Effects of Cldn14 gene knockout on the formation of calcium oxalate stones in rats and its mechanism

LUO Peiyue^1，2，ZHENG Liying¹，CHEN Tao^1，2，ZOU Jun^1，2，LI Wei^1，2，CHEN Qi^1，2，CHENG Le^1，2，GAN Lifeng^1，2，ZHANG Fangtao^1，2，QIAN Biao^1，2

（1.Department of Urology，The First Affiliated Hospital of Gannan Medical University，Ganzhou 341000; 2.Key Laboratory of Urology and Andrology of Ganzhou，Ganzhou 341000，China）

ABSTRACT：Objective To explore the effects of Cldn14 gene knockout on renal metabolism and stone formation in rats，so as to provide reference for research in the field of urinary calium metabolism and stone formation.Methods Cldn14 gene knockout homozygous rats and wild-type rats of the same age were randomly divided into 4 groups：wild-type control （WC） group，wild-type ethylene glycol （WE） group，gene knockout control （KC） group and gene knockout ethylene glycol （KE） group，with 10 rats in each group.The WE and KE groups were induced with ethylene glycol + ammonium chloride to form kidney stones，while the WC and KC groups received normal saline gavage.After 4 weeks of standard maintenance feeding，the urine samples were collected to detect the venous blood.The kidneys were collected for HE，Pizzolattos staining and transmission electron microscopy.The protein in renal tissues was extracted to detect the expressions of Claudin16 and Claudin19.Results Crystal deposition was observed in the renal tubular lumen of the WE and the KE groups，and more crystals were detected in the KE group.The WE group had a large number of intracytoplasmic black crystalline inclusions observed in renal tubular epithelial cells under transmission electron microscope，followed by the KE and KC groups.Compared with WC and WE groups，KC and KE groups had significantly decreased serum calcium and magnesium levels but significantly increased urinary calcium level.In addition，the urinary calcium level was higher in the WE group than in the WC group and higher in the KE group than in the KC group.The KE group had lower level of Claudin16，but there was no significant difference in the level of Claudin19 among the 4 groups（P＞0.05）.Conclusion Knockout of Cldn14 gene alone cannot effectively reduce urinary calcium excretion or reduce the risk of stone formation in rats，which may be related to the decrease of Claudin16 level.

KEY WORDS：urinary calium metabolism；molecular biology；Cldn14 gene; kidney stones; tight junction protein; ethylene glycol

摘要：目的 探究緊密連接蛋白14（Cldn14）基因敲除對大鼠腎臟代謝及結(jié)石誘導(dǎo)形成的影響及其機(jī)制，為尿鈣代謝及結(jié)石領(lǐng)域研究提供參考。方法 將野生型大鼠與同周齡Cldn14基因敲除的純合子大鼠分別隨機(jī)分為野生型對照（WC）組、野生型乙二醇（WE）組、基因敲除對照（KC）組及基因敲除乙二醇（KE）組，每組10只。其中WE、KE組采用乙二醇+氯化銨方式誘導(dǎo)腎結(jié)石形成，WC和KC 組采用生理鹽水灌胃。標(biāo)準(zhǔn)維持飼料喂養(yǎng)4周后收集大鼠尿液，并進(jìn)行靜脈血檢測，同時收集大鼠腎臟行HE、鈣鹽染色及透射電鏡觀察并提取腎組織蛋白。采用蛋白質(zhì)印跡法檢測緊密連接蛋白16（Claudin16）及緊密連接蛋白19（Claudin19）的表達(dá)水平。結(jié)果 WE組與KE組腎小管腔內(nèi)均可見晶體沉積，且KE組晶體多于WE組；相比于KC組，KE組在透射電鏡下的腎小管上皮細(xì)胞中可見大量胞質(zhì)內(nèi)黑色結(jié)晶性包涵體，而WE組包涵體數(shù)量顯著多于KE組。相比于WC和WE組，KC和KE組大鼠的血鈣及血鎂水平顯著降低而尿鈣水平則明顯升高。此外，WE組相對于WC組、KE組相對于KC組尿鈣水平進(jìn)一步上升。KE組大鼠腎臟組織Claudin16水平顯著降低，然而四組大鼠腎臟組織Claudin19水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 單純敲除Cldn14基因并不能有效減少大鼠尿鈣排泄及降低結(jié)石形成的風(fēng)險，這可能與Claudin16水平降低有關(guān)。

關(guān)鍵詞：尿鈣代謝；分子生物學(xué)；Cldn14基因；腎結(jié)石；緊密連接蛋白；乙二醇

中圖分類號：R691.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2025.02.015

鈣性結(jié)石是臨床最常見的腎結(jié)石類型^［1］。盡管病因復(fù)雜，但已有充分的證據(jù)表明，高鈣尿癥是引起腎結(jié)石的主要危險因素^［2］。尿鈣水平對結(jié)石形成有著重要的影響，研究表明，超過60%的鈣離子通過由緊密連接家族蛋白（Claudins）組成的細(xì)胞旁途徑通道被重吸收，因此Claudin蛋白可能成為結(jié)石防治的潛在靶點^［3］。近年來多項基因關(guān)聯(lián)性研究發(fā)現(xiàn)，緊密連接蛋白14（Cldn14）基因突變與人類遺傳性高鈣尿癥及鈣性結(jié)石形成有著密切的聯(lián)系^［4-5］。此外，通過動態(tài)檢測腎臟組織Claudin 14水平發(fā)現(xiàn)，在乙二醇及納米細(xì)菌誘導(dǎo)大鼠腎結(jié)石形成的過程中，Claudin14水平顯著升高^［6-8］。上述結(jié)果均表明Claudin14在尿鈣排泄及結(jié)石形成過程中具有重要作用，但Claudin14在調(diào)節(jié)尿鈣代謝及結(jié)石形成中的具體作用機(jī)制暫未闡明。本研究通過構(gòu)建Cldn14基因敲除大鼠并誘導(dǎo)腎結(jié)石形成，同時檢測血、尿生化及腎臟結(jié)晶形成及損傷變化，擬進(jìn)一步明確Claudin14在大鼠腎臟代謝及結(jié)石誘導(dǎo)形成中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 野生型雄性Wistar大鼠購于長沙天勤生物技術(shù)有限公司［許可證號：SCXK（湘）2014-0010；合格證編號：No.202230760］，Cldn14基因敲除雜合子大鼠購自蘇州賽業(yè)生物科技有限公司［許可證號：SCXK（粵）2020-0055；合格證編號：No.44826100001973］，飼養(yǎng)條件為恒溫、恒濕，大鼠自由飲食、飲水。本研究經(jīng)贛南醫(yī)科大學(xué)倫理委員會審核：［2016］院倫審動實字（001）號（NO）A2016-001，所有動物操作均遵守動物實驗倫理準(zhǔn)則。

1.1.2 主要實驗儀器及試劑 標(biāo)準(zhǔn)飼料、墊料（贛南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心），DNA提取試劑盒、瓊脂糖（北京全式金），50×TAE緩沖液（中國百凱美），乙二醇、氯化銨（美國Sigma），戊巴比妥鈉（德國Merck），HE染色試劑盒、戊二醛（北京索萊寶），緊密連接蛋白16（Claudin 16）、緊密連接蛋白19（Claudin 19）多克隆抗體（美國賽默飛），β-actin多克隆抗體（中國Proteintech），超敏ECL發(fā)光液（武漢Elabscience），全自動生化分析儀（瑞士羅氏），全自動脫水機(jī)、病理切片機(jī)（美國賽默飛），偏光顯微鏡（中國瞬宇），聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀（美國AB），電泳儀（北京六一），凝膠成像系統(tǒng)（德國耶拿）。

1.2 實驗方法

1.2.1 Cldn14基因敲除大鼠的基因型鑒定 耳標(biāo)標(biāo)記待測大鼠，并使用動物打孔器于大鼠耳緣打孔取樣，將取得組織放入無核酶EP管內(nèi)，使用DNA提取試劑盒提取組織DNA，根據(jù)gRNA的作用位點設(shè)計2條前導(dǎo)鏈引物F1、F2及1條后隨鏈引物R1，PCR引物序列見表1。使用F1與R1配置擴(kuò)增體系1，F(xiàn)2與R1配置擴(kuò)增體系2并對提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物加入10 g/L瓊脂糖凝膠，采用直流電150 V電泳50 min后凝膠成像系統(tǒng)對DNA條帶進(jìn)行顯像，根據(jù)不同分子質(zhì)量DNA條帶數(shù)量確定待鑒定大鼠的基因型（野生型、雜合子及純合子分別有2條、3條及1條DNA帶）。

1.2.2 動物分組及草酸鈣結(jié)石模型的建立 選取周齡、體質(zhì)量相匹配的雄性野生型Wistar大鼠及Cldn14基因敲除大鼠各20只，隨機(jī)分為野生型對照（WC）組及野生型乙二醇（WE）組、基因敲除對照（KC）組及基因敲除乙二醇（KE）組，每組10只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，成石組（WE和KE組）自由飲用10 g/L的乙二醇蒸餾水，造模的最后1周使用10 g/L氯化銨溶液1 mL/（kg·d）灌胃，對照組（WC和KC組）自由飲用蒸餾水并于造模最后1周使用生理鹽水1 mL/（kg·d） 灌胃，造模共持續(xù)28 d。

1.2.3 大鼠組織樣本收集及檢測 標(biāo)準(zhǔn)維持飼料喂養(yǎng)4周后，將大鼠置于代謝籠，收集24 h尿液后麻醉，切開腹腔，采集靜脈血3～4 mL，將尿液、血液離心后取上清液置于全自動生化分析儀檢測。原位腎灌注清洗腎臟后取出，將一側(cè)腎臟沿長軸切開，福爾馬林固定24 h后脫水、包埋、切片、脫蠟后行HE及鈣鹽（Pizzolattos法）染色。腎組織切成1 mm³小塊并置于戊二醛溶液固定24 h，脫水、滲透包埋、聚合、切片、染色后通過透射電鏡觀察。另一側(cè)腎臟留取皮髓交界處組織，加入裂解液提取此部分組織蛋白，利用蛋白質(zhì)印跡（Western blotting，WB）檢測Claudin16及Claudin19蛋白的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均使用IBM SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所有統(tǒng)計圖均使用GraphPad Prism軟件繪制。計量資料采用±s表示，正態(tài)性檢驗后若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，對多組間比較采用One-way ANOVA方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗，若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布則采用非參數(shù)檢驗。Plt;0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。2 結(jié) 果

2.1 Cldn14基因敲除大鼠鑒定 經(jīng)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建的Cldn14基因敲除親代雌、雄大鼠均為雜合子，其子代可出現(xiàn)野生型、雜合子及純合子3種表型。因此，需通過基因鑒定篩選出實驗造模所需的Cldn14基因敲除純合子大鼠。如圖1A所示，親代大鼠DNA經(jīng)2種PCR體系擴(kuò)增后產(chǎn)物包含659 bp、720 bp及2698 bp 3條DNA帶，鑒定為雜合子。而選取的3只子代大鼠的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物均僅有1條720 bp帶，為Cldn14基因敲除純合子。進(jìn)一步通過WB檢測野生型大鼠及鑒定為純合子的Cldn14基因敲除大鼠腎臟組織Claudin14蛋白表達(dá)水平，如圖1B所示，野生型大鼠可檢測出清晰的Claudin14蛋白條帶，而鑒定為純合子的大鼠腎臟組織幾乎無Claudin14表達(dá)。通過以上鑒定及篩選方式，我們成功繁育并篩選出20只Cldn14基因敲除純合子大鼠用于后續(xù)實驗。

2.2 各組大鼠腎臟組織病理檢測結(jié)果 HE染色切片觀察，WC組與KC組均未見晶體沉積，腎單位結(jié)構(gòu)清楚，皮質(zhì)、髓質(zhì)分界清晰，兩組大鼠腎臟病理結(jié)構(gòu)無顯著差異。而WE組與KE組大鼠腎小管腔內(nèi)均可見晶體沉積，并伴有不同程度的腎小球萎縮、腎小管上皮細(xì)胞壞死脫落以及炎癥細(xì)胞浸潤，但兩組大鼠腎臟晶體含量及腎臟損傷程度有顯著差異。相比于WE組，KE組管腔內(nèi)晶體數(shù)量進(jìn)一步增多，腎小管擴(kuò)張程度以及腎小管上皮細(xì)胞水腫壞死程度進(jìn)一步增加；鈣鹽染色WC組與KC組均未見陽性染色，而WE組與KE組管腔內(nèi)可見黃褐色草酸鈣晶體，KE組較WE組更為明顯（圖2）；透射電鏡觀察腎小管上皮細(xì)胞，相比于對照組，成石組的大鼠除線粒體明顯水腫外，胞質(zhì)內(nèi)還可見大量黑色結(jié)晶性包涵體，然而與管腔內(nèi)晶體不同的是，WE組包涵體數(shù)量顯著多于KE組（圖3）。

2.3 大鼠血、尿生化檢測分析 檢測4組大鼠血液及尿液鈣、鎂、磷水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在給予正常鈣水平飼養(yǎng)4周后，相比于WC和WE組，KC和KE組大鼠的血鈣及血鎂水平顯著降低，尿鈣水平明顯升高（P均lt;0.01）。此外，WE組相對于WC組尿鈣水平進(jìn)一步升高，KE組相對于KC組尿鈣水平也顯著上升（Plt;0.01），而血鈣水平WC與WE、KC與KE相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05，表2）。

2.4 各組大鼠腎臟組織Claudin16及Claudin19表達(dá)水平 采用WB檢測Claudin16及Claudin19的表達(dá)水平，結(jié)果顯示相比于WC組，KC組大鼠腎臟組織Claudin16水平顯著降低而Claudin19水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。WE組較WC組、KE組較KC組的Claudin16水平均有所降低（Plt;0.01），然而Claudin19表達(dá)水平在對照組與成石組間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05，圖4）。

3 討 論

Claudin家族作為緊密連接過程重要的參與者在調(diào)節(jié)離子細(xì)胞旁途徑通透性中起到關(guān)鍵作用^［9］。特定種類及數(shù)量的Claudins賦予了腎小管不同節(jié)段對離子的通透效果^［10］。研究不同Claudins的功能作用的一個有效的方法是構(gòu)建一個相應(yīng)的Cldn基因敲除動物模型，ELKOUBY-NAOR等^［11］構(gòu)建了Cldn11/14雙基因敲除小鼠，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組大鼠血漿鈣離子、鎂離子及肌酐水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，盡管基因敲除小鼠的尿鎂與尿鈣的排泄量較高，但與野生型相比，這些變化并無統(tǒng)計學(xué)意義。但GONG等^［12］的研究得出相反的結(jié)果，野生型及單純Cldn14基因敲除小鼠在給予高鈣飲食10周后，尿鈣、尿鎂排泄及血漿鎂相對于野生型顯著降低，而血漿鈣離子濃度則無顯著變化。與上述基因敲除小鼠模型一樣，本研究構(gòu)建的Cldn14基因敲除大鼠可以正常穩(wěn)定繁育，未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的生理變化。通過檢測發(fā)現(xiàn)相對于野生型大鼠，Cldn14基因敲除大鼠在正常鈣飲食4周后血鈣、血鎂水平顯著降低而尿鈣、尿鎂水平顯著增高，提示尿液鈣離子、鎂離子出現(xiàn)過度排泄，而通過使用乙二醇誘導(dǎo)后，與野生型一樣，基因敲除大鼠的尿鈣水平也進(jìn)一步升高，表明尿鈣排泄水平在Claudin14缺失的情況下還可被進(jìn)一步誘導(dǎo)。多項類似的研究卻出現(xiàn)不同的實驗結(jié)果，除了受如降鈣素水平、飲食鈣水平等外在因素影響外，這一結(jié)果也提示尿鈣、尿鎂代謝可能涉及更為復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，即Claudin14可能與其他分子相互作用共同參與尿鈣、尿鎂代謝。

近年來，Claudin14因其在鈣離子代謝中的關(guān)鍵作用不斷在泌尿系結(jié)石領(lǐng)域被廣泛研究。早在2009年，一項全基因組關(guān)聯(lián)性研究證實了Cldn14基因突變與腎結(jié)石形成有著密切的聯(lián)系^［4］，印度的一項基因調(diào)查研究中也證實了同樣的結(jié)果^［13］。此外，多項研究表明在乙二醇及納米細(xì)菌誘導(dǎo)的腎結(jié)石形成過程中，Claudin14的水平顯著升高^［6-8］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Claudin14水平的升高會導(dǎo)致腎小管對鈣離子的重吸收受到抑制，從而導(dǎo)致尿液中鈣離子的排泄增加，增加了腎結(jié)石形成的風(fēng)險^［14-15］。為進(jìn)一步驗證Claudin14在結(jié)石形成中的作用，我們構(gòu)建了Cldn14基因敲除大鼠并使用乙二醇誘導(dǎo)結(jié)石形成。然而結(jié)果與預(yù)期并不一致，乙二醇仍可誘導(dǎo)Cldn14基因敲除大鼠腎結(jié)石形成，結(jié)石形成程度及腎臟損傷程度甚至比野生型更嚴(yán)重。我們認(rèn)為這一結(jié)果并不能否認(rèn)Cldn14基因在誘導(dǎo)結(jié)石形成中的作用，因已經(jīng)有研究證實，Claudin家族蛋白之間存在功能冗余，即尿鈣調(diào)節(jié)并不是由單一分子實現(xiàn)的^［11］。Claudin14作為腎鈣代謝調(diào)節(jié)中的一員，其缺失并不一定能造成腎鈣代謝的功能紊亂，本研究的尿鈣檢測結(jié)果也證實了這一點，即Claudin14蛋白缺失后，尿鈣水平并沒有像預(yù)測的那樣顯著降低而是進(jìn)一步升高，導(dǎo)致血清鈣濃度顯著下降。因此我們進(jìn)一步檢測了與Claudin14關(guān)聯(lián)密切的Claudin16及Claudin19的水平。

研究表明Claudin16及Claudin19主要在腎臟的髓袢升支粗段（ascending thick limb of Henles loop，TAL）表達(dá)，二者以異二聚體的形式形成陽離子通道，以便在此處通過細(xì)胞旁途徑重吸收鈣離子和鎂離子^［5］。GONG等^［12］的研究證實，Claudin 14同樣定位于TAL段，并通過與Claudin16直接作用從而抑制陽離子通道的活性進(jìn)而降低鈣、鎂的重吸收。正常情況下由于miRNA的存在Claudin14低表達(dá)，在受到胞質(zhì)外高鈣離子濃度激活后人源鈣離子敏感受體誘導(dǎo)TAL段Claudin14表達(dá)升高，并通過抑制Claudin16/19離子通道從而促進(jìn)尿鈣、鎂的排泄^［16-17］。我們通過WB檢測了各組大鼠腎臟組織Claudin16及Claudin19的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Claudin14蛋白缺失后Claudin16的水平也顯著降低，而Claudin19的表達(dá)水平則無顯著變化，這一結(jié)果與GONG等^［12］研究的結(jié)論一致，Claudin14是與Claudin16直接作用而并不與Claudin19直接結(jié)合。同時也對這一結(jié)果進(jìn)行了側(cè)面補(bǔ)充，即Claudin14不僅能與Claudin16直接作用影響其異二聚體陽離子通道的通透性，同時還可以直接影響Claudin16的表達(dá)水平從而通過減少陽離子通道的形成抑制尿鈣、鎂的重吸收。因此，尿鈣排泄的進(jìn)一步升高以及結(jié)石形成的進(jìn)一步加重也可能與Claudin16水平的顯著降低密切相關(guān)。

總而言之，本研究證實了單純敲除Cldn14基因并不能有效減少尿鈣排泄并降低結(jié)石形成的風(fēng)險，這可能與Claudin16的水平降低相關(guān)，也可能涉及更為復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。進(jìn)一步探索與Claudin14協(xié)同參與尿鈣代謝及結(jié)石形成的相關(guān)分子可成為后續(xù)研究的新方向。

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（編輯 郭楚君）