡(luò)分析鑒定出5 個(gè)核心靶蛋白，分別為RPS15A、WDR43、FBL、UTP18 和UTP11，這些蛋白缺失已被證實(shí)可抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖和遷移。值得注意的是，溶酶體相關(guān)膜蛋白LAMP1 和LAMP2 的糖基化修飾改變提示LUT 可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞器動(dòng)態(tài)影響腫瘤轉(zhuǎn)移潛能。本研究結(jié)果揭示了LUT 可通過(guò)特異性調(diào)控蛋白表達(dá)網(wǎng)絡(luò)與糖基化修飾模式雙重機(jī)制抑制結(jié)腸癌細(xì)胞惡性表型，為基于天然產(chǎn)物的結(jié)直腸癌精準(zhǔn)治療提供了新型分子靶標(biāo)和理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 結(jié)直腸癌；木犀草素；蛋白質(zhì)組學(xué)；糖蛋白質(zhì)組學(xué)

根據(jù)2024 年美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)報(bào)告，結(jié)直腸癌在男女新發(fā)癌癥中均居第三位，占新發(fā)癌癥病例的7.64%。結(jié)直腸癌死亡病例數(shù)在男性癌癥死亡病例中排名第三，在女性中排名第四，占所有癌癥相關(guān)死亡人數(shù)的8.67%[1]。值得注意的是， 55 歲以下人群中的發(fā)病率和死亡率正以每年1%～2%的速度上升[1-2]。在中國(guó)，結(jié)直腸癌的平均存活率為56.9%，其中早期患者的五年相對(duì)存活率高達(dá)90%，而晚期轉(zhuǎn)移患者僅為14%[2-3]。目前，腸鏡檢查雖為金標(biāo)準(zhǔn)，但其侵入性強(qiáng)，不適于早期篩查[4]，且缺乏可靠的生物標(biāo)志物，導(dǎo)致多數(shù)患者確診時(shí)已出現(xiàn)嚴(yán)重癥狀。盡管手術(shù)聯(lián)合放化療及靶向藥物（如貝伐珠單抗和帕尼圖單抗等）的應(yīng)用改善了患者預(yù)后[5-9]，但藥物不良反應(yīng)等問(wèn)題仍亟待解決。

植物源化合物因其獨(dú)特的生物活性在癌癥治療中展現(xiàn)出巨大的潛力[10-13]，尤其在增強(qiáng)化療敏感性方面表現(xiàn)良好[14]。木犀草素（Luteolin， LUT）作為一種廣泛存在的黃酮類(lèi)物質(zhì)[15]，已被證實(shí)可通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和血管生成發(fā)揮抗癌作用[16-17]。Gao 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LUT 處理48 h 后，口腔癌細(xì)胞（Oral carcinoma 3， OC3）增殖受到顯著抑制；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示， LUT 處理組S 期細(xì)胞比例降至10%（對(duì)照組25%， DMSO 組20%），同時(shí)細(xì)胞遷移能力降低50%（細(xì)胞遷移數(shù)40% vs 80%），證實(shí)其通過(guò)阻滯細(xì)胞周期和抑制遷移發(fā)揮抗癌作用。Huang 等[19]研究發(fā)現(xiàn)， LUT 以劑量依賴(lài)的方式有效抑制了乳腺癌細(xì)胞系（MDA-MB-231）的增殖和S 期細(xì)胞周期的劑量依賴(lài)性停滯。上述研究表明， LUT 對(duì)口腔癌和乳腺癌表現(xiàn)出抗癌特性，但對(duì)結(jié)直腸癌的治療效果的相關(guān)研究較少。

本研究采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)和糖蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，系統(tǒng)分析了LUT 處理對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620 的分子調(diào)控機(jī)制。結(jié)果表明， LUT 處理誘導(dǎo)了顯著的蛋白質(zhì)組重塑和N-糖基化修飾改變?；诨虮倔w論（Gene ontology， GO）和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）功能富集分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)蛋白質(zhì)和N-糖肽主要富集于細(xì)胞周期調(diào)控等關(guān)鍵通路。本研究為解析LUT抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的分子機(jī)制提供了新的理論依據(jù)，同時(shí)揭示了其在癌癥治療中的應(yīng)用潛力。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CKX53 細(xì)胞培養(yǎng)倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；DHP-9052 電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；Concentrator plus 濃縮儀和ThermoMixer C 金屬?。ǖ聡?guó)Eppendorf 公司）；JY92-IIN 超聲波細(xì)胞破碎儀（寧波新芝生物科技公司）；HVE50 高壓滅菌鍋（日本Hirayama 公司）；Snail Girl LC-4006G 低速離心機(jī)（美國(guó)labyeah 公司）；HERACELL 150i 二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱、Multiskan SkyHigh 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀、NanoDrop OneC 微量紫外分光光度計(jì)、Orbitrap Fusion Lumos 三合一高分辨質(zhì)譜儀和Easy nLC1200 納升級(jí)液相色譜儀（美國(guó)賽默飛科技公司）。

結(jié)直腸癌SW620 細(xì)胞系（北京北納生物公司）；DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（美國(guó)Gibco 公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS）和0.25%胰蛋白酶溶液（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；臺(tái)盼藍(lán)溶液（普諾賽公司）；Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒（武漢百瑞極公司）；T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)96 孔板和100 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿（無(wú)錫NEST 公司）；30 kDa 超濾管（美國(guó)Pall Corporation 公司）；尿素（≥99%）、二硫蘇糖醇（≥98%）、碘乙酰胺（≥99%）和碳酸氫銨（≥99%）（美國(guó)Sigma Aldrich公司）；測(cè)序級(jí)胰蛋白酶（質(zhì)譜純，北京酶知源生物科技有限公司）；HILIC 填料（天津博納艾杰爾公司）；三氟乙酸（≥99%）、甲酸（gt;99%）、乙腈（質(zhì)譜純）和氨水（≥99%）（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；SDB-RPS 固相萃取盤(pán)片（色譜純，美國(guó)3M 公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將液氮中凍存的SW620 細(xì)胞于37 ℃水浴中迅速解凍，離心（1000 r/min， 5 min）后棄上清。采用DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并接種于培養(yǎng)皿，于37 ℃、5% CO2 培養(yǎng)箱中孵育2 h 后更換新鮮培養(yǎng)基。每日觀察細(xì)胞形態(tài)，待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代。傳代操作：移除舊培養(yǎng)基后，經(jīng)預(yù)冷PBS 清洗兩次（2 mL/次）；加入0.25%胰酶（1 mL）消化3 min，以含血清培養(yǎng)基終止消化反應(yīng)；離心收集細(xì)胞沉淀（1000 r/min， 5 min），用DMEM 培養(yǎng)基重懸后按1∶2 比例接種傳代，在37 ℃、5% CO2 條件下培養(yǎng)。

1.3 CCK8 試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞增殖情況

將LUT 采用二甲基亞砜（DMSO）配制成100 mmol/L 的原液，使用DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基將其稀釋至100 μmol/L，于–20 ℃儲(chǔ)存，備用。使用時(shí)，用DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基將LUT 稀釋至相應(yīng)的濃度。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組?？瞻捉M僅加入DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基，未接種任何細(xì)胞。對(duì)照組：將生長(zhǎng)狀態(tài)良好且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW620 細(xì)胞接種于96 孔板，每孔接種1×104 個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)基為DMEM，按照實(shí)驗(yàn)組的時(shí)間同步更換新的DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)組：將生長(zhǎng)狀態(tài)良好且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW620 細(xì)胞接種于96 孔板，每孔接種1×104 個(gè)細(xì)胞，采用DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)至SW620 細(xì)胞貼壁后，更換培養(yǎng)基為含有不同濃度LUT（0、6.25、12.5、25、50、75 和100 μmol/L）的DMEM 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后每孔加入10 μL CCK-8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h。使用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)量各孔在490 nm 處的光密度（OD）。計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（IC）：IC（%）=（OD490 nm對(duì)照細(xì)胞–OD490 nm 處理細(xì)胞）/OD490 nm對(duì)照細(xì)胞×100。半數(shù)最大抑制濃度（IC50）為與對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng)相比LUT 產(chǎn)生50%抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的濃度。各實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。

1.4 LUT 處理SW620 細(xì)胞

對(duì)照組（Control）的SW620 細(xì)胞在DMEM 養(yǎng)基中培養(yǎng)， LUT 組的SW620 細(xì)胞用含有28.20 μmol/LLUT 的DMEM 基培養(yǎng)。Control 組和LUT 組均接種相同密度的SW620 細(xì)胞，加入無(wú)藥物的DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，在5% CO2 的條件下培養(yǎng)過(guò)夜。然后，將LUT 組的培養(yǎng)基更換為含有28.20 μmol/L LUT 的DMEM 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。Control 組更換新的DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。為了確保DMSO 不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，始終保持培養(yǎng)基中DMSO 的濃度在0.1% （V/V）以下。

1.5 蛋白提取及濃度測(cè)定

收集細(xì)胞置于無(wú)菌EP 管中，加入540 μL 蛋白裂解液（8 mol/L 尿素），置于超聲細(xì)胞破碎儀中超聲5 min。超聲細(xì)胞破碎儀的程序設(shè)置為：工作2 s，停2 s，功率為25%。超聲完成后，采用超高速離心機(jī)，在4 ℃下以14000 r/min（16000 g）離心15 min，收集上清，即為細(xì)胞全蛋白。利用Bradford 法[20]測(cè)定細(xì)胞全蛋白濃度。

1.6 蛋白的酶切、分餾和完整糖肽的富集

采用過(guò)濾器輔助樣品制備方案（Filter-aided sample preparation， FASP）[21]酶切樣品蛋白。（1）稱(chēng)取500 μg 蛋白加入30 kDa 超濾管中，離心，棄去濾液；（2）加入裂解緩沖液（8 mol/L 尿素， 100 mmol/L Tris-HCl， pH 8.5）離心洗滌；（3）加入10 mmol/L 二硫蘇糖醇（DTT），于37 ℃孵育4 h；（4）離心，棄去上清液，加入50 mmol/L 碘乙酰胺（IAM），室溫下于暗處避光孵育0.5 h；（5）離心，棄去上清液，加入10 mmol/LDTT 室溫避光放置15 min， 離心，棄去上清液；（6）分別加入尿素溶液和50 mmol/L 碳酸氫銨（ABC）洗滌3 次，更換新套管，加入50 mmol/L ABC 溶解的20 μg 胰蛋白酶， 37 ℃孵育16 h；（7）反應(yīng)結(jié)束后離心，收集肽段，依次加入ddH2O 和50 mmol/L ABC 洗滌超濾管，離心收集洗脫液；（8）用SpeedVac 真空干燥離心機(jī)（Eppendorf）干燥肽段；（9）肽段使用0.1%甲酸（FA）/ddH2O 溶解，采用NanoDrop 測(cè)定其濃度，取50 μg肽段使用SpeedVac真空干燥離心機(jī)干燥，于–80 ℃凍存。

采用SDB-RPS 進(jìn)行分餾。首先，取5 層SDB-RPS 膜加入Tip 柱中；然后，將50 μg 上述凍存的肽段用0.2% TFA 溶解，并加至SDB-RPS-Tip 柱中；接著加入0.2% TFA 洗滌一次；依次用100 mmol/L 甲酸銨/40%ACN/0.5%FA、150 mmol/L 甲酸銨/60%ACN/0.5%FA 和80%ACN/5%NH3H2O 洗脫。洗脫的肽段溶液在真空離心濃縮儀中45 ℃、V-HV 模式下熱干回收，隨后在–80 ℃儲(chǔ)存，用于后續(xù)LC-MS/MS 分析。HILIC 富集完整糖肽的實(shí)驗(yàn)方案如下：利用0.1% TFA 溶液活化HILIC 填料（5 μm， 100 ?），重復(fù)3 次；然后，使用80% ACN/0.2% TFA 溶液平衡填料，重復(fù)3 次；將熱干的肽段用80% ACN/0.2% TFA 溶液復(fù)溶，加入已平衡好的HILIC 填料，置于室溫旋轉(zhuǎn)混合儀上孵育2 h；將混合物轉(zhuǎn)移到填充有一層C8 膜的Tip 柱中，并利用80% ACN/0.2% TFA 溶液洗滌除去未結(jié)合肽段；更換新離心管，加入0.1% TFA 溶液洗脫收集糖肽，重復(fù)洗脫操作3 次并合并收集液。使用SpeedVac 真空干燥離心機(jī)熱干糖肽，在–80 ℃儲(chǔ)存，待LC-MS/MS 分析。

1.7 液相色譜及質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置

使用由EASY-nLC 1200 液相色譜系統(tǒng)和Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 質(zhì)譜儀組成的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）系統(tǒng)進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析。液相色譜流動(dòng)相A 為0.1% FA， B 為80% ACN/0.1% FA。分析柱為實(shí)驗(yàn)室自制C18 柱（30 cm（L）×100 μm（o.d.）×360 μm（i.d.）），填料粒徑為1.9 μm（ReproSil-Pur C18-AQ; Dr. Maisch）。

1.7.1 蛋白質(zhì)組分析

將肽段溶于0.1% FA/ddH2O 中，用NanoDrop 測(cè)定其濃度。取1 μg 肽段經(jīng)過(guò)液相加載到分析柱中，采用梯度洗脫：0～5 min， 4%～10% B；5～48 min， 10%～22% B；48～66 min， 22%～35% B；66～76 min，35%～90% B；76%～78 min， 90% B。流速為600 nL/min。

質(zhì)譜參數(shù)如下：Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 質(zhì)譜儀采用OT（Obitrap）-OT 模式；一級(jí)質(zhì)譜掃描的自動(dòng)增益控制（Automatic Gain Control， AGC）目標(biāo)值為400000；掃描范圍為m/z 350～1550；分辨率為120000；離子最大注入時(shí)間（Maximum injection time， MaxIT）為50 ms。二級(jí)質(zhì)譜掃描AGC 目標(biāo)值為50000；分辨率為15000， MaxIT 為30 ms，使用高能碰撞解離（HCD）對(duì)2～7 電荷的母離子進(jìn)行碎裂，碰撞能量為30%；動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為18 s，質(zhì)量數(shù)據(jù)由XCalibur 進(jìn)行實(shí)時(shí)采集。

1.7.2 糖蛋白質(zhì)組分析

將肽段溶于0.1% FA/ddH2O 中，使用NanoDrop 測(cè)定其濃度。然后，取1 μg 肽段經(jīng)過(guò)液相加載到分析柱中，采用梯度洗脫：0～8 min， 5%～8% B；8～68 min， 8%～22% B；68～82 min， 22%～32% B；82～88 min，32%～90% B；88～90 min， 90% B。流速為600 nL/min。

質(zhì)譜參數(shù)如下：Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 質(zhì)譜儀采用OT（Orbitrap）-OT 模式；一級(jí)質(zhì)譜掃描的AGC 目標(biāo)值為400000；掃描范圍m/z 800～2000；分辨率為120000；MaxIT 為100 ms。二級(jí)質(zhì)譜掃描AGC 目標(biāo)值為50000；分辨率為15000， MaxIT 為250 ms，使用HCD 對(duì)2～6 電荷的母離子進(jìn)行碎裂，階梯碰撞能量為20%、30%和40%；動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為15 s，質(zhì)量數(shù)據(jù)由XCalibur 進(jìn)行實(shí)時(shí)采集。

1.8 數(shù)據(jù)處理

使用MaxQuant（2.0.3.0）軟件[22]解析蛋白質(zhì)組的原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)。用于檢索的數(shù)據(jù)庫(kù)為2023年6月1日從Uniprot[23]下載的Swiss-Prot蛋白庫(kù)，包含20422種蛋白質(zhì)。設(shè)定參數(shù)如下：蛋白水解酶為T(mén)rypsin/P，最大漏切位點(diǎn)為2；母離子質(zhì)量偏差為20 ppm（10–6），子離子質(zhì)量偏差為4.5 ppm；固定修飾設(shè)定半胱氨酸碘乙酰胺化（Carbamidomethy/+57.021 Da），可變修飾選擇甲硫氨酸氧化（Oxidation/+15.995 Da）和N-乙?；ˋcetyl/+42.011 Da）；蛋白和多肽定性假陽(yáng)性率（FDR）為1%，定量方法選擇非標(biāo)定量（Lable free），其它參數(shù)為默認(rèn)參數(shù)。使用pGlyco3[24]解析糖蛋白質(zhì)組質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)，用于檢索的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)與上述蛋白質(zhì)組質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢索使用的一致。設(shè)定參數(shù)如下：固定修飾設(shè)定為半胱氨酸碘乙酰胺化（Carbamidomethy/+57.021 Da），可變修飾選擇甲硫氨酸氧化（Oxidation/+15.995 Da）和N-乙?；ˋcetyl/+42.011 Da）。母離子質(zhì)量偏差（Mass tolerance）為±4 ppm，子離子質(zhì)量偏差（Peptide tolerance）為±20 ppm，允許兩個(gè)漏切位點(diǎn)。完整糖肽鑒定的質(zhì)量控制方法設(shè)置為FDR 小于1%，其它參數(shù)設(shè)置選擇默認(rèn)值。

蛋白質(zhì)組和糖蛋白質(zhì)組的數(shù)據(jù)使用Perseus 軟件[25]完成數(shù)據(jù)篩選和缺失值填充等差異分析前處理工作。數(shù)據(jù)篩選的條件為至少在一個(gè)實(shí)驗(yàn)組中被鑒定頻率≥3 的蛋白質(zhì)組。缺失值填充的方法：采用Perseus 軟件內(nèi)置的正態(tài)分布法進(jìn)行填補(bǔ)，設(shè)置Width 為0.3， Down shift 為1.8，每列分別處理（Mode 為Separately for each column）。蛋白質(zhì)組和糖蛋白質(zhì)組的差異分析均使用Limma[26]R 包完成，選擇p（BH）lt;0.05 和| log2（Fold Change）|≥1.2 為顯著差異表達(dá)蛋白或糖肽。差異基因或差異糖肽對(duì)應(yīng)的基因的GO和KEGG 富集分析使用clusterProfiler 4.0 軟件[27]完成，選擇p（BH）lt;0.05 為顯著富集條目。GO 富集結(jié)果包括細(xì)胞組分（Cellular component， CC）、分子功能（Molecular function， MF）和生物過(guò)程（Biological process，BP）。差異基因或差異糖肽對(duì)應(yīng)的基因使用String 軟件[28]進(jìn)行蛋白互作分析（PPI）， Network type 設(shè)置為full STRING network， meaning of network edges 設(shè)置為confidence， minimum required interaction score設(shè)置為0.900（蛋白質(zhì)組）/0.400（糖蛋白質(zhì)組），其它參數(shù)為默認(rèn)值。PPI 網(wǎng)絡(luò)使用Cytoscape 軟件[29]優(yōu)化。關(guān)鍵基因使用cytoHubba 插件[30]篩選。

2 結(jié)果與討論

2.1 LUT 抑制SW620 細(xì)胞的增殖

設(shè)置空白組、對(duì)照組（Control）和處理組（LUT），系統(tǒng)評(píng)估LUT（圖1A）對(duì)結(jié)直腸癌SW620 細(xì)胞系的抗增殖效應(yīng)。結(jié)果表明，其對(duì)結(jié)直腸癌SW620 細(xì)胞系的抗增殖效應(yīng)呈顯著的劑量依賴(lài)性，由LUT 濃度與細(xì)胞存活率之間的劑量-效應(yīng)曲線（圖1B），計(jì)算出LUT 的半抑制濃度（IC50）為28.20 μmol/L。由圖1C的顯微鏡觀察結(jié)果可知，相較于Control 組， LUT 組（28.20 μmol/L）呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性細(xì)胞數(shù)量減少。對(duì)細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)Control 組的細(xì)胞數(shù)量明顯多于LUT 組，并且兩組之間的細(xì)胞數(shù)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1D）。

2.2 Control 組和LUT 組SW620 細(xì)胞的蛋白質(zhì)組及糖蛋白質(zhì)組測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)

收集Control 與LUT 處理48 h 的SW620 細(xì)胞，每組6 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。FASP 酶解獲得的肽段分成兩份，一份使用SDB-RPS-Tip 分離（50 μg）用于蛋白質(zhì)組分析，另一份使用HILIC 富集（100 μg）用于完整N-糖肽分析。

在蛋白質(zhì)組分析中，從Control 組中平均鑒定出4825 個(gè)蛋白質(zhì)（4720～4894），顯著高于LUT 組的4613 個(gè)（4519～4695）（圖2A 和2C）。兩組共同鑒定的蛋白質(zhì)有5201 個(gè)，占總數(shù)的90.99%；Control 組特有的蛋白質(zhì)為362 個(gè)，占6.33%；而LUT 組特有的蛋白質(zhì)為153 個(gè)，占2.68%（圖2C）。在肽段層面，兩組樣本鑒定出的肽段數(shù)量基本一致（圖2B）。在糖蛋白質(zhì)組分析中共鑒定出4647 條完整N-糖肽， Control組平均鑒定出1694 條（1550～1829）， LUT 組為1632 條（1349～1852）（圖2D 和2E）。兩組共有的糖肽僅占41.87%（2729 條），而Control 與LUT 組特有糖肽分別為1918 條（29.43%）和1871 條（28.71%），表明LUT處理顯著改變了SW620 細(xì)胞的糖基化修飾譜。通過(guò)糖蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組分析結(jié)果的交叉比對(duì)發(fā)現(xiàn)，有32.70%的糖蛋白在蛋白質(zhì)組測(cè)序中未被檢測(cè)到（圖2F），凸顯了糖蛋白質(zhì)組學(xué)在全面解析蛋白質(zhì)修飾中的獨(dú)特價(jià)值，同時(shí)也說(shuō)明糖蛋白質(zhì)組測(cè)序?yàn)榈鞍踪|(zhì)組學(xué)分析提供了重要的補(bǔ)充信息。

2.3 Control 組和LUT 組差異蛋白質(zhì)組分析

差異蛋白質(zhì)組分析發(fā)現(xiàn)顯著差異表達(dá)上調(diào)蛋白212 個(gè)，下調(diào)蛋白260 個(gè)（圖3A）。主成分分析（Principal component analysis， PCA）顯示， Control 組和LUT 組獲得SW620 細(xì)胞的蛋白質(zhì)組有顯著分離，表明LUT 處理顯著改變了SW620 細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)譜（圖3B）。聚類(lèi)分析進(jìn)一步證實(shí)了兩組樣本的顯著區(qū)分性（圖3C）。

使用clusterProfile 軟件包對(duì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行了GO 和KEGG 富集分析。如圖3D 所示，表達(dá)下調(diào)的蛋白質(zhì)主要參與了mRNA 處理（mRNA processing）、DNA 代謝過(guò)程的調(diào)控（Regulation of DNA metabolicprocess）、RNA 剪接（RNA splicing）和對(duì)氧化應(yīng)激的響應(yīng)（Response to oxidative stress）等生物過(guò)程；分子功能包括DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（DNA-binding transcription factor binding）、轉(zhuǎn)錄共調(diào)控子活性（Transcriptioncoregulator activity）、肌動(dòng)蛋白結(jié)合（Actin binding）和鈣黏蛋白結(jié)合（Cadherin binding）等；主要定位于細(xì)胞-細(xì)胞連接（Cell-cell junction）、線粒體基質(zhì)（Mitochondrial matrix）、肌動(dòng)蛋白骨架（Actincytoskeleton）和細(xì)胞-基質(zhì)連接（Cell-substrate junction）等。如圖3E 所示，表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)主要參與ncRNA 處理（ncRNA processing）、DNA 復(fù)制（DNA replication）、核糖核蛋白復(fù)合體生物生成（Ribonucleoproteincomplex biogenesis）、蛋白質(zhì)折疊（Protein folding）和rRNA 代謝過(guò)程（rRNA metabolic process）等；分子功能涉及作用于RNA 的催化活性（Catalytic activity， acting on RNA）、鈣黏蛋白結(jié)合（Cadherin binding）、ATP 水解活性（ATP hydrolysis activity）和解旋酶活性（Helicase activity）等；定位于核膜（Nuclearenvelope）、線粒體基質(zhì)（Mitochondrial matrix）、染色體區(qū)域（Chromosomal region）、核糖體（Ribosome）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白復(fù)合體（Endoplasmic reticulum protein-containing complex）等。GO 富集分析結(jié)果揭示了許多差異表達(dá)蛋白質(zhì)與細(xì)胞周期緊密相關(guān)。KEGG 分析（圖3F）表明，上調(diào)蛋白質(zhì)主要的信號(hào)通路包括DNA 復(fù)制（DNA replication）、核苷酸切除修復(fù)（Nucleotide excision repair）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工（Protein processing in endoplasmic reticulum）和錯(cuò)配修復(fù)（Mismatch repair）等；下調(diào)蛋白質(zhì)參與的信號(hào)通路包括氧化磷酸化（Oxidative phosphorylation）、檸檬酸循環(huán)（Citrate cycle）和過(guò)氧化物酶體（Peroxisome）等。以上結(jié)果表明，差異蛋白顯著富集于細(xì)胞周期相關(guān)通路，提示LUT 可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程影響SW620 細(xì)胞增殖。

2.4 Control 組和LUT 組SW620 細(xì)胞差異糖蛋白質(zhì)組分析

糖蛋白質(zhì)組差異分析結(jié)果表明， LUT 處理后的SW620 細(xì)胞中，有130 條完整N-糖肽表達(dá)顯著上調(diào)，101 條完整N-糖肽表達(dá)顯著下調(diào)（圖4A）。PCA 分析顯示， Control 組與LUT 組在N-糖基化修飾上具有顯著差異（圖4B），且LUT 處理顯著改變了N-糖基化修飾水平（圖4C）。

對(duì)差異完整N-糖肽對(duì)應(yīng)的糖蛋白進(jìn)行功能注釋。GO 分析結(jié)果顯示，這些蛋白質(zhì)主要參與了細(xì)胞核組織（Nucleus organization）、核膜組織（Nuclear envelope organization）、脯氨酸修飾（Peptidyl-prolinemodification）、蛋白質(zhì)羥基化（Protein hydroxylation）和Fc 受體介導(dǎo)的刺激信號(hào)通路調(diào)節(jié)（Regulation of Fcreceptor mediated stimulatory signaling pathway）等生物過(guò)程；具有硫酸酯水解酶活性（Sulfuric ester hydrolaseactivity）和外肽酶活性（Exopeptidase activity）；主要定位于細(xì)胞器膜的固有成分（Intrinsic componentof organelle membrane）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔（Endoplasmic reticulum lumen）、含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的復(fù)合體（Endoplasmicreticulum protein-containing complex）和原始溶酶體（Primary lysosome）等（圖4D）。KEGG 通路分析結(jié)果表明，這些蛋白質(zhì)主要參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工（Protein processing in endoplasmic reticulum）、溶酶體（Lysosome）、不同類(lèi)型的N-糖基化生物合成（Various types of N-glycan biosynthesis）和糖胺聚糖降解（Glycosaminoglycan degradation）等代謝途徑（圖4E）。這些發(fā)現(xiàn)為理解LUT 對(duì)SW620 細(xì)胞糖基化修飾的調(diào)控機(jī)制提供了重要的依據(jù)。

2.5 影響SW620 細(xì)胞增殖的核心基因的篩選

基于蛋白質(zhì)組和糖蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，篩選了與LUT 抑制SW620 細(xì)胞增殖相關(guān)的核心基因。通過(guò)String數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行PPI 分析，并結(jié)合Cytoscape 軟件的CytoHubba 插件，篩選出Top 10 核心基因：RPS16、RPS23、RPS12、RPS15A、WDR43、WDR3、FBL、UTP18、UTP11 和RRP9（圖5A）。這些基因在經(jīng)過(guò)LUT 處理后的SW620 細(xì)胞系中差異表達(dá)，其中5 個(gè)表達(dá)上調(diào)， 5 個(gè)表達(dá)下調(diào)（見(jiàn)電子版文后支持信息圖S1A）。PCA 分析顯示，通過(guò)Top 10 核心基因可將Control 組和LUT 組區(qū)分開(kāi)， PC1 為99.99%， PC2 為0.01%（圖5B）?；诓町惐磉_(dá)完整N-糖肽對(duì)應(yīng)的糖蛋白，篩選出的Top 10 核心基因?yàn)長(zhǎng)AMP1、LAMP2、GNS、M6PR、IGF2R、CD63、CD82、TFRC、SCARB2 和PSAP（圖5C）。PCA 分析結(jié)果證實(shí)了Control 組和LUT 組在糖基化修飾上的顯著差異， PC1 為99.33%， PC2 為0.31%（圖5D）。Top 10 核心基因?qū)?yīng)的差異糖肽在Control 組和LUT 組中有顯著的表達(dá)差異（電子版文后支持信息圖S1B）。

功能分析結(jié)果表明， RPS15A 為核糖體蛋白s15a，參與mRNA/核糖體相互作用，對(duì)其抑制可減少肝細(xì)胞癌增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯[31-32]。FBL 是一種高度保守的核仁甲基轉(zhuǎn)移酶，負(fù)責(zé)核糖體RNA 和蛋白質(zhì)的甲基化，在各種癌癥中高表達(dá)，敲除后可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[33]。WDR43 作為染色質(zhì)相關(guān)RNA 結(jié)合蛋白，在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，敲低后可抑制癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[34]。UTP11 和UTP18 分別參與18S 核糖體RNA 合成和前核糖體RNA 加工，其過(guò)表達(dá)可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，而敲除則抑制腫瘤發(fā)生[35-36]。這些基因在LUT 處理后表達(dá)下調(diào)，提示其可能是LUT 抑制SW620 細(xì)胞增殖的關(guān)鍵靶點(diǎn)。此外， LAMP1 和LAMP2 作為溶酶體相關(guān)膜糖蛋白，在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和粘附中發(fā)揮重要作用[37-39]。盡管其蛋白表達(dá)量無(wú)顯著變化，但糖基化修飾的改變可能影響其功能[40-42]。上述結(jié)果為闡明LUT 抑制SW620 細(xì)胞增殖的分子機(jī)制提供了重要線索。

3 結(jié)論

本研究利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)與糖蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，深入研究了LUT 對(duì)結(jié)直腸癌SW620 細(xì)胞的調(diào)控作用。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析，共鑒定出472 個(gè)差異表達(dá)蛋白。進(jìn)一步的PPI 網(wǎng)絡(luò)分析篩選出10 個(gè)核心基因，其中FBL、RPS15A、WDR43、UTP11 和UTP18 與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可能是LUT 作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。糖蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)有130 條完整N-糖肽差異表達(dá)上調(diào)， 101 條完整N-糖肽差異表達(dá)下調(diào)?；谶@些差異表達(dá)的完整N-糖肽對(duì)應(yīng)的糖蛋白，通過(guò)PPI 網(wǎng)絡(luò)分析，篩選出10 個(gè)核心基因，其中，LAMP1 和LAMP2 與腫瘤細(xì)胞的粘附和遷移密切相關(guān)，可能是LUT 作用的潛在靶點(diǎn)。

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支持信息

木犀草素抑制結(jié)直腸癌SW620 細(xì)胞生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)組學(xué)機(jī)制研究

趙佳威 孟波 陸澳 韓梓星 葉子弘 趙洋

科技基礎(chǔ)資源調(diào)查專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目（No. 2022FY101202）和國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（No. 2022YFF0608400）資助。