1.引言

牛乳所含的營養(yǎng)素全面，營養(yǎng)價值很高且易于消化吸收，是膳食中蛋白質、鈣、等微量元素和維生素的的重要來源之一。生乳是乳制品生產(chǎn)的基礎，而生乳在生產(chǎn)和運輸環(huán)節(jié)面臨著各種人為或非人為安全險因素的干擾。乳制品質量安全事件不斷發(fā)生，如“三聚氰胺毒奶粉事件”、β-內酰胺酶“無抗奶”、“丙二醇牛奶事件”等造成了及其惡劣的影響。這就使得對生牛乳中污染物、殘留物等的分析檢測手段至關重要。因此在企業(yè)的乳品生產(chǎn)過程中，建立檢測方法簡便、檢測速度快、結果可靠、成本低廉的檢測手段以提高其安全性對保證產(chǎn)品質量安全而言至關重要。

膠體金免疫層析技術（colloidal gold immunochromatography assay，GICA）是基于抗原抗體特異性結合，借助膠體金進行信號放大，實現(xiàn)可視化檢測的一種快速固相膜免疫分析技術。操作簡單、靈敏度高、方便攜帶、檢測范圍廣，適合政府監(jiān)管檢驗人員用于大批量的食品檢測和廣泛普查，同時也適用于食品機構或企業(yè)的現(xiàn)場快速檢測。

2.膠體金免疫層析技術

膠體金免疫層析技術的原理是氯金酸（HAuCl4）在還原劑檸檬酸三鈉作用下，被還原成為一定大小的膠體金顆粒，金顆粒通過在水中的靜電排斥力而達到穩(wěn)定的膠體狀態(tài)。膠體金在特定環(huán)境下帶負電荷，與蛋白質分子的正電荷基團通過靜電吸附作用牢固穩(wěn)定的結合，由于這種結合是靜電結合，所以可以使抗體這類蛋白質依然保持生物特性。膠體金顆粒電子密度高，當粒子聚集超過某一密度閾值時，膠體金就會變色為紅色，可以用肉眼觀察到。

3.生乳中的安全風險及膠體金免疫層析技術的應用

生乳是指從符合國家有關要求的健康奶畜乳房中擠出的無任何成分改變的常乳。產(chǎn)犢后七天的初乳、使用抗生素期間和休藥期間的乳汁以及變質乳不應作為生乳用于出售或一切食品生產(chǎn)活動。生乳中的化學危害物包括真菌毒素、微生物、重金屬、獸藥農(nóng)藥殘留、添加劑等。生乳檢測環(huán)節(jié)強調操作簡單，檢測時間短，檢測結果準確，膠體金免疫層析技術完全符合這些檢測要求，現(xiàn)階段膠體金免疫層析技術對于生乳的檢測研究多集中于尋求更加準確的檢測結果，更簡單的樣品處理方式，更短的檢測時間以及建立可同時檢測多種化學物質的試紙條。

3.1 真菌毒素

真菌毒素是產(chǎn)毒真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，是一類對動植物有毒有害并可廣泛污染農(nóng)副產(chǎn)品及乳制品的物質。生乳中殘留的真菌毒素主要包括黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮等化學危害物不同種類的鐮刀菌毒素。其中，毒性最高的黃曲霉毒素M1是黃曲霉毒素B1在牛乳中的羥基代謝物，其主要來源是被污染動物飼料，也是乳制品中污染率最高的真菌毒素，嚴重影響乳制品的食品安全質量，對人體具有強致癌、致畸、致突變性，可對人體造成一系列不可逆轉的危害。

我國GB/T2761-2017《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》中要求規(guī)定牛乳中黃曲霉毒素M1含量不得超過0.5μg/kg。膠體金免疫層析技術作為檢測生乳中殘留的AFM1的方法已經(jīng)有較為成熟的研究。李婕等通過將膠體金免疫層析法與ELISA檢測試劑盒法對比檢測發(fā)現(xiàn)兩者的檢測結果能夠相互對應，檢測結果準確性高，通過設置不同濃度梯度的黃曲霉毒素M1驗證也發(fā)現(xiàn)結果存在一定的梯度效應，且在濃度為0.2μg/kg時開始呈現(xiàn)陽性，遠低于國家標準，具有較好的定性初篩價值。吳文曄等應用膠體金免疫層析技術制備了能同時檢測黃曲霉毒素B和赭曲霉毒素A兩種真菌毒素的膠體金快速檢測卡，兩者之間沒有干擾性，靈敏度均可達到2.5μg/L，重復性、穩(wěn)定性均良好。

3.2 農(nóng)藥殘留

農(nóng)藥具有防止農(nóng)作物受到病蟲害，提高農(nóng)作物產(chǎn)量的作用，農(nóng)藥可長期存在于環(huán)境中，并會在動物和人類體內積累，形成安全風險，因此，農(nóng)藥殘留、富集是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中不可避免的。生乳中的農(nóng)藥殘留主要與牛食用被污染的飼料有關，即食物鏈與生物富集效應殘留。農(nóng)藥的種類包括有機磷、氯類、氨基甲酸酯類、擬除蟲聚酯類等。膠體金免疫層析技術在食品檢測領域的應用較為廣泛，特別是在農(nóng)藥殘留快速檢測技術中的運用，已成為提高食品安全檢測效率和準確性的重要手段。李洋洋等通過制備有機磷農(nóng)藥的通用結構人工抗原，解決了有機磷農(nóng)藥小分子抗體制備的難題，最終通過優(yōu)化制作出特異性及準確性良好的試紙條，反應時間在5-10min，樣本檢測限為200ng/mL。

3.3 獸藥殘留

獸藥的種類主要包括抗菌素類、抗寄生蟲類、激素類藥物，前兩類藥物多以抗生素為主主要針對動物的病癥及預防，后者則為了提高動物繁殖和生產(chǎn)性能，長期食用含有動物激素殘留的食物，會導致人體內的激素水平失衡，尤其對正在發(fā)育中的孩子來說容易造成肥胖和性早熟等問題，更有可能引發(fā)癌癥。在產(chǎn)奶牲畜用藥后一段時間內，生鮮乳中會出現(xiàn)抗生素及其代謝物的殘留，如果在藥物使用后沒有一段足夠的休藥期或濫用、違規(guī)使用獸藥，其產(chǎn)出的生鮮乳中就會存在抗生素殘留?？股貧埩舻奈：π灾饕憩F(xiàn)在以下方面：長期食用可能會出現(xiàn)超敏反應，短時間內甚至會導致呼吸困難等癥狀，嚴重者甚至休克；人體長期服用會造成或增強耐藥性，導致藥物的有效性降低。

生乳中抗生素檢測是最為重要，也是最容易出現(xiàn)安全風險的項目，檢測項目主要包括氨基糖苷類、β-內酰胺類、霉素類、四環(huán)素類、喹諾酮類等，利用膠體金免疫試紙條對生乳中的抗生素進行檢測已成為主要檢測手段。袁曉春建立了一種可同時檢測生乳、純牛奶和奶粉中β-內酰胺類-四環(huán)素類-頭孢氨芐抗生素殘留的多重膠體金免疫層析法，且無需對樣品進行前處理，可在8min內快速定性生乳中20種抗生素殘留。武晉孝等建立可同時檢測牛奶中6種氨基糖苷類藥物殘留的膠體金免疫層析技術，同樣無需對樣品進行前處理，可在10min內同時檢出，經(jīng)過高效液相色譜對比后結果一致。白宇等針對乳制品中易濫用易殘留的激素類藥物雌二醇（E2）應用膠體金免疫層析技術建立快速、敏感、準確的測試試紙條，奶樣品經(jīng)2倍稀釋消除基質干擾直接用于檢測。

3.4 重金屬

生鮮乳中的重金屬殘留主要跟牧場的地址（與市區(qū)、工業(yè)區(qū)的距離）、土壤、飼養(yǎng)方式有關，主要來源于飼料、飲水以及奶畜服用中草藥而引起。其中重金屬殘留主要有鉛、汞、鎘、鉻、砷等。生鮮乳中的重金屬殘留重金屬會在人體中不斷積累，且難以降解和排除體外，長期飲用含有重金屬殘留的乳品，會毒害人體各個臟器、骨髓和免疫系統(tǒng)。

現(xiàn)有研究能通過膠體金免疫層析技術檢測對糧食樣本中重金屬鎘、鉻離子進行快速檢測且能達到較好的靈敏度，而膠體金免疫層析技術對于檢測生鮮乳中的重金屬物質檢測鮮有研究。趙小旭等通過競爭抑制膠體金免疫層析對乳制品中的鉛進行檢測，生鮮乳的檢出限為 25μg/kg，檢測結果與儀器法檢測結果一致，且重復性好。

3.5 致病菌

生鮮乳中營養(yǎng)物質豐富、水分含量高，很容易導致微生物污染，可攜帶多種致病菌，包括金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特菌、沙門氏菌、溶血性鏈球菌、大腸桿菌、黃曲霉菌等數(shù)十種致病菌，其中金黃色葡萄球菌和大腸桿菌是生鮮乳檢測中最常見的兩項微生物指標。除此之外，這些致病菌還會攜帶的耐藥因子，導致細菌產(chǎn)生耐藥性，其代謝產(chǎn)物中含有的毒素同樣也會對人體造成危害引發(fā)食源性疾病。而導致生乳微生物污染和超標的主要因素包括：產(chǎn)乳的奶?；加腥橄傺椎燃膊亩跀D奶的環(huán)節(jié)出現(xiàn)污染；飼養(yǎng)環(huán)境或擠奶過程不符合衛(wèi)生標準；生乳儲存及運輸環(huán)節(jié)沒有保證干凈的低溫環(huán)境。

生乳中致病菌的快速檢測方法研究多以ATP生物熒光快速檢測技術、電阻抗法、流式細胞計數(shù)法等為主，而膠體金免疫層析技術的研究較少，主要問題在于檢測靈敏度和微生物抗原的選擇較為困難。劉洪貴等采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，用膠體金標記鼠抗金黃色葡萄球菌凝集因子A（ClfA）重組蛋白特異性抗體，該方法可以在10min內完成對含金黃色葡萄球菌奶樣的檢測，敏感度為1×104cfu/mL以上，穩(wěn)定性、特異性較好。大腸埃希氏菌O157： H7主要污染的牛肉、牛奶及其制品，王曉芳等采用檸檬酸三鈉還原法制備的膠體金溶液標記大腸桿菌O157：H7抗體（6C1E5），研制出的檢測試紙檢測靈敏度達104CFU/mL，并其他8種菌株無交叉反應，顯示出較強的特異性。膠體金免疫層析技術還應用于布魯氏菌、沙門氏桿菌等其他通常感染生鮮乳的致病菌中，但對于國標規(guī)定生乳中不能檢出的微生物膠體金免疫層析技術目前只能做到定性初篩。

3.6 添加劑

向生鮮乳中加入添加劑的目的主要是為了造成生乳品質高或掩蓋其含有某些違規(guī)物質或微生物超標。而添加的物類有熟乳、食鹽、蔗糖這類僅為了提高生乳品質而對人體健康危害性不大的物質，也包括三聚氰胺、堿類物質、β-內酰胺酶等危害大的物質。添加三聚氰胺會增加生鮮乳的總氮含量， 從而提高檢測時生鮮乳的蛋白質含量以用來通過檢測。而β-內酰胺酶可以分解奶牛因使用β-內酰胺類還未過休藥期取奶而殘留在生鮮乳中的抗生素，造成不存在抗生素殘留的假象。堿類物質的加入可以降低生鮮乳因酸敗而導致的酸度超標，從而掩蓋其已經(jīng)變質的問題。這些添加劑的加入不僅是欺騙消費的行為，更重要的是會對人體造成不同程度的急性或慢性永久損傷。生乳及乳制品中非法添加三聚氰胺一直都是檢測中重點關注的對象，對于三聚氰胺的檢測方法已經(jīng)能實現(xiàn)定性和定量檢測，實現(xiàn)樣品前處理簡單方便，可用于大量樣品的篩選。張立靜采用雙抗夾心法建立了TEM1型β-內酰胺酶的膠體金免疫層析方法，最小檢出限為6U/mL，該試紙條靈敏度、特異性、穩(wěn)定性均良好。

4.展望

生鮮乳從產(chǎn)出到運輸再到檢測整個過程都需要安全、快速地進行，尤其是檢測環(huán)節(jié)至關重要。生乳檢測環(huán)節(jié)通常要求快速、準確，檢測項目多且范圍廣，因此乳品行業(yè)急需能應對各種目標物的快速檢測方法。膠體金免疫層析前處理簡單、快速、簡便等優(yōu)點，將成為快速檢測方法中新型有效的一種初篩手段，能夠從乳制品源頭、生產(chǎn)到流通各個環(huán)節(jié)實現(xiàn)安全檢測，對于乳品加工企業(yè)來講能夠提高產(chǎn)品安全性、節(jié)省人力物力，具有重要的經(jīng)濟價值。對于市場監(jiān)管部門來講能夠準確迅速的對市場上的產(chǎn)品進行篩查，具有重要的社會價值。而目前對于生乳的檢測來說，抗生素、真菌毒素及部分添加劑的檢測已經(jīng)能實現(xiàn)全面使用膠體免疫層析試紙條，但微生物檢測和重金屬檢測仍需要利用平板法和大型儀器，這就使得檢測時間大大延長，檢測所需的儀器和耗材成本也難以降低，這為乳品質量安全和乳品企業(yè)的長期發(fā)展帶來隱患和難題。

因此，快速檢測技術的迅速發(fā)展和膠體金免疫層析檢測項目全面覆蓋，是乳品行業(yè)乃至整個食品行業(yè)亟需解決的問題。同時膠體金免疫層析技術的功能完善，實現(xiàn)更加準確的半定量、定量檢測，也將成為食品安全快速檢測的發(fā)展新趨勢。

第一作者

王琴（1981.03-），女，漢族，新疆克拉瑪依人，碩士，副高級畜牧師；研究方向：液態(tài)奶質量管理和產(chǎn)品開發(fā)。

*通訊作者

任遠慶（1980.06-），男，漢族，新疆克拉瑪依人，碩士，畜牧師。