【摘要】 目的 對早期復(fù)發(fā)和假性進(jìn)展膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的癌癥免疫差異基因進(jìn)行研究分析并預(yù)測活性化合物。方法 在高通量基因表達(dá)（GEO）數(shù)據(jù)庫中選擇GSE231994數(shù)據(jù)集作為主要分析對象，篩選二次手術(shù)后早期復(fù)發(fā)和假性進(jìn)展病例樣本之間的免疫相關(guān)差異基因，進(jìn)行基因本體論（GO）生物過程（BP）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，獲得樞紐基因。應(yīng)用TCMSP計(jì)算系統(tǒng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室平臺數(shù)據(jù)庫預(yù)測可能有效的活性化合物，并在CB-Dock2服務(wù)器進(jìn)行分子對接實(shí)驗(yàn)。結(jié)果GSE231994數(shù)據(jù)集篩選得到140差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因50個(gè)，下調(diào)基因90個(gè)，其中核心基因有IL1B、IL10、CXCL8、EGFR、TLR2、CD68、CXCR4、ITGB2、CD163和CSF1R，主要參與炎癥反應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫反應(yīng)生物過程，以及富集于癌癥途徑、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和PI3K/Akt信號通路。根據(jù)度值選取前三個(gè)基因，通過TCMSP平臺預(yù)測得到槲皮素可能為有效化合物。對接結(jié)果顯示槲皮素與IL1B具有更好的結(jié)合能力。結(jié)論 通過生物信息手段分析揭示免疫表達(dá)基因IL1B、IL10和CXCL8與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤早期復(fù)發(fā)和假性進(jìn)展有著密切的關(guān)系，而槲皮素可作為干預(yù)的有效活性化合物。

【關(guān)鍵詞】 早期復(fù)發(fā)；假性進(jìn)展；膠質(zhì)母細(xì)胞瘤；生物信息學(xué)；差異基因

【中圖分類號】 R739.41" 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A" 【文章編號】 1672-7770（2025）01-0039-08

Analysis of cancer-immune differentially expressed genes and prediction of active compounds in progression and pseudo-progression of glioblastoma

Abstract： Objective To study and analyze cancer-immune differentially expressed genes in progression and pseudo-progression glioblastoma， and predict active compounds. Methods The GSE231994 dataset was selected as the main analysis dataset in the Gene Expression Omnibus（GEO） database， and immune related differentially expressed genes were screened between samples of progression and pseudo-progression cases after secondary surgery. Biological Process（BP） of Gene Ontology（GO）， and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） analyses were performed to construct a protein-protein interaction（PPI） network and obtain hub genes. The TCMSP platform was applied to predict potentially active compounds， and molecular docking was accomplished on the CB Dock2 server. Results One hundred and forty differentially expressed genes were screened from the GSE231994 dataset， including 50 up-regulated genes and 90 down-regulated genes. The core genes included IL1B， IL10， CXCL8， EGFR， TLR， CD68， CXCR4， ITGB， CD16， and CSF1R， which mainly participated in inflammatory response， signal transduction， and immune response biological processes， as well as were enriched in the cancer pathway， cytokine-cytokine receptor interaction， and PI3K/Akt signaling pathways. The top three genes based on degree values were selected to predict， and quercetin may be an bio-active compound. The molecular docking results showed that quercetin had better binding ability with"IL1B. Conclusions It is revealed that immune expression genes IL1B， IL10， and CXCL8 are closely related to progression and pseudo-progression of glioblastoma， and quercetin can serve as an effective active compound for intervention via bioinformatics analysis.

Key words： progression; pseudo-progression; glioblastoma; bioinformatic; differentially expressed gene

膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)腫瘤之一，其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）是最為常見的惡性腦膠質(zhì)瘤類型，預(yù)后極差，綜合治療后中位生存期也只有12～15個(gè)月［1］。GBM最常見的治療方法是手術(shù)治療，但手術(shù)切除后很容易復(fù)發(fā)。因此尋找膠質(zhì)母細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)的差異表達(dá)基因，并早期使用藥物干預(yù)具有重要意義。隨著基因測序技術(shù)的快速發(fā)展，各種疾病相關(guān)基因數(shù)據(jù)庫也快速崛起。近來利用基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫和生物信息分析技術(shù)挖掘疾病差異表達(dá)基因，尋找新的靶標(biāo)［2］，預(yù)測活性化合物并進(jìn)行驗(yàn)證，成為新藥篩選的新策略。本研究擬通過基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）篩選出早期復(fù)發(fā)和假性進(jìn)展膠質(zhì)母細(xì)胞瘤癌癥免疫相關(guān)的差異表達(dá)基因，通過分析獲得核心靶基因，并應(yīng)用數(shù)據(jù)庫預(yù)測相關(guān)的活性化合物，為尋找抗復(fù)發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的活性化合物提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料來源 從GEO數(shù)據(jù)庫中選擇GSE231994基因數(shù)據(jù)集，物種類別為“Human”，該數(shù)據(jù)集包含48例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本，其中27例進(jìn)展并復(fù)發(fā)，21例假性進(jìn)展。這些樣本均在患者二次腦切除手術(shù)時(shí)獲取。

1.2 差異表達(dá)基因的篩選 應(yīng)用GEO2R程序，設(shè)置|log2（FC）|gt;0.5及Plt;0.05獲得差異表達(dá)基因。

1.3 差異表達(dá)基因的功能富集分析 將差異基因輸入DAVID數(shù)據(jù)庫［3］，進(jìn)行基因本體論（Gene Ontology，GO）生物過程和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析，揭示這些基因參與的生物過程和潛在的信號通路。

1.4 蛋白互聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析 將差異基因輸入到STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白互聯(lián)分析，并應(yīng)用Cytoscape .10.0軟件［4］按度值（Degree）篩選出樞紐基因。

1.5 活性化合物的篩選 針對篩選出的核心靶點(diǎn)，通過TCMSP計(jì)算系統(tǒng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室平臺［5］篩選相關(guān)化合物。設(shè)置關(guān)鍵參數(shù)，如口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、藥物相似性（drug-likeness，DL）≥0.18和血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）≥-0.30［6］，最終篩選得到目標(biāo)化合物。

1.6 目標(biāo)化合物與核心靶點(diǎn)的分子對接實(shí)驗(yàn) 篩選得到的目標(biāo)化合物與核心靶點(diǎn)應(yīng)用CB-Dock2服務(wù)器進(jìn)行在線對接，驗(yàn)證目標(biāo)化合物與靶點(diǎn)的結(jié)合能力［7，8］。

2 結(jié) 果

2.1 差異表達(dá)基因篩選結(jié)果 選取GSE231994數(shù)據(jù)集為分析對象，以|log2（FC）|gt;0.5及Plt;0.05篩選出差異表達(dá)基因共140個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)基因50個(gè)，表達(dá)下調(diào)基因90個(gè)。差異表達(dá)基因火山圖見圖1。

2.2 差異基因的GO生物過程和KEGG通路分析結(jié)果 差異表達(dá)基因輸入注釋、可視化和綜合發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫（the Database for Annotation， Visualization and Integrated Discovery，DAVID），獲得差異基因生物過程和通路富集分析見圖2。GO生物過程主要包括炎癥反應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫反應(yīng)等。KEGG通路分析結(jié)果顯示，目標(biāo)基因主要參與癌癥的發(fā)病途徑、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和PI3K/Akt信號通路等過程。

2.3 差異表達(dá)基因的蛋白互聯(lián)分析 采用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，見圖3。通過Cytoscape .10.0軟件按度值篩選出前10位樞紐基因?yàn)榘准?xì)胞介素-1β（interleukin 1 beta，IL1B）、IL10、CXCL8、EGFR、TLR2、CD68、CXCR4、ITGB2、CD163和CSF1R（表1），其中核心基因IL1B、IL10、CXCL8在GBM患者樣本中均為下調(diào)基因。

2.4 活性化合物的篩選結(jié)果 通過TCMSP計(jì)算系統(tǒng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室平臺，針對IL1B靶點(diǎn)共有23個(gè)化合物，IL10靶點(diǎn)共有14個(gè)化合物，CXCL8靶點(diǎn)共有18個(gè)化合物，應(yīng)用Venny軟件交集獲得它們共有的3個(gè)化合物，分別是白藜蘆醇、尼古丁和槲皮素，其化合物參數(shù)見表2，設(shè)置OB≥30%、DL≥0.18和BBB≥-0.30參數(shù)，最終獲得槲皮素為最可能的活性化合物。

2.5 槲皮素與核心靶點(diǎn)的分子對接驗(yàn)證 選取度值排序前三的基因?yàn)镮L1B（PDB ID：4DEP）、IL10（PDB ID：6X93）和CXCL8（PDB ID：6WZM），從PDB網(wǎng)站上下載蛋白分子，并應(yīng)用PyMOL .4.1軟件刪除溶劑和殘基配體，加氫離子并進(jìn)行電荷平衡，然后作為對接的蛋白分子，槲皮素作為對接配體，在CB-Dock2服務(wù)器上在線對接，對接結(jié)果見表3、圖4?！癡ina score”表示的是用Vina程序以相應(yīng)的口袋參數(shù)對受體和配體進(jìn)行分子對接所得到復(fù)合物的得分，這個(gè)值越低代表受體和配體親和力越高；“Cavity volume”表示每個(gè)空腔的大小。“Center”是對接口袋的中心坐標(biāo)，“Docking size”是對接口袋在x、y和z軸方向的大小。在三個(gè)蛋白中，槲皮素與IL1B結(jié)合能力最強(qiáng)。

2.6 槲皮素治療膠質(zhì)瘤體外和體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)研究有研究發(fā)現(xiàn)，蘆丁及其苷元槲皮素通過下調(diào)IL10蛋白等表達(dá)水平來抑制大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移［9］，見圖5。此外，利用蘆丁及其苷元槲皮素處理的C6鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞，IL1B的mRNA表達(dá)明顯增加，在C6細(xì)胞、U251和TG1人膠質(zhì)瘤細(xì)胞中IL10含量明顯降低（圖6）。大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了槲皮素可促進(jìn)IL1B表達(dá)，降低IL10的水平來誘導(dǎo)產(chǎn)生對膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長不利的腫瘤炎癥微環(huán)境，見圖7。

3 討 論

GBM是成人顱內(nèi)腫瘤中病死率最高的，目前治療主要采取以手術(shù)為主，結(jié)合放化療等的綜合治療方式。部分患者術(shù)后12周內(nèi)復(fù)查顱腦磁共振時(shí)發(fā)現(xiàn)影像學(xué)有早期進(jìn)展，然而其性質(zhì)可能為早期復(fù)發(fā)，亦可能為假性進(jìn)展，兩者在治療方案和預(yù)后方面存在顯著差異［10］。目前臨床還是主要采用影像組學(xué)加以鑒別診斷，但仍存在一定的誤診率。本研究從術(shù)后早期復(fù)發(fā)和假性進(jìn)展GBM患者樣本中尋找癌癥免疫表達(dá)差異基因，以期發(fā)現(xiàn)特定靶基因。GEO數(shù)據(jù)庫是由美國國立生物技術(shù)信息中心（The National Center for Biotechnology Information，NCBI）創(chuàng)建和維護(hù)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫，涵蓋了腫瘤、非腫瘤、芯片等多個(gè)領(lǐng)域，是目前最大、最全面的公共基因表達(dá)數(shù)據(jù)資源［11］。應(yīng)用GSE231994基因數(shù)據(jù)集發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要為IL1B、IL10、CXCL8、EGFR、TLR2、CD68、CXCR4、ITGB2、CD163和CSF1R等。

IL1B是一種強(qiáng)效促炎細(xì)胞因子，主要由淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及單核細(xì)胞響應(yīng)微生物誘導(dǎo)而產(chǎn)生。

Gao等［12］通過細(xì)胞系、患者血清和腦組織的實(shí)驗(yàn)研究，確定IL1B可為GBM潛在的血漿標(biāo)志物。IL10是人體中主要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，在調(diào)節(jié)GBM中浸潤免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的活性方面發(fā)揮主要作用［13］。從機(jī)制上講，IL10與其包含IL10RA和IL10RB的異四聚體受體結(jié)合，導(dǎo)致JAK1和STAT2介導(dǎo)的STAT3磷酸化。反過來，STAT3易位到細(xì)胞核，從而驅(qū)動抗炎介質(zhì)的表達(dá)，抑制JAK/STAT通路可將促炎和抗炎細(xì)胞因子的平衡轉(zhuǎn)移到促炎環(huán)境中［14］。在GBM中觀察到IL10表達(dá)增加，這與基質(zhì)中高水平的人類白細(xì)胞抗原Ⅱ（human leukocyte antigen Ⅱ，HLA-Ⅱ）和淋巴細(xì)胞活化基因3（lymphocyte activation gene 3，LAG-3）（+）T細(xì)胞浸潤有關(guān)［15］。基于RNA-seq的星形膠質(zhì)細(xì)胞基因表達(dá)分析揭示了由小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞在腫瘤環(huán)境中抗炎細(xì)胞因子IL10的大量釋放為腫瘤免疫逃逸提供了重要驅(qū)動力［16］。白細(xì)胞介素-8（CXCL8，IL-8）是一種趨化因子，招募中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和T細(xì)胞，但不招募單核細(xì)胞，還參與中性粒細(xì)胞的活化。CXCL8由間充質(zhì)GBM干細(xì)胞優(yōu)先表達(dá)和分泌，激活PI3K/Akt和NF-κB信號傳導(dǎo)，并通過CXCR2-JAK2/STAT3軸在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)信號傳導(dǎo)，通過旁分泌、細(xì)胞外源性途徑支持M2樣腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表型［17］。

應(yīng)用TCMSP平臺預(yù)測獲得可能的活性化合物是槲皮素。槲皮素（5，7，3′，4′-五羥基黃酮）是自然界常見的黃酮類化合物之一，具有廣泛的生物活性，其能夠緩解炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕組織水腫，緩解臟器損傷等。已有研究表明，槲皮素可以抑制多種癌癥的生長，包括胃癌、膠質(zhì)瘤、卵巢癌等［9］。槲皮素的抗GBM活性主要通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR、白細(xì)胞介素6信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子三種信號通路、熱休克蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH以及血管內(nèi)皮生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2/-9和纖連蛋白調(diào)控等［18］。還有研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可能通過雙重抑制Wnt3a/β-兒茶素和Akt/NF-κB信號通路，影響關(guān)鍵DNA修復(fù)酶MGMT的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡［19］。Da Silva等人體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)研究也證明了槲皮素可促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的生成（IL1B等），降低抗炎細(xì)胞因子（IL10等），從而誘導(dǎo)產(chǎn)生對膠質(zhì)瘤生長不利的免疫微環(huán)境，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移。

本研究的局限是GEO獲取的樣本數(shù)量有限，樣本又存在個(gè)人差異，影響生物信息分析獲得差異表達(dá)基因的準(zhǔn)確性，TCMSP預(yù)測得到的可能活性化合物槲皮素還需要進(jìn)一步細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上，本研究通過生物信息手段分析揭示免疫表達(dá)基因IL1B、IL10和CXCL8與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤早期復(fù)發(fā)和假性進(jìn)展有著密切的關(guān)系，成功預(yù)測獲得槲皮素可作為干預(yù)的有效活性化合物。

［參 "考 ""文 ""獻(xiàn)］

［1］ Phillips MCL，Thotathil Z，Dass PH，et al.Ketogenic metabolic therapy in conjunction with standard treatment for glioblastoma：a case report［J］.Oncol Lett，2024，27（5）：230.

［2］ Xia ZY，Gao P，Chen Y，et al.Analysis of the key prognostic genes and potential traditional Chinese medicine therapeutic targets in glioblastoma based on bioinformatics and network pharmacology methods［J］. Transl Cancer Res，20，11（5）：13861405.

［3］ Sherman BT，Hao M，Qiu J，et al.DAVID a web server for functional enrichment analysis and functional annotation of gene lists（2021 update）［J］.Nucleic Acids Res，20，50（W1）：W216W221.

［4］ Shannon P，Markiel A，Ozier O，et al.Cytoscape： a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks［J］.Genome Res，200，13（11）：24982504.

［5］ Ru JL，Li P，Wang JN，et al.TCMSP：a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines［J］.J Cheminform，2014，6：1.

［6］ Li TP，Xiao Y，Wang Z，et al.The mechanism study of common flavonoids on antiglioma based on network pharmacology and molecular docking［J］.Evid Based Complement Alternat Med，20，2022：21987.

［7］ Liu Y，Yang XC，Gan JH，et al.CB-Dock2：improved protein-ligand blind docking by integrating cavity detection，docking and homologous template fitting［J］.Nucleic Acids Res，20，50（W1）：W159W164.

［8］ Yang XC，Liu Y，Gan JH，et al.FitDock：protein-ligand docking by template fitting［J］.Brief Bioinform，20，23（3）：bbac087.

［9］ da Silva AB，Cerqueira Coelho PL，das Neves Oliveira M，et al.The flavonoid rutin and its aglycone quercetin modulate the microglia inflammatory profile improving antiglioma activity［J］.Brain Behav Immun，2020，85：170185.

［10］Ismail M，Hill V，Statsevych V，et al.Can tumor location on pre-treatment MRI predict likelihood of pseudo-progression vs.tumor recurrence in glioblastoma？ -a feasibility study［J］.Front Comput Neurosci，2020，14：563439.

［11］Clough E，Barrett T，Wilhite SE，et al.NCBI GEO archive for gene expression and epigenomics data sets：23-year update［J］.Nucleic Acids Res，2024，52（D1）：D138D144.

［12］Gao YX，Zhang EL，Liu B，et al.Integrated analysis identified core signal pathways and hypoxic characteristics of human glioblastoma［J］.J Cell Mol Med，2019，23（9）：62286237.

［13］Widodo SS，Dinevska M，F(xiàn)urst LM，et al.IL-10 in glioma［J］.Br J Cancer，2021，125（11）：14661476.

［14］Henrik Heiland D，Ravi VM，Behringer SP，et al.Tumor-associated reactive astrocytes aid the evolution of immunosuppressive environment in glioblastoma［J］.Nat Commun，2019，10（1）：2541.

［15］Guo WL，Peng DJ，Liao YE，et al.Upregulation of HLA-II related to LAG-3+CD4+ T cell infiltration is associated with patient outcome in human glioblastoma［J］.Cancer Sci，2024，115（5）：13881404.

［16］Ravi VM，Neidert N，Will P，et al.T-cell dysfunction in the glioblastoma microenvironment is mediated by myeloid cells releasing interleukin-10［J］.Nat Commun，20，13（1）：925.

［17］Yuan W，Zhang Q，Gu DL，et al.Dual role of CXCL8 in maintaining the mesenchymal state of glioblastoma stem cells and M2-like tumor-associated macrophages［J］.Clin Cancer Res，20，29（18）：3779379.

［18］Tavana E，Mollazadeh H，Mohtashami E，et al.Quercetin：a promising phytochemical for the treatment of glioblastoma multiforme［J］.Biofactors，2020，46（3）：356366.

［19］Wang WY，Yuan XP，Mu JS，et al.Quercetin induces MGMT+ glioblastoma cells apoptosis via dual inhibition of Wnt3a/β-Catenin and Akt/NF-κB signaling pathways［J］.Phytomedicine，20，118：1549.