林琳等

摘 要 蛋白質(zhì)翻譯后修飾是調(diào)控各種細(xì)胞信號(hào)通路和細(xì)胞命運(yùn)最為關(guān)鍵的分子機(jī)制之一。在分子水平上，蛋白質(zhì)翻譯后修飾的“寫(xiě)入”、“擦除”和“識(shí)別”是實(shí)現(xiàn)其動(dòng)態(tài)調(diào)控功能的核心過(guò)程，均屬于生物分析化學(xué)的研究范疇?；谝合嗌V與生物質(zhì)譜聯(lián)用的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)經(jīng)歷了近十年的高速發(fā)展，已成為系統(tǒng)水平上表征各種蛋白質(zhì)翻譯后修飾的標(biāo)準(zhǔn)方法。本文綜述了蛋白質(zhì)翻譯后修飾分析相關(guān)的關(guān)鍵技術(shù)和方法進(jìn)展，主要包括：各種翻譯后修飾蛋白質(zhì)和多肽的富集方法、基于高效液相色譜的多維分離方法和各種生物質(zhì)譜鑒定方法，并重點(diǎn)闡述了近年來(lái)的新的發(fā)展方向?；谙嚓P(guān)技術(shù)的快速發(fā)展和大規(guī)模鑒定數(shù)據(jù)的產(chǎn)生，本文重點(diǎn)介紹了5種具有重要生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，包括：磷酸化、糖基化、泛素化、乙?；图谆?。生物分析化學(xué)領(lǐng)域的方法和技術(shù)創(chuàng)新必將進(jìn)一步促進(jìn)對(duì)蛋白質(zhì)翻譯后修飾的系統(tǒng)水平研究的發(fā)展。

關(guān)鍵詞 蛋白質(zhì)翻譯后修飾； 蛋白質(zhì)組學(xué)； 質(zhì)譜； 綜述

1 引 言

蛋白質(zhì)翻譯后修飾是蛋白質(zhì)水平發(fā)生的一種重要的生物化學(xué)過(guò)程，可為蛋白質(zhì)的特定氨基酸位點(diǎn)引入各種化學(xué)基團(tuán)，例如磷酸根、糖基、甲基、乙?；头核劓湹取Ｔ诓溉閯?dòng)物表達(dá)的所有蛋白質(zhì)中， 超過(guò)50%的蛋白質(zhì)可以在特定時(shí)間和亞細(xì)胞空間發(fā)生各種各樣的翻譯后修飾，并且調(diào)控著許多重要的生物學(xué)功能[1]。目前，已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)近300種蛋白質(zhì)翻譯后修飾，其中很多重要的翻譯后修飾都是以可逆方式被相關(guān)酶調(diào)控的[2]。這些可逆的蛋白質(zhì)翻譯后修飾是動(dòng)態(tài)調(diào)控蛋白質(zhì)功能的重要方式，同時(shí)也為生物體系提供了更高層次的復(fù)雜度。以具有重要生物學(xué)功能以及研究最為廣泛的蛋白質(zhì)磷酸化為例，使底物蛋白質(zhì)發(fā)生磷酸化修飾的酶是激酶，而使磷酸化蛋白質(zhì)發(fā)生去磷酸化的酶是磷酸酶。在人類(lèi)基因組中，分別有518種激酶和約137種磷酸酶。激酶和磷酸酶常有多種底物蛋白質(zhì)，而每種底物蛋白質(zhì)往往有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)。這些被磷酸化的氨基酸序列常會(huì)特異性地被蛋白結(jié)構(gòu)域所識(shí)別（例如SH2、PTB、BRCT結(jié)構(gòu)域等），從而形成基于磷酸化的蛋白質(zhì)間相互作用[3，4]。如圖1A所示，正是由于細(xì)胞內(nèi)存在著數(shù)目龐大的可以“寫(xiě)入”、“擦除”和“識(shí)別”磷酸化位點(diǎn)的蛋白質(zhì)，形成了一個(gè)極為復(fù)雜的由磷酸化介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。從分子水平上，上述細(xì)胞內(nèi)的生物化學(xué)過(guò)程主要涉及各種修飾基團(tuán)的“寫(xiě)入”和“擦除”，以及蛋白質(zhì)間基于特定修飾基團(tuán)的“識(shí)別”。這類(lèi)分子機(jī)理正是生物分析化學(xué)研究的核心生物學(xué)問(wèn)題之一。

傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究主要依賴(lài)于基于特異性抗體的免疫檢測(cè)技術(shù)或放射性標(biāo)記技術(shù)。這些方法對(duì)研究由單一位點(diǎn)翻譯后修飾介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程起著不可替代的作用。然而，由于上述技術(shù)存在操作要求高、特異性抗體制備周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)，很難實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)翻譯后修飾的大規(guī)模檢測(cè)。近年來(lái)，基于液相色譜與生物質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）的蛋白質(zhì)組學(xué)策略發(fā)展迅速，為系統(tǒng)水平上的蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究提供了強(qiáng)有力的研究工具[5，6]。應(yīng)用于蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究的研究策略與鑒定一般多肽樣品的LC-MS流程是基本一致的。然而，蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究常具有極大的技術(shù)挑戰(zhàn)，這主要是因?yàn)椋海?）被修飾蛋白質(zhì)通常僅占總體蛋白質(zhì)表達(dá)量的很小一部分； （2）翻譯后修飾基團(tuán)常具有化學(xué)穩(wěn)定性差、在樣品制備和LC-MS分析過(guò)程中容易丟失的缺點(diǎn)； （3）蛋白質(zhì)翻譯后修飾常是動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)過(guò)程，這為樣品制備和LC-MS分析提出了更高的要求。

如圖1B所示，蛋白質(zhì)翻譯后修飾位點(diǎn)分析的一般流程主要分為以下4個(gè)步驟：蛋白質(zhì)組學(xué)樣品制備、修飾多肽樣品的預(yù)分離和富集、LC-MS分析和生物信息學(xué)分析。作為一種通用型分析技術(shù)策略，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)包括細(xì)胞、組織和體液在內(nèi)的所有生物樣品的全面LC-MS分析。近十年來(lái)，隨著質(zhì)譜硬件技術(shù)的快速發(fā)展，生物質(zhì)譜的靈敏度和掃描速度都有了顯著地提升； 與此同時(shí)，各種在線和離線色譜分離技術(shù)和針對(duì)多種重要翻譯后修飾的選擇性富集方法也層出不窮，為蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究奠定了堅(jiān)實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ)。目前，針對(duì)磷酸化等幾種重要蛋白質(zhì)翻譯后修飾的蛋白質(zhì)組學(xué)研究均可實(shí)現(xiàn)在幾千到上萬(wàn)個(gè)位點(diǎn)的定性和定量表征（表1）。本文主要針對(duì)翻譯后修飾蛋白及相應(yīng)的酶解多肽的色譜富集技術(shù)、色譜分離技術(shù)及質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行

了綜述?；谄渖飳W(xué)重要性和相關(guān)分析技術(shù)快速發(fā)展，本文重點(diǎn)綜述蛋白質(zhì)磷酸化、糖基化、泛素化、乙酰化和甲基化相關(guān)的研究進(jìn)展，并對(duì)未來(lái)發(fā)展方向提出若干展望。

2 翻譯后修飾蛋白及多肽的

富集方法

2.1 磷酸化修飾

磷酸化修飾是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和功能調(diào)控過(guò)程中最重要的翻譯后修飾類(lèi)型之一。由于磷酸化翻譯后修飾的豐度極低，僅約占所在蛋白質(zhì)總量的1%，因此，必須發(fā)展特異性的富集方法，以實(shí)現(xiàn)質(zhì)譜的有效分析。目前，幾種親和富集方法發(fā)展較為完備，可以高效地從細(xì)胞酶解液中將磷酸化修飾的肽段富集出來(lái)，包括金屬氧化物親和色譜法（Metal oxide affinity chromatography，MOAC）、固定化金屬離子親和色譜法（Immobilized metal ion affinity chromatography，IMAC）和基于特異性抗體的富集方法。

2.1.1 金屬氧化物親和色譜法（MOAC） 金屬氧化物親和色譜是一類(lèi)最常用和最為有效的磷酸化肽富集方法。基于金屬氧化物對(duì)磷酸基團(tuán)的高親和力，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)磷酸化多肽的高選擇性富集（一般可以達(dá)90%以上）。多種金屬氧化物已經(jīng)被用于富集磷酸化肽，包括二氧化鈦（TiO2）[12]、二氧化鋯（ZrO2）[13]，五氧化二鈮（Nb2O5）[14]等，其中TiO2以其優(yōu)異的富集效率和富集選擇性被廣泛使用。TiO2富集的一般流程包括以下步驟：首先將樣品酸化（如0.1%（V/V）三氟乙酸），這個(gè)過(guò)程是為了將樣品中的非磷酸化酸性肽段質(zhì)子化，防止它們非特異性地吸附在TiO2顆粒上。然后將樣品與TiO2顆粒充分接觸，以實(shí)現(xiàn)對(duì)磷酸化肽的特異性吸附。經(jīng)過(guò)洗滌步驟之后，磷酸化多肽在堿性條件下（如5%（V/V）氨水）從TiO2顆粒上洗脫下來(lái)。含有酸性氨基酸的多肽（如谷氨酸和天冬氨酸）常會(huì)競(jìng)爭(zhēng)磷酸化肽的結(jié)合位點(diǎn)，從而降低富集方法的選擇性。因此，上樣緩沖液中常要加入2，5二羥苯甲酸[15]、鄰苯二甲酸[16]或谷氨酸[17]等，有效抑制酸性多肽的吸附，從而提高富集選擇性。

2.1.2 固定化金屬離子親和色譜法（IMAC） IMAC是另一種被廣泛應(yīng)用的磷酸化多肽富集方法。通常，正電性的金屬離子可以被含有亞胺乙酸（IDA）或氨三乙酸（NTA）金屬螯合基團(tuán)的載體固定化，可以基于靜電相互作用力， 可選擇性地富集負(fù)電性的磷酸化多肽。各種各樣的金屬離子可以被固定化，并用于高效富集磷酸化多肽，例如Fe3+[18]，Ti4+[19]，Zr4+[20]等。IMAC的操作流程與MOAC類(lèi)似：首先，多肽樣品在酸性條件下上樣，然后清洗非特異性吸附多肽，最后用高pH值的洗脫液或者磷酸鹽緩沖液洗脫被富集的磷酸化多肽。

通常，IMAC富集法對(duì)多磷酸化肽的富集效果強(qiáng)于對(duì)單磷酸化肽的富集。因此，通過(guò)結(jié)合MOAC富集法，可以很好地實(shí)現(xiàn)對(duì)磷酸化多肽的全面富集。在Sequential elution from IMAC（SIMAC）方法中[21]，基于Fe3+-IMAC的富集首先可以將多磷酸化肽很好地富集，然后再串聯(lián)使用TiO2富集，以實(shí)現(xiàn)對(duì)大多數(shù)單磷酸化肽的全面富集。Zhou等[19，22]發(fā)展了一種新的高效磷酸化多肽富集方法Ti4+-IMAC。通過(guò)設(shè)計(jì)并合成多種含有固定化磷酸根的微球，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)Ti4+等金屬離子的高效螯合和磷酸化肽的高選擇性富集。與其它4種常用磷酸化多肽富集方法（Fe3+-IMAC， Zr4+-IMAC， TiO2和ZrO2）相比，Ti4+-IMAC方法展示出更高的富集選擇性和富集效率。該方法的高富集選擇性主要是源于聚合物微球表面所含有的具有靈活性的間隔臂，以及Ti3+與PO34之間的高選擇性作用力。

2.1.3 基于抗體的富集法 酪氨酸磷酸化發(fā)生率非常低，一般只約占人體全部磷酸化修飾的1%[23]。因此，發(fā)展可以區(qū)分絲氨酸和蘇氨酸磷酸化肽的高選擇性酪氨酸磷酸化肽富集方法就顯得尤為必要。基于固定化抗體的富集方法是目前針對(duì)酪氨酸磷酸化肽最有效的富集方法。目前， 最有效的富集抗體包括4G10抗體和PY100抗體。以PY100抗體為例，Rikova等[24]從41種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞和150種非小細(xì)胞肺癌腫瘤中共富集并鑒定到2700多個(gè)蛋白和4551個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，是目前最大規(guī)模的酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析?；诠潭ɑ贵w的富集方法的富集選擇性一般較差，通過(guò)結(jié)合MOAC或IMAC富集方法可以大大提高富集選擇性[7，25]。然而，引入額外的富集步驟也會(huì)大大增加微量樣品的損失。在本研究組的前期工作中，通過(guò)系統(tǒng)優(yōu)化抗體富集的各步驟，實(shí)現(xiàn)了一步抗體富集鑒定超過(guò)800個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)[26]。

2.2 糖基化修飾

蛋白質(zhì)糖基化修飾參與著很多重要的細(xì)胞功能，例如細(xì)胞粘附，受體膜蛋白激活，細(xì)胞免疫反應(yīng)等。大多數(shù)位于細(xì)胞膜，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞外的蛋白質(zhì)均會(huì)發(fā)生糖基化修飾。在眾多蛋白質(zhì)糖基化修飾中，發(fā)生在天冬酰胺上的N-連糖基化修飾和發(fā)生在絲氨酸和蘇氨酸上的O-連糖基化修飾是最常見(jiàn)和研究最廣泛的糖基化修飾。應(yīng)用于富集糖基化蛋白質(zhì)或多肽的方法主要有固定化凝集素和酰肼化學(xué)兩種。

2.2.1 固定化凝集素富集 基于凝集素對(duì)多糖的選擇性吸附作用，將凝集素固定到合適的基質(zhì)上可以實(shí)現(xiàn)對(duì)糖蛋白或者糖肽的特異性富集[27]。伴刀豆凝集素（Con A）、麥胚凝集素（WGA）、花生凝集素（PNA）和橙黃網(wǎng)孢盤(pán)菌凝集素（AAA）是針對(duì)N-連糖基化蛋白富集廣泛使用的幾種凝集素。由于不同凝集素識(shí)別不同的糖型，通過(guò)結(jié)合使用凝集素ConA、WGA、N-乙酰葡糖胺和凝集素RCA120， Zielinska等[11]發(fā)展了一種膜輔助樣品處理方法用于糖基化蛋白的富集和糖基化位點(diǎn)鑒定，共從4種小鼠組織和血漿中鑒定5753個(gè)糖基化位點(diǎn)，是目前最大的N-連糖基化數(shù)據(jù)集。

2.2.2 基于酰肼化學(xué)的富集

另一種廣泛使用的糖基化蛋白和糖肽富集方法是由Zhang等[28]發(fā)展的基于酰肼化學(xué)的N-連糖基化富集方法。其主要步驟是：首先將糖基化蛋白用高碘酸鈉氧化； 被氧化糖鏈產(chǎn)生的醛基可以與含有酰肼基團(tuán)的樹(shù)脂發(fā)生共價(jià)鍵反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)糖基化蛋白的高選擇性富集； 所固定化的糖基化蛋白可以被糖苷水解酶酶解釋放，可以用于后續(xù)的質(zhì)譜分析。這種方法最大的優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)效率高和特異性好。最近，Zhang等[29]報(bào)道了一種基于氨氧基樹(shù)脂的氧化糖基化蛋白富集方法。與傳統(tǒng)的酰肼化學(xué)法相比，該方法具有更高的反應(yīng)活性，從而大大降低了樣品處理的周期。

2.3 泛素化修飾

泛素是含有76個(gè)氨基酸的多肽序列。一個(gè)或多個(gè)該多肽序列可以通過(guò)其C末端的兩個(gè)甘氨酸殘基選擇性地修飾到多個(gè)底物蛋白質(zhì)的賴(lài)氨酸位點(diǎn)上。蛋白質(zhì)泛素化修飾是激活蛋白質(zhì)降解機(jī)制的關(guān)鍵性信號(hào)，在DNA修復(fù)和細(xì)胞凋亡等重要生物學(xué)過(guò)程中都起著至關(guān)重要的作用。傳統(tǒng)的泛素化蛋白質(zhì)的富集主要通過(guò)在其泛素鏈末端引入親和富集標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)。以酵母細(xì)胞為模型和6×His tag標(biāo)簽對(duì)泛素化進(jìn)行標(biāo)記，Peng等[30]首次實(shí)現(xiàn)了對(duì)泛素化蛋白及其泛素化位點(diǎn)的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定。然而，該方法的顯著缺陷是缺乏對(duì)泛素化位點(diǎn)的選擇性富集。基于胰蛋白酶酶解產(chǎn)生的泛素化多肽會(huì)殘留兩個(gè)甘氨酸殘基的特征，目前最為有效的泛素化多肽富集方法是基于上述雙甘氨酸殘基的抗體富集法[31]。通過(guò)結(jié)合各種離線色譜分離策略，該抗體富集法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于鑒定成千上萬(wàn)個(gè)泛素化位點(diǎn)[32]。

2.4 乙?；揎?/p>

蛋白質(zhì)乙?；揎椫饕l(fā)生在蛋白質(zhì)賴(lài)氨酸位點(diǎn)上，是組蛋白和轉(zhuǎn)錄因子等關(guān)鍵功能性蛋白質(zhì)的重要調(diào)控機(jī)制。大規(guī)模乙酰化位點(diǎn)鑒定主要得益于特異性抗體和先進(jìn)的質(zhì)譜儀器的發(fā)展。芝加哥大學(xué)趙英明團(tuán)隊(duì)首先發(fā)展了一種針對(duì)乙酰化蛋白的抗體，并首次實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)乙?；稽c(diǎn)的系統(tǒng)水平分析，共鑒定了388個(gè)乙?；稽c(diǎn)[33]。最近，Mann等[34]使用相同抗體并結(jié)合先進(jìn)的軌道阱質(zhì)譜儀（Orbitrap）實(shí)現(xiàn)了對(duì)乙?；稽c(diǎn)最大規(guī)模的鑒定，共從人類(lèi)急性髓系白血病細(xì)胞器中鑒定到約3600個(gè)賴(lài)氨酸乙?；稽c(diǎn)。這充分說(shuō)明了特異性抗體對(duì)低豐度修飾多肽富集的高效率和先進(jìn)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)分析的重要性。

2.5 甲基化修飾

蛋白質(zhì)甲基化修飾主要發(fā)生在蛋白質(zhì)的賴(lài)氨酸和精氨酸位點(diǎn)上。與乙酰化修飾類(lèi)似，蛋白質(zhì)甲基化修飾也是DNA損傷修復(fù)、基因轉(zhuǎn)錄和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要調(diào)控途徑。然而，與其它類(lèi)型翻譯后修飾相比，蛋白質(zhì)甲基化修飾的大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)研究一直比較落后。這主要是因?yàn)榧谆揎椈鶊F(tuán)較小，很難發(fā)展針對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)的有效富集方法。Boisvert等[35]首先使用4種特異性精氨酸甲基化抗體（ASYM24、ASYM25、SYM10和SYM11）對(duì)甲基化蛋白質(zhì)進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析。最近，Cell Signaling公司發(fā)展了多種針對(duì)不同類(lèi)型甲基化的特異性抗體，實(shí)現(xiàn)了對(duì)超過(guò)1000多個(gè)精氨酸甲基化位點(diǎn)和約160個(gè)賴(lài)氨酸甲基化位點(diǎn)的大規(guī)模鑒定[10]。

正如引言中所述，大部分重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾都有相應(yīng)的特異性蛋白質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域[36]。例如，人蛋白質(zhì)組中有120個(gè)可以特異性識(shí)別酪氨酸磷酸化的SH2蛋白質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于高選擇性地檢測(cè)和富集酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)[37]。在人蛋白質(zhì)組中也存在著5種甲基化蛋白質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域： Tudor， Chromo， MBT， PWWP和Agenet[38]。最近， Moore等[39]篩選獲得一種MBT結(jié)構(gòu)域，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)賴(lài)氨酸甲基化蛋白質(zhì)的廣譜性富集和大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)分析。可以預(yù)期基于蛋白質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的親和富集方法將在蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究中起到越來(lái)越重要的作用。

2.6 逐步富集多種修飾蛋白

多種蛋白質(zhì)翻譯后修飾的協(xié)同調(diào)控是調(diào)控各種生物學(xué)過(guò)程的重要分子機(jī)制。實(shí)現(xiàn)對(duì)這種協(xié)同調(diào)控機(jī)制的系統(tǒng)水平表征，將為生物學(xué)研究提供更高維度的分子機(jī)理。最近Mertins等[40]發(fā)展了一種針對(duì)同一生物學(xué)樣品中蛋白質(zhì)磷酸化、乙?；头核鼗揎椂嚯牡闹鸩礁患椒ǎ⊿EPTM），從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)特定樣品中多種蛋白質(zhì)翻譯后修飾的全面分析。該方法依次對(duì)同一生物樣品使用IMAC親和富集、泛素化特異性抗體富集和乙?；禺愋钥贵w富集，共檢測(cè)到20000多個(gè)磷酸化修飾位點(diǎn)、15000多個(gè)泛素化修飾位點(diǎn)和3000多個(gè)乙酰化修飾位點(diǎn)（圖2）。在這些被修飾的多肽中有0.3%的多肽存在多種修飾類(lèi)型同時(shí)發(fā)生的現(xiàn)象。Swaney等[41]針對(duì)蛋白質(zhì)磷酸化和泛素化修飾多肽進(jìn)行了類(lèi)似的串聯(lián)富集和大規(guī)模質(zhì)譜鑒定，最終發(fā)現(xiàn)在466個(gè)蛋白中同時(shí)存在2100個(gè)磷酸化修飾位點(diǎn)和2189個(gè)泛素化修飾位點(diǎn)。

圖2 SEPTM逐步富集方法用于系統(tǒng)研究同一生物樣品中的多種蛋白質(zhì)翻譯后修飾[40]

Fig.2 Serial enrichment of different post-translational modification （SEPTM） enables sequential enrichment of different PTMs from the same biological sample[40]

3 多維液相色譜分離

蛋白質(zhì)組學(xué)樣品均具有極高的復(fù)雜度，因此需要對(duì)其進(jìn)行高效的分離以提高質(zhì)譜鑒定效率。在蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究中，在選擇性富集修飾多肽前或者富集后常需要對(duì)酶解多肽進(jìn)行有效的預(yù)分離。高效液相色譜是目前蛋白質(zhì)組學(xué)策略中的標(biāo)準(zhǔn)化分離手段，這主要是因?yàn)槠渚哂袠O高的酶解多肽分離能力，并且能很好地與質(zhì)譜儀進(jìn)行在線聯(lián)用[42]。為了顯著提高液相色譜的分離效率，降低多肽的復(fù)雜度，多維液相色譜是目前最為廣泛使用的色譜分離模式[43]?；谠诰€低pH反相液相色譜與質(zhì)譜儀之間的良好相容性，其它色譜分離模式與在線低pH反相液相色譜之間的的分離正交性是多維液相色譜分離中最重要的考慮因素[44]。以應(yīng)用磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)為例，介紹目前最為廣泛使用的幾種多維液相色譜分離模式。

3.1 離子交換色譜分離

離子交換色譜用于多肽分離主要是基于磷酸化多肽與固定相表面的強(qiáng)陽(yáng)離子交換基團(tuán)（SCX）或強(qiáng)陰離子交換基團(tuán)（SAX）間的靜電相互作用實(shí)現(xiàn)分離。另外，在高乙腈濃度流動(dòng)相中，眾多離子交換色譜填料可以展示出很好的親水相互作用色譜（HILIC）性質(zhì)，從而可以基于親水相互作用分離酶解多肽[45]。在磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)中，SCX是被最為廣泛使用的一種色譜分離模式[18]。SCX分離磷酸化多肽的主要原理是：在酸性條件（如pH 2.7）下，磷酸化多肽的N端氨基和C端的賴(lài)氨酸或精氨酸殘基都被質(zhì)子化，磷酸基團(tuán)的存在會(huì)降低多肽的價(jià)態(tài)。因此，磷酸化肽在SCX色譜填料上的保留較常規(guī)多肽更弱，從而實(shí)現(xiàn)了磷酸化多肽的有效富集和分離。通過(guò)與IMAC富集方法結(jié)合，Hottlin等[46]從9種小鼠組織中共鑒定到36000多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，很好地展示了SCX與反相液相色譜的高正交性和其應(yīng)用于磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究的強(qiáng)大分離能力。與SCX相比，SAX對(duì)磷酸化肽具有更有效的保留，因此也被廣泛地應(yīng)用于磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究中[47，48]。其主要優(yōu)勢(shì)是可以對(duì)多磷酸化肽、單磷酸化肽和非磷酸化肽實(shí)現(xiàn)更有效的分離。然而，離子交換色譜模式進(jìn)行多肽分離一般都需要使用高濃度鹽進(jìn)行梯度洗脫，從而引入了額外的柱后除鹽步驟，導(dǎo)致樣品損失。

3.2 基于高pH反相液相色譜的分離

多肽在反相色譜中的分離是基于其與固定相上的C18基團(tuán)之間的疏水相互作用實(shí)現(xiàn)的。Gilar等[50]首次將高pH反相色譜和低pH反向色譜結(jié)合使用，進(jìn)行二維液相色譜分離，獲得了優(yōu)秀的正交性。該二維分離模式正交性的主要原因可能是肽段在不同的pH條件下電荷分布不同。中科院大連化物所鄒漢法研究組對(duì)該方法在磷酸化多肽的分離方面進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化，并創(chuàng)造性地引入了等間隔先流出組分和后流出組分樣品混合法（圖3）[49]。該方法的優(yōu)勢(shì)是：（1）去除了額外的除鹽步驟，從而大大降低了微量多肽樣品的損失； （2）通過(guò)合并樣品可以大大減少質(zhì)譜分析時(shí)間，但同時(shí)又不降低二維色譜分離的正交性。正是由于上述顯著的樣品處理優(yōu)勢(shì)，該分離策略成為目前蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域中最為廣泛使用的多維色譜分離模式[32，51]?；谏鲜鼋榻B的多維色譜模式， Ficarro等[52]進(jìn)一步發(fā)展了一種基于高pH反相色譜，SAX色譜和低pH反相色譜的三維色譜分離系統(tǒng)； 通過(guò)與質(zhì)譜進(jìn)行在線聯(lián)用，最大化地實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜磷酸化多肽樣品的分離和高靈敏度質(zhì)譜檢測(cè)。作者從1×106～3×106個(gè)細(xì)胞中（約5～10 μg）共鑒定了約2500個(gè)非冗余的磷酸化多肽，是目前應(yīng)用于蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究最靈敏的LC-MS技術(shù)。

4 生物質(zhì)譜鑒定

應(yīng)用于蛋白質(zhì)翻譯后修飾的生物質(zhì)譜技術(shù)主要需要完成以下任務(wù)：（1）鑒定發(fā)生修飾的蛋白質(zhì)； （2）鑒定發(fā)生修飾的氨基酸位點(diǎn)及修飾基團(tuán)的化學(xué)結(jié)構(gòu)； （3）定量分析修飾蛋白占總體蛋白表達(dá)量的比例。存在于蛋白質(zhì)上的修飾基團(tuán)常具有化學(xué)穩(wěn)定性差和豐度低的特點(diǎn)，因此對(duì)于質(zhì)譜檢測(cè)提出了更高的要求。近年來(lái)，多種溫和的碎裂技術(shù)相繼誕生，大大促進(jìn)了修飾多肽的質(zhì)譜檢測(cè)效果。以研究最為廣泛的磷酸化修飾為例，本文闡述應(yīng)用于修飾多肽檢測(cè)的重要質(zhì)譜碎裂技術(shù)，主要包括：碰撞誘導(dǎo)解離（Collision-induced dissociation， CID）、高能碰撞解離技術(shù)（High-energy collisional dissociation，HCD）、基于電子誘導(dǎo)的電子捕獲解離（Electron capture dissociation，ECD）和電子轉(zhuǎn)移解離技術(shù)（Electron transfer dissociation，ETD）。

4.1 碰撞誘導(dǎo)解離（CID）

CID是串聯(lián)質(zhì)譜法中最常用的碰撞解離方法。它利用惰性氣體分子撞擊肽段母離子使其在酰胺鍵處斷裂，產(chǎn)生具有豐富序列信息的b-和y-型離子。由于磷酸基團(tuán)在CID過(guò)程中易發(fā)生中性丟失，影響了它對(duì)磷酸化多肽序列的有效鑒定。中性丟失的程度與很多因素有關(guān)，如電荷態(tài)、化學(xué)結(jié)構(gòu)、質(zhì)子化試劑、碎裂能量等。酪氨酸磷酸化易丟失HPO3（80 Da）的中性碎片，而絲氨酸和蘇氨酸磷酸化更傾向于丟失H3PO4 （98 Da）的中性碎片[53]。這主要是由于酪氨酸磷酸化的CO鍵鍵能更大，不易碎裂。

為了解決磷酸化肽易發(fā)生中性丟失的問(wèn)題，在離子阱質(zhì)譜中常進(jìn)一步采用第三級(jí)質(zhì)譜MS3碎裂，以獲得更多的碎片離子信息[54]。多級(jí)活化解離，又稱(chēng)虛擬的MS3，將發(fā)生中性丟失的產(chǎn)物離子和母離子同時(shí)活化，并記錄所有的碎片離子[55]。MSA方法常用于低分辨的離子阱質(zhì)譜中，而在高分辨、高質(zhì)量精度類(lèi)質(zhì)譜（如Orbitrap）中的應(yīng)用不多[54]。這主要是因?yàn)檫@類(lèi)質(zhì)譜可以高通量地獲得母離子的精確質(zhì)量數(shù)，因此常規(guī)的MS2碎裂已經(jīng)可以滿(mǎn)足檢測(cè)需求，額外的MS3和多級(jí)活化解離反而會(huì)消耗本可以用于測(cè)序新肽段的質(zhì)譜時(shí)間。

4.2 高能碰撞誘導(dǎo)解離（HCD）

HCD通過(guò)在高能碰撞室中提供比 CID更高的碰撞能量和更短的活化時(shí)間來(lái)解離離子[56，57]。與基于離子阱的CID相比，HCD所產(chǎn)生的中性丟失峰較少，主要產(chǎn)生序列特異性的y-型離子和某些b-型離子（圖4）。在HCD中，b-型離子傾向于進(jìn)一步解離成a-型離子，因此b-型離子的數(shù)目較y-型離子少。同時(shí)，由于HCD的能量更大，它常產(chǎn)生更小的碎片離子，如磷酸化酪氨酸特異性的Immonium離子。HCD碎裂克服了常規(guī)離子阱存在的1/3低質(zhì)量范圍限制，同時(shí)提供了比CID更高的分辨率，是Orbitrap質(zhì)譜儀的標(biāo)配解離模式，被廣泛用于蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究。

4.3 基于電子誘導(dǎo)的解離（ECD/ETD）

與CID相比，基于電子誘導(dǎo)的解離方法，電子捕獲解離（ECD）和電子轉(zhuǎn)移解離（ETD），是一種溫和的軟解離方式，能夠產(chǎn)生肽骨架碎裂信息并保留修飾基團(tuán)。在ECD過(guò)程中，母離子被近熱電子活化，酰胺鍵上的氧原子從鄰近的氨基酸殘基上轉(zhuǎn)移一個(gè)質(zhì)子，此過(guò)程放熱使N-Cα鍵發(fā)生斷裂產(chǎn)生c-型和z-型離子[58]。在ETD過(guò)程中，熒蒽自由基陰離子攜帶電子與肽段陽(yáng)離子發(fā)生相互作用，此過(guò)程使多肽電荷數(shù)降低并誘導(dǎo)肽骨架的碎裂，產(chǎn)生一系列互補(bǔ)的c-型和z-型離子[59]。與CID相比，ETD更適合高電荷態(tài)和包含堿性殘基肽段的測(cè)序。CID和ETD的互補(bǔ)使用有利于增加蛋白的鑒定數(shù)目和提高序列覆蓋度，對(duì)大規(guī)模鑒定磷酸化肽十分有利[60]。另外，ECD和ETD方法是目前應(yīng)用于糖基化多肽糖鏈結(jié)構(gòu)解析最為有效的裂解方法[61]?；谏鲜龅慕怆x方法，Heck研究小組發(fā)展了一種集成化的解離技術(shù)，名為EThcD。顧名思義，該方法將適合磷酸化位點(diǎn)分析的ETD和HCD碎裂技術(shù)結(jié)合起來(lái)[62]。ETD不能斷裂N-端連接脯氨酸殘基的NCα鍵，這限制了它對(duì)脯氨酸含量高的磷酸化肽的修飾位點(diǎn)的確認(rèn)。而EThcD方法很好地克服了這方面的缺陷，能夠產(chǎn)生豐富的b/y和c/z型離子。

5 結(jié)論與展望

蛋白質(zhì)翻譯后修飾多達(dá)300多種，它們具有化學(xué)穩(wěn)定性差、豐度低和動(dòng)態(tài)變化等特點(diǎn)，在各種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用?；贚C-MS的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)成千上萬(wàn)種修飾位點(diǎn)的大規(guī)模定性和定量分析，這其中主要包括磷酸化、糖基化、泛素化、乙酰化和甲基化修飾。如本文所述，對(duì)這些重要翻譯后修飾的大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)分析的實(shí)現(xiàn)主要?dú)w功于眾多方法學(xué)的巨大進(jìn)步，主要包括高選擇性和高效富集方法的發(fā)展、高容量和高正交性多維色譜技術(shù)的發(fā)展以及高靈敏度和高掃描速度生物質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展。隨著通用型多維色譜技術(shù)和生物質(zhì)譜技術(shù)的不斷完善，新的蛋白質(zhì)翻譯后修飾的大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)研究更多局限于高選擇性和高效富集方法的發(fā)展。如表1所示，在目前主要研究的蛋白質(zhì)翻譯后修飾中，甲基化修飾的大規(guī)模質(zhì)譜鑒定仍處于較低的水平。這主要是因?yàn)楦鞣N甲基化修飾基團(tuán)的分子尺寸較小，很難發(fā)展高特異性的富集方法。在傳統(tǒng)抗體技術(shù)無(wú)法很好地解決這一難題的情況下，基于MBT甲基化蛋白質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的富集方法為甲基化蛋白質(zhì)組研究提供了新穎的高效富集方法[39]。由于幾乎所有的重要蛋白質(zhì)翻譯后修飾都有眾多與之對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，可以預(yù)期該類(lèi)富集方法將會(huì)成為未來(lái)蛋白質(zhì)翻譯后修飾富集方法發(fā)展的重要方向。

此外，隨著多種重要蛋白質(zhì)翻譯后修飾大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法的逐步成熟，越來(lái)越多的研究者開(kāi)始關(guān)注在相關(guān)生物體系中的應(yīng)用研究，尤其是對(duì)多種翻譯后修飾在同一蛋白質(zhì)上的協(xié)同作用研究。目前的相關(guān)研究主要針對(duì)大規(guī)模質(zhì)譜鑒定效果最好的翻譯后修飾，即磷酸化、泛素化和乙?；??？梢灶A(yù)期，隨著其它相關(guān)蛋白質(zhì)翻譯后修飾富集方法的不斷發(fā)展和完善，針對(duì)特定生物學(xué)體系的多種翻譯后修飾的協(xié)同作用研究將會(huì)得到進(jìn)一步發(fā)展，并在相關(guān)生物學(xué)研究中起到關(guān)鍵作用?？傊?，色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的技術(shù)已經(jīng)為蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究提供了革命性的系統(tǒng)水平研究工具，傳統(tǒng)生物學(xué)領(lǐng)域的“一個(gè)基因，一個(gè)蛋白質(zhì)，一種生物學(xué)功能”的理念已經(jīng)被完全打破。基于色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)策略所產(chǎn)生的海量質(zhì)譜數(shù)據(jù)， 已經(jīng)推動(dòng)蛋白質(zhì)翻譯后修飾及相關(guān)生物學(xué)領(lǐng)域進(jìn)入了全新的系統(tǒng)生物學(xué)研究時(shí)代。

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