【摘要】 神經(jīng)嵴細(xì)胞（NCCs）是脊椎動(dòng)物早期發(fā)育過程中從神經(jīng)管背緣發(fā)育而來的一組獨(dú)特的細(xì)胞，具有很強(qiáng)的增殖能力。顱骨缺損修復(fù)組織工程是神經(jīng)外科重要方向，隨著NCCs的研究，為利用NCCs進(jìn)行顱骨缺損修復(fù)帶來了新思路。本文概述了NCCs在顱骨缺損修復(fù)中的效果及相關(guān)成骨機(jī)制，同時(shí)探討其用于顱骨缺損修復(fù)的應(yīng)用前景，旨在為NCCs在顱骨缺損修復(fù)的研究及應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 神經(jīng)嵴細(xì)胞；顱骨；缺損修復(fù)；成骨分化

【中圖分類號(hào)】 R651" 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A" 【文章編號(hào)】 1672-7770（2025）01-0106-04

Research progress of neural crest cells in repairing skull defect

Abstract： Neural crest cells（NCCs） are a unique group of cells that develop from the dorsal margin of the neural tube during the early development of vertebrates and possess a strong proliferative ability. Tissue engineering for cranial defect repair is an important direction in neurosurgery. With the research on NCCs， new ideas have been brought about for the use of NCCs in cranial defect repair. This article outlines the effects of NCCs in cranial defect repair and the related osteogenic mechanisms. Meanwhile， it explores the application prospects of their use in cranial defect repair， aiming to provide certain theoretical bases for the research and application of NCCs in cranial defect repair.

Key words： neural crest cell; skull; defect repair; osteogenic differentiation

顱骨作為腦組織最直接的保護(hù)屏障，若出現(xiàn)缺損不及時(shí)修補(bǔ)會(huì)因體位、情緒和負(fù)壓等導(dǎo)致腦組織在顱內(nèi)移動(dòng)，從而造成腦穿通性畸形、癲癇發(fā)作和腦變性萎縮等傷害，因此盡早修補(bǔ)顱骨缺損可以減少腦組織的損害。研究表明，臨床一直沿用的治療顱骨缺損的方式包括自身顱骨回填、自體骨和異體骨移植、鈦網(wǎng)等材料修補(bǔ)。自身顱骨的回填方式需要將手術(shù)取下的顱骨置于腹部，給患者造成極大的生活障礙，自體骨的移植對(duì)于較大的缺損卻無法實(shí)施，異體骨以及鈦網(wǎng)的植入可能會(huì)引起免疫排斥反應(yīng)導(dǎo)致修補(bǔ)的失敗。干細(xì)胞的骨再生和骨組織工程技術(shù)是顱骨修復(fù)和重建領(lǐng)域的一種尖端技術(shù)［1］。神經(jīng)嵴細(xì)胞（neural crest cells，NCCs）是脊椎動(dòng)物早期發(fā)育過程中從神經(jīng)管背緣發(fā)育而來的一組獨(dú)特的細(xì)胞，作為一種去分化狀態(tài)的干細(xì)胞大量存在于臍帶血和成體動(dòng)物組織當(dāng)中，廣泛遷移到大多數(shù)組織和器官中，并產(chǎn)生多種分化的細(xì)胞類型［2］；它們?yōu)楦杉?xì)胞的骨再生和骨組織工程提供了一個(gè)具有治療前景的儲(chǔ)備庫，因此NCCs在顱骨修復(fù)領(lǐng)域中成為越來越熱門的研究對(duì)象。

1 NCCs的特點(diǎn)及表面標(biāo)志

1.1 NCCs的特點(diǎn) 神經(jīng)嵴（NC）是脊椎動(dòng)物胚胎中的獨(dú)特結(jié)構(gòu)，脊椎動(dòng)物體內(nèi)幾乎沒有一個(gè)器官或組織是NCCs不貢獻(xiàn)的。NCCs具有很強(qiáng)的增殖能力和多向分化的潛能，有助于全身多種細(xì)胞類型和組織的構(gòu)成，如神經(jīng)、骨骼、腎上腺和甲狀腺的內(nèi)分泌細(xì)胞及結(jié)締組織等［3］。NCCs具有與巨噬細(xì)胞相似的吞噬作用，可在白細(xì)胞介素-1β介導(dǎo)下，吞噬細(xì)胞碎片形成PI（3）P+和Lamp1+的吞噬體［4］。NCCs還可以分泌細(xì)胞因子、趨化因子、營養(yǎng)活性因子等［5］。因此，由于這種多能性，它被稱為第四胚層。

1.2 NCCs的表面標(biāo)志 NCCs與其他干細(xì)胞一樣，表面標(biāo)志物存在多種。經(jīng)過對(duì)NCCs的生物標(biāo)志物廣泛的研究，排除了因傳代原因表面標(biāo)志的降低以及相對(duì)高水平的血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31，造血干/祖細(xì)胞標(biāo)志物CD34、CD133和間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物CD13、CD73，確定了幾個(gè)關(guān)鍵的標(biāo)志物，分別為p75/CD271、HNK1/CD57、a4/CD49d，其中p75神經(jīng)營養(yǎng)因子受體（p75NTR）也稱為低親和力神經(jīng)生長因子和CD271，被公認(rèn)為NCC的穩(wěn)健標(biāo)志物［6］。

2 NCCs成骨分化的影響因素

目前已經(jīng)證明，有多種多樣的相互作用信號(hào)、轉(zhuǎn)錄因子和下游效應(yīng)器決定NCCs的命運(yùn)、遷移和分化。NCCs在一定的影響因素下，可轉(zhuǎn)換成為成骨細(xì)胞，為治療骨相關(guān)的疾病提供前提，尤其是在顱骨的缺損修復(fù)方面。誘導(dǎo)NCCs成骨的相關(guān)通路很多，其中轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor β，TGFβ）、成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、Wnt、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、河馬信號(hào)（Hippo-Yap）、血小板生長因子（platelet growth factor，PGDF）、刺猬信號(hào)（Hedgehog，Hh）被認(rèn)為是調(diào)節(jié)NCCs成骨分化的重要信號(hào)通路。

2.1 TGFβ TGF信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)組織間相互作用，以控制器官發(fā)生和組織穩(wěn)態(tài)，其在NCCs來源的骨的增殖和分化中起著至關(guān)重要的作用。TGFβ是通過TGFβⅡ型受體和TGFβⅠ型受體（又名Alk5）形成的異構(gòu)體復(fù)合物誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Smad（Smad2/3），以調(diào)節(jié)顱骨發(fā)育過程。 NCCs中Tgfbr2的缺失會(huì)導(dǎo)致非典型TGFβ信號(hào)被激活，而典型TGFβ信號(hào)傳導(dǎo)受到損害，造成顱骨畸形［7］，TGFβ激活激酶1（TGFβ activate kinase 1，Tak1）的缺失，導(dǎo)致Tak1缺陷突變體顯示圓形顱骨，上頜骨、下頜骨發(fā)育不良以及不同程度的腭裂發(fā)生。

2.2 FGF FGF主要通過FGF受體1 （FGF receptor 1，F(xiàn)gfr1）與Fgfr2調(diào)節(jié)NCCs。抑制轉(zhuǎn)錄因子Bcl11b和同源蛋白基因1（EN1）是Fgfr2的調(diào)節(jié)因子。Bcl11b主要在顱縫間充質(zhì)中表達(dá)。在NCCs中，敲除Bcl11b會(huì)使顱骨礦化增強(qiáng)以及成骨細(xì)胞過早分化［8］。

2.3 WNT和BMP 目前發(fā)現(xiàn)兩種WNT的抑制劑，Tcf7l1（Wnt靶基因的轉(zhuǎn)錄抑制因子）和Dkk1。Tcf7l1的條件失活導(dǎo)致前神經(jīng)外胚層中Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)的異常激活及NCCs的轉(zhuǎn)化，而Dkk1通過抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)可造成胚胎的前部區(qū)域缺乏NCCs［9］。Bmp4-Msx1通路和Osr2可通過對(duì)抑制Wnt拮抗劑的分泌，使Dkk2和Sfrp2得以表達(dá)，避免顱骨發(fā)育異常［10］。另外在體外單純使用Bmp4處理NCCs后，NCCs骨相關(guān)基因的水平增加，其能夠產(chǎn)生更多骨細(xì)胞［11］。

2.4 Hippo-Yap Hippo-Yap通路是一種保守的基礎(chǔ)通路，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活和分化方面起關(guān)鍵作用，對(duì)于正常的NCCs發(fā)育是必不可少的。Hippo-Yap通路可調(diào)節(jié)胚胎中BAF到NC的遷移中發(fā)揮作用。Hippo激酶Lats1/2通過抑制下游復(fù)合物的形成促進(jìn)NCCs的增殖和存活［12］。FoxO6是Hippo-Yap傳導(dǎo)的激活劑，在小鼠發(fā)育的后期，F(xiàn)oxO6在顱骨組織中特異性表達(dá)，引導(dǎo)顱骨的擴(kuò)張［13］。

2.5 PGDF PGDF包括四個(gè)配體（PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D）和兩個(gè)酪氨酸激酶受體（PDGFRα和β）。PDGFRα和β調(diào)節(jié)胚胎發(fā)生期間的顱骨發(fā)育，兩種信號(hào)傳導(dǎo)共同降低時(shí)，顱面部間充質(zhì)的增殖顯著降低。Mo等［14］的研究發(fā)現(xiàn)，PDGFRα在NCCs遷移中起主要作用，而PDGFRβ主要有助于妊娠中期顱面部間充質(zhì)的增殖。PDGFRα可以激活三種主要的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，磷脂酶C-γ（phospholipase C-γ，PLC-γ）途徑最為重要。PDGFRα信號(hào)通過激活PLC-γ途徑刺激NCCs引起骨細(xì)胞的增殖加強(qiáng)，成骨細(xì)胞礦化加速［15］。

2.6 Hh信號(hào) 在過去的二十年中，已經(jīng)確定了Hh信號(hào)在顱骨形成中的關(guān)鍵功能。Hh信號(hào)通路的組成包括多種配體，其中刺猬配體（聲波刺猬 ［SHh］、印度刺猬 ［IHh］ 和沙漠刺猬 ［DHh］）在顱面形態(tài)發(fā)生中發(fā)揮重要作用，Shh向NCCs發(fā)出信號(hào)，避免異常的NCCs發(fā)育和畸形的顱底［16］。Shh上調(diào)NCCs中的Osx表達(dá)，增加NCCs衍生細(xì)胞的產(chǎn)生，并間接上調(diào)破骨細(xì)胞活性，導(dǎo)致更多的骨吸收和更少的骨強(qiáng)度［17］。

3 NCCs在顱骨缺損修復(fù)中的作用

顱骨缺損后自身骨或剛性材料均有局限性，而應(yīng)用干細(xì)胞搭載支架來修補(bǔ)顱骨缺損修復(fù)有廣闊前景，NCCs的高成骨、低成脂、同源兼容、細(xì)胞吞噬、組織及神經(jīng)修復(fù)性的作用突出，可能成為理想選擇。

3.1 NCCs的提取及分離

3.1.1 NCCs的提取方法 NCCs從神經(jīng)管中分離并遷移到顴弓，在顴弓處顯示出骨骼和軟骨獨(dú)有的特征，因此有一種方法是通過手術(shù)直接從胚胎中獲取顴弓，使用該方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，需要經(jīng)過通過動(dòng)物保護(hù)機(jī)構(gòu)和使用委員會(huì)批準(zhǔn)［18］。而另一種方法是通過誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs），從中提取NCCs。iPSCs可從胎兒的臍帶血中獲得，通過誘導(dǎo)iPSCs使其轉(zhuǎn)變?yōu)镹CCs，不但不會(huì)引起醫(yī)學(xué)倫理，而且取之不盡、用之不竭［19］。

3.1.2 NCCs的分離 通過顴弓來獲取NCCs，需要用細(xì)胞解離酶（TrypLE）對(duì)其進(jìn)行處理，在100×g轉(zhuǎn)速下離心5 min，去掉上清液后，加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS），繼續(xù)用相同的轉(zhuǎn)速和時(shí)間反復(fù)處理3～4次，最后獲得CNCs［18］。另外，通過誘導(dǎo)iPSCs轉(zhuǎn)變?yōu)镹CCs，可直接獲得NCCs。兩種方式都需要通過迭代培養(yǎng)，獲取貼壁生長的NCCs。

3.2 高成骨和低脂肪化作用 目前采用的干細(xì)胞大多選用脂肪干細(xì)胞和骨髓干細(xì)胞，而現(xiàn)在研究的NCCs在顱骨的修復(fù)中表現(xiàn)出了高于其他干細(xì)胞的高成骨和低脂肪化能力。Xu等［20］的研究進(jìn)一步證實(shí)，雖然脂肪干細(xì)胞和骨髓干細(xì)胞具有相似的形態(tài)和細(xì)胞表面標(biāo)志物，但他們的分化潛能受到其來源組織的高度影響，并通過重要轉(zhuǎn)錄因子的DNA甲基化等表觀遺傳調(diào)控；因此，與脂肪干細(xì)胞相比，骨髓干細(xì)胞具有更強(qiáng)的成骨能力，脂肪分化潛力較低。Srinivasan等［21］的研究發(fā)現(xiàn)，無論是在二維培養(yǎng)中還是在PCL-Tcp支架中，NCCs在早期成骨細(xì)胞階段維持增殖時(shí)間更長，并在傳代后仍保持高增殖能力；NCCs還能分泌促進(jìn)宿主成骨細(xì)胞增殖和分化的因子，這些因素導(dǎo)致NCCs相對(duì)于骨髓干細(xì)胞具有更好的增殖能力，并顯示出良好的成骨和成軟骨分化能力，但成脂分化較低。NCCs在顱骨缺損處形成骨化中心以及表現(xiàn)為低凋亡率和高成骨能力，使修補(bǔ)能達(dá)到更好效果［22］。

3.3 同源兼容作用 顱骨架的主要部分及其干細(xì)胞起源于NCCs，包括額葉和頂間部分以及矢狀顱縫。Glaeser等［19］采用骨髓干細(xì)胞和NCCs同時(shí)對(duì)顱骨缺損處進(jìn)行修補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)隨著植入時(shí)間的增長，NCCs比骨髓干細(xì)胞的存活率高，存活時(shí)間長。置入的NCCs與缺損邊緣之間相比于骨髓干細(xì)胞，呈現(xiàn)出高連接密度（骨橋接連接緊密）和少量的纖維化。NCCs修補(bǔ)顱骨缺損后表現(xiàn)出較高的生物力學(xué)性，不但修補(bǔ)處的骨厚度增加，而且缺損處骨與周圍顱骨連接緊密，從而能抵抗更強(qiáng)的外力對(duì)腦組織帶來的傷害。

3.4 適用于外傷導(dǎo)致的顱骨缺損修復(fù) 外傷導(dǎo)致的顱骨缺損常常伴隨著無菌性炎癥，面部皮膚受損，腦挫傷等情況。NCCs具有吞噬作用，在損傷發(fā)生后，吞噬功能的水平顯著增加，在吞噬損傷和死亡的細(xì)胞后，形成PI（3）P和Lamp1吞噬體［4］。這種吞噬性能夠有效地減少無菌性炎癥的發(fā)生，從而大大增加缺損修復(fù)的成功率。NCCs在顱面部參與組織再生，兩棲動(dòng)物肢體再生的研究［2324］也證明了這一點(diǎn)。NCCs與其他種類干細(xì)胞最大的不同在于，當(dāng)周圍神經(jīng)受到損傷時(shí)，可以遷移到損傷處，與損傷處的組織相互融合建立聯(lián)系，通過激活施萬細(xì)胞釋放多種因子修復(fù)周圍受損的神經(jīng)［25］。NCC自身也會(huì)產(chǎn)生和分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，來促進(jìn)受損的神經(jīng)突生長和周圍神經(jīng)再生［5］。

4 總 結(jié)

綜上所述，在目前研究的干細(xì)胞中，NCCs顯得尤為突出。NCC參與幾乎所有脊椎動(dòng)物器官和組織形成。相比于目前修復(fù)所用的干細(xì)胞，NCCs所具有的吞噬功能可以降低周圍壞死物質(zhì)引起的炎癥反應(yīng)。NCCs的低死亡率和高成活率，為缺損處所需的細(xì)胞數(shù)量提供保證，NCCs的自我更新能力優(yōu)越，增加修復(fù)區(qū)域的成功率。此外，NCCs還能激活神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，分泌和釋放營養(yǎng)和修復(fù)因子，修復(fù)周圍受損的神經(jīng)。相比于間充質(zhì)干細(xì)胞，采用NCCs進(jìn)行修復(fù)與顱骨缺損的邊緣結(jié)合更加緊密，抵抗外力對(duì)顱腦的損傷的作用更強(qiáng)。這使修復(fù)的區(qū)域與自身成為一個(gè)整體，這是其他干細(xì)胞所不能辦到的。隨著臍帶血的存貯和利用率的不斷提高，獲取NCCs變得更加便捷、高效。目前，利用NCCs進(jìn)行修補(bǔ)雖然只停留在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，但缺損修復(fù)取得了重大的成果。隨著科研人員對(duì)NCCs不斷深入研究，脊椎動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的不斷改進(jìn)和完善，NCCs將會(huì)為未來臨床顱骨缺損修復(fù)帶來新的高效治療途徑。

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