摘要：目的 探索血清色氨酸與乙肝相關(guān)慢加急性肝衰竭（HBV-ACLF）死亡風(fēng)險之間的相關(guān)性。方法 回顧性納入180例HBVACLF患者，根據(jù)確診后90 d 結(jié)局為患者分為存活組和死亡組；采用高效液相色譜法測定兩組患者外周血中的血清色氨酸含量；比較兩組患者基線血清色氨酸水平的差異；通過單因素及多因素回歸分析基線血清色氨酸水平對于HBV-ACLF患者確診后90 d 病死率的影響；通過受試者曲線下面積探討血清色氨酸對HBV-ACLF 90 d 死亡風(fēng)險的潛在預(yù)測價值。結(jié)果 90 d 隨訪期內(nèi)，53例（29.4%）HBV-ACLF患者因疾病死亡，127例（70.6%）存活。死亡患者的基線色氨酸水平低于存活患者（Plt;0.001）；經(jīng)多因素回歸分析校正混雜因素顯示，色氨酸水平是HBV-ACLF死亡風(fēng)險的獨立預(yù)測因素。HBV-ACLF患者入組時低水平色氨酸（lt;10.14 pg/mL）與高水平色氨酸（≥10.14 pg/mL）相比具有更高的90 d 死亡風(fēng)險（43.3% vs 15.6%，HR：3.157，95% CI：1.713-5.817）；同時合并腎功能不全和低水平色氨酸的90 d死亡風(fēng)險更高（73.3% vs 15.0%，HR：7.558，95% CI：3.369-16.960）；血清色氨酸水平用于預(yù)測HBV-ACLF 患者的90 d 死亡風(fēng)險具有一定潛在價值（ROC=0.771，95% CI：0.699-0.844）。結(jié)論 血清色氨酸與HBV-ACLF預(yù)后密切相關(guān)；低水平的血清色氨酸預(yù)示90 d高死亡風(fēng)險；尤其是同時合并腎功能不全的患者90 d死亡風(fēng)險更高。

關(guān)鍵詞：肝衰竭；預(yù)后；色氨酸；乙型肝炎病毒；腎功能不全

乙肝相關(guān)慢加急性肝衰竭（HBV-ACLF）是乙型肝炎病毒慢性感染基礎(chǔ)上出現(xiàn)的急性嚴(yán)重肝損傷，具有病情進展迅速、短期內(nèi)高病死率的特點［1， 2］；但HBV-ACLF具有潛在可逆性，即渡過急性損傷期后可恢復(fù)至發(fā)病前狀態(tài)［3， 4］。因此，基于HBV-ACLF的轉(zhuǎn)歸差異實現(xiàn)風(fēng)險人群的風(fēng)險管理，能夠合理利用醫(yī)療資源，有效提升醫(yī)療救治水平，一直是該領(lǐng)域的熱點問題。

HBV-ACLF臨床表現(xiàn)為急劇的肝功能失代償，具有全身性炎癥反應(yīng)和器官衰竭等典型特征［5， 6］，由于系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)導(dǎo)致廣泛的蛋白水解已被證實［7， 8］。免疫代謝廣泛參與HBV-ACLF 的發(fā)病機制［9， 10］；嚴(yán)重的代謝紊亂已被證實與慢加急性肝衰竭的免疫炎癥反應(yīng)和免疫抑制特征密切關(guān)聯(lián)［ 11， 12］，尤其是與系統(tǒng)性炎癥相關(guān)的免疫代謝紊亂；因此，發(fā)掘具有潛能的免疫代謝標(biāo)志物可望建立HBV-ACLF臨床轉(zhuǎn)歸的風(fēng)險預(yù)測。已知色氨酸代謝是重要的免疫調(diào)節(jié)因子，參與炎癥反應(yīng)的免疫調(diào)控，與免疫耐受甚至免疫麻痹密切相關(guān)，進而影響疾病進程；已有研究證實色氨酸分解代謝與ACLF的器官功能衰竭和系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)息息相關(guān)［13］。因此，本研究旨在探索血清色氨酸對HBV-ACLF 患者臨床結(jié)局的影響。然而，色氨酸代謝是否關(guān)聯(lián)HBV-ACLF預(yù)后尚不清楚。因此，本研究旨在探索血清色氨酸與HBVACLF臨床轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性，探討色氨酸預(yù)測HBV-ACLF死亡風(fēng)險的潛在價值。

1 資料和方法

1.1 病例來源

本研究屬于2012～2014年多中心開展的國家重大專項（注冊號：ChiCTR-TRC-00000766）的分項研究；所有受試者均來自中國大陸地區(qū)18家臨床醫(yī)療機構(gòu)。本研究納入對象均符合HBV-ACLF診斷標(biāo)準(zhǔn)，非乙肝相關(guān)慢加急性肝衰竭如免疫性、藥物性、酒精性、中毒性、肝癌、寄生蟲或重疊其他嗜肝、非嗜肝病毒感染均被排除；所有病例均有確診后90 d完整隨訪記錄，入院后均接受包括核苷（酸）類似物在內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)科治療方案，失訪或退出試驗或接受肝移植治療者均被排除。本研究已獲得中國人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心倫理委員會（原中國人民解放軍第三〇二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會）批準(zhǔn)（倫理批號：2017006D）。本研究為回顧性研究，已豁免患者知情同意。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

HBV-ACLF 定義為已知或先前未診斷的HBV慢性病毒感染者基礎(chǔ)上出現(xiàn)以急性黃疸加深、 凝血功能障礙為肝衰竭表現(xiàn)的綜合征，且符合國際標(biāo)準(zhǔn)化比值（INR）≥1.5和總膽紅素≥5 mg/dL，伴有腹水和（或）肝性腦病［6］。

1.3 方法

回顧性納入180 例HBV-ACLF 患者，所有患者根據(jù)確診后90 d臨床結(jié)局分為死亡組、存活組；采用靶向氨基酸代謝組學(xué)獲取基線血清氨基酸含量，分析兩組的基線特征，對比基線血清色氨酸的差異，分析血清色氨酸對于90 d死亡的影響，評估血清色氨酸對90 d死亡風(fēng)險的預(yù)測能力。

1.4 血清色氨酸檢測

采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-MS/MS）系統(tǒng)定量血清色氨酸水平（ExionLC? AD UHPLCQTRAP? 6500+，AB SCIEX Corp.）。將樣品（100mg）用液氮重懸，然后0.9 mL水混合，渦旋攪拌，制備10倍稀釋樣品。稀釋50 倍后，取50 μL樣品與200 μL含有混合內(nèi)標(biāo)物的乙腈/甲醇（1∶1）混合，渦旋均質(zhì)。然后將這些樣品在冰上沉淀30 min，再以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min。然后將上清液注入LC-MS/MS系統(tǒng)進行進一步檢測。

采用ACQUITY UPLC BEH Amide 色譜柱（2.1×100 mm，1.7 μm）進行分離，色譜柱溫度保持在50 ℃。流動相流速為0.30 mL/min，包括溶劑A（0.1%甲酸溶于5 mmol/L乙酸銨）或溶劑B（0.1%甲酸溶于乙腈）。溶劑梯度的設(shè)定參數(shù)如下：初始80%B，0.5 min；80%～70%B，2 min；70%～45%B，4 min；45%～80%B，6 min；80% B，9 min；同時，離子噴霧電壓：5500 V，簾氣壓力：35 psi，離子源溫度：550 ℃，離子源氣體壓力：35 psi：同時，離子噴霧電壓：5500 V，簾式氣體壓力：35 psi，離子源溫度：550 ℃，離子源氣體壓力分別為50 psi和60 psi。為評估標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性，標(biāo)準(zhǔn)濃度在橫坐標(biāo)上繪制，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)峰面積比在縱坐標(biāo)上。定量極限由信噪比確定，信噪比將從標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度檢測到的信號與空白矩陣的信號進行比較。通常，10∶1的信噪比指定相應(yīng)的定量極限濃度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

本研究中定量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，定性數(shù)據(jù)以頻數(shù)和百分比表示。采用Mann-Whitney U檢驗對不符合正態(tài)分布的定量資料進行組間比較，t檢驗用于正態(tài)分布的定量資料組間比較；卡方檢驗用于定性資料的組間比較。采用Kaplan-Meier方法繪制生存曲線并比較組間累積死亡率的差異。采用Cox 分析以評估低血清色氨酸水平與腎功能不全之間的相互作用，同時控制潛在的混雜因素；根據(jù)臨床經(jīng)驗和單因素分析納入混雜因素進行校正，評估各因素對90 d死亡率的影響；如果兩個因素之間不存在明顯的相互作用，則該模型可用于獨立估計兩個因素的綜合效應(yīng)。Plt;0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基線特征

本研究患者，平均年齡為44.6±10.6 歲，162 例（90%）為男性；MELD評分、MELD-Na 評分和AARC評分分別為24.2±4.8、25.9±6.8、7.8±1.3；其總膽紅素值為19.7±7.1 mg/dL，INR 值為2.2±0.6。其余基線特征見表1。

90 d 隨訪期內(nèi)，53 例（29.4%）因疾病死亡，127 例（70.6%）存活。28 d、90 d 累積病死率分別為6.7%、29.4%（表1）。死亡組與存活組雖然在性別分布無差異，但是在年齡、部分肝功能指標(biāo)、血小板計數(shù)等方面的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05，表1）。與存活患者相比，死亡患者具有更高比例的肝性腦病、腎功能不全（肝性腦?。篜=0.001；腎功能不全：P=0.003）；其基線的MELD 評分，MELD-Na 評分，和AARC 評分均升高（MELD：P=0.011；MELD-Na：P=0.005；AARC：P=0.001）；此外，死亡患者基線血清色氨酸水平低于存活患者（Plt;0.001，表1）。

2.2 血清色氨酸獨立影響HBV-ACLF患者臨床結(jié)局

經(jīng)不同模型控制混雜因素后，結(jié)果均顯示血清色氨酸獨立影響HBV-ACLF 死亡風(fēng)險，低水平的血清色氨酸預(yù)示HBV-ACLF 90 d 高死亡風(fēng)險；不同模型計算的校正HR 分別為0.853、0.858、0.847 和0.861（表2）。

2.3 血清色氨酸預(yù)測HBV-ACLF患者臨床結(jié)局的潛在價值

血清色氨酸預(yù)測90 d 死亡結(jié)局的能力優(yōu)于MELD、MELD-Na 和AARC 評分（Plt;0.05）；血清色氨酸預(yù)測28 d死亡結(jié)局的能力更差（Plt;0.05，表3）。

2.4 血清色氨酸對HBV-ACLF患者死亡結(jié)局的影響

根據(jù)本研究患者的血清色氨酸中位水平（10.14pg/mL），將患者分為血清色氨酸高水平組（≥10.14 pg/mL，n=90）和低水平組（lt;10.14 pg/mL，n=90）；低水平組90 d累積病死率高于高水平組（43.3% vs 15.6%；HR：3.157，95% CI：1.713-5.817）（圖1）。

與基線高水平色氨酸組相比，低水平組的腎功能不全比例更高（P=0.037）；但是在肝性腦病、腹水、凝血功能不全、肝衰竭等方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05，表4）。多因素分析顯示色氨酸水平和腎功能不全無交互作用（P=0.483）。HBV-ACLF 患者合并低水平色氨酸和腎功能不全時90 d 累積死亡率為73.3%，高于高水平色氨酸且無腎功能不全的患者90 d 死亡率15.0%（Plt;0.001）。Cox 多因素回歸分析結(jié)果顯示，與無低水平色氨酸或腎功能不全的HBV-ACLF患者相比，HBVACLF患者僅合并低水平色氨酸的90 d 死亡風(fēng)險升高（HR=2.629；95% CI：1.362-5.078）； HBV-ACLF患者合并低水平色氨酸和腎功能不全的死亡風(fēng)險進一步升高（HR=7.558；95% CI：3.369-16.960）（表5、圖2）。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)血清色氨酸與HBV-ACLF臨床轉(zhuǎn)歸密切關(guān)聯(lián)；低水平色氨酸預(yù)示90 d高死亡風(fēng)險；值得關(guān)注的是，低水平色氨酸合并腎功能不全時，其死亡風(fēng)險更高。除此之外，本研究結(jié)果顯示血清色氨酸具有一定的預(yù)測90 d死亡結(jié)局的能力。已有研究發(fā)現(xiàn)增強的色氨酸分解代謝可能與ACLF高死亡風(fēng)險相關(guān)［13］，這與我們的發(fā)現(xiàn)是相似的。另外，我們還發(fā)現(xiàn)合并低水平血清色氨酸與腎功能不全對于死亡結(jié)局的增強效應(yīng)；提示HBV-ACLF合并低水平血清色氨酸和腎功能不全不良轉(zhuǎn)歸風(fēng)險尤為高，更值得臨床關(guān)注。

我們推測低水平色氨酸與HBV-ACLF高死亡風(fēng)險密切相關(guān)，其機制可能與色氨酸代謝在體內(nèi)發(fā)揮的的免疫抑制功能有關(guān)。正常狀態(tài)下，體內(nèi)色氨酸穩(wěn)態(tài)主要依靠色氨酸2，3-雙加氧酶［14， 15］，游離色氨酸進入肝臟主要用于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的生物合成（NAD+）；后者主要用于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和能量支持［16］。全身炎癥條件下，能量需求增加，細(xì)胞內(nèi)NAD+耗竭會導(dǎo)致ATP合成受阻［17］，NAD+合成代謝被阻能夠繼而促進炎癥損傷［18］。全身炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是ACLF的標(biāo)志，是導(dǎo)致多器官衰竭和高死亡率的主要原因［19， 20］；本研究中死亡人群患者中色氨酸水平低可能與劇烈炎癥導(dǎo)致其分解代謝有關(guān)；對于高死亡風(fēng)險ACLF患者而言，隨著全身炎癥的加劇以及能量需求增加，色氨酸分解代謝增強，進而愈發(fā)促進炎癥，從而面臨更高的不良轉(zhuǎn)歸。肝外器官如腎臟和免疫細(xì)胞主要通過犬尿氨酸途徑代謝色氨酸，將色氨酸轉(zhuǎn)化為喹啉酸等代謝產(chǎn)物［21，22］；而促炎刺激下，犬尿氨酸通路產(chǎn)生代謝產(chǎn)物具有抑制T細(xì)胞免疫反應(yīng)［23，24］。已有的研究證實，色氨酸分解代謝通過代謝產(chǎn)物蓄積和色氨酸耗竭導(dǎo)致免疫耐受［25］；全身炎癥則通過激活色氨酸分解代謝從而導(dǎo)致多種疾病過程中的器官損傷［26，27］。有研究亦表明犬尿氨酸代謝途徑活性與ACLF的發(fā)展和惡化有關(guān)［13］。由此提示低水平色氨酸人群合并腎臟器官功能衰竭出現(xiàn)更高的死亡風(fēng)險，可能與分解代謝產(chǎn)物蓄積帶來的免疫抑制甚至麻痹狀態(tài)有一定關(guān)聯(lián)。

綜上所述，本研究從臨床角度初步提供了色氨酸代謝與HBV-ACLF臨床結(jié)局之間關(guān)聯(lián)性的數(shù)據(jù)支撐，揭示其臨床關(guān)聯(lián)性，初步明確色氨酸用于預(yù)測90 d死亡風(fēng)險的潛在價值；值得關(guān)注的是，當(dāng)HBV-ACLF合并低水平色氨酸和腎功能不全時，需警惕高風(fēng)險的不良轉(zhuǎn)歸。本研究從色氨酸代謝角度為HBV-ACLF的死亡風(fēng)險管理提供一定的臨床依據(jù)，但有關(guān)深層機制仍需進一步探索。

致謝：我們由衷感謝為本研究提供病例來源的參與單位。湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，上海公共衛(wèi)生臨床中心，上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院，天津市第二人民醫(yī)院，華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院同濟醫(yī)院，成都市公共衛(wèi)生臨床醫(yī)療中心，沈陽市第六人民醫(yī)院，杭州市西溪醫(yī)院，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院，深圳市中醫(yī)院，深圳市第三人民醫(yī)院，湖北省中醫(yī)院，福建醫(yī)科大學(xué)孟超肝膽病醫(yī)院，吉林肝膽病醫(yī)院。

參考文獻：

[1] Wu T， Li J， Shao L， et al. Development of diagnostic criteria and a

prognostic score for hepatitis B virus-related acute-on-chronic liver

failure[J]. Gut， 2018， 67（12）： 2181-91.

[2] Li JQ， Liang X， You SL， et al. Development and validation of a new

prognostic score for hepatitis B virus-related acute-on-chronic liver

failure[J]. J Hepatol， 2021， 75（5）： 1104-15.

[3] Zhang J， Gao S， Duan ZP， et al. Overview on acute-on-chronic liver

failure[J]. Front Med， 2016， 10（1）： 1-17.

[4] Olson JC， Kamath PS. Acute-on-chronic liver failure： concept，

natural history， and prognosis[J]. Curr Opin Crit Care， 2011， 17（2）：

165-9.

[5] Sarin SK， Choudhury A， Sharma MK， et al. Acute-on-chronic liver

failure： consensus recommendations of the Asian Pacific association

for the study of the liver （APASL）： an update[J]. Hepatol Int， 2019，

13（4）： 353-90.

[6] Arroyo V， Moreau R， Jalan R. Acute-on-chronic liver failure[J]. N

Engl J Med， 2020， 382（22）： 2137-45.

[7] Zhang IW， Curto A， López-Vicario C， et al. Mitochondrial

dysfunction governs immunometabolism in leukocytes of patients

with acute-on-chronic liver failure[J]. J Hepatol， 2022， 76（1）：

93-106.

[8] Zaccherini G， Aguilar F， Caraceni P， et al. Assessing the role of

amino acids in systemic inflammation and organ failure in patients

with ACLF[J]. J Hepatol， 2021， 74（5）： 1117-31.

[9] Li J， Liang X， Jiang J， et al. PBMC transcriptomics identifies

immune-metabolism disorder during the development of HBVACLF[

J]. Gut， 2022， 71（1）： 163-75.

[10]Peng B， Li H， Liu K， et al. Intrahepatic macrophage reprogramming

associated with lipid metabolism in hepatitis B virus-related acuteon-

chronic liver failure[J]. J Transl Med， 2023， 21（1）： 419.

[11]Moreau R， Clària J， Aguilar F， et al. Blood metabolomics uncovers

inflammation-associated mitochondrial dysfunction as a potential

mechanism underlying ACLF[J]. J Hepatol， 2020， 72（4）： 688-701.

[12]McPhail MJW， Coen M. Metabolomics to discriminate between

acute decompensation and acute-on-chronic liver failure in cirrhosis

[J]. J Hepatol， 2020， 73（3）： 730-2.

[13]Clària J， Moreau R， Fenaille F， et al. Orchestration of tryptophankynurenine

pathway， acute decompensation， and acute-on-chronic

liver failure in cirrhosis[J]. Hepatology， 2019， 69（4）： 1686-701.

[14]Klaessens S， Stroobant V， Hoffmann D， et al. Tryptophanemia is

controlled by a tryptophan-sensing mechanism ubiquitinating

tryptophan 2， 3-dioxygenase[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2021， 118

（23）： e2022447118.

[15]Klaessens S， Stroobant V， De Plaen E， et al. Systemic tryptophan

homeostasis[J]. Front Mol Biosci， 2022， 9： 897929.

[16]Hikosaka K， Yaku K， Okabe K， et al. Implications of NAD

metabolism in pathophysiology and therapeutics for neurodegenerative

diseases[J]. Nutr Neurosci， 2021， 24（5）： 371-83.

[17]Navas LE， Carnero A. Nicotinamide adenine dinucleotide （NAD）

metabolism as a relevant target in cancer[J]. Cells， 2022， 11（17）：

2627.

[18]Cao P， Chen Q， Shi CX， et al. Fusobacterium nucleatum promotes

the development of acute liver failure by inhibiting the NAD+

salvage metabolic pathway[J]. Gut Pathog， 2022， 14（1）： 29.

[19]Moreau R. The pathogenesis of ACLF： the inflammatory response

and immune function[J]. Semin Liver Dis， 2016， 36（2）： 133-40.

[20]Sarin SK， Choudhury A. Acute-on-chronic liver failure： terminology，

mechanisms and management[J]. Nat Rev Gastroenterol

Hepatol， 2016， 13（3）： 131-49.

[21]Savitz J. The kynurenine pathway： a finger in every pie[J]. Mol

Psychiatry， 2020， 25（1）： 131-47.

[22]Majewski M， Kozlowska A， Thoene M， et al. Overview of the role of

vitamins and minerals on the kynurenine pathway in health and

disease[J]. J Physiol Pharmacol， 2016， 67（1）： 3-19.

[23]Fallarino F， Grohmann U， Vacca C， et al. T cell apoptosis by

tryptophan catabolism[J]. Cell Death Differ， 2002， 9（10）： 1069-77.

[24]Lerch S， Schefold JC， Spinetti T. The role of kynurenines produced

by indolamine-2， 3-dioxygenase 1 in sepsis[J]. Pharmacology，

2022， 107（7/8）： 359-67.

[25]Platten M， Wick W， van den Eynde BJ. Tryptophan catabolism in

cancer： beyond IDO and tryptophan depletion[J]. Cancer Res， 2012，

72（21）： 5435-40.

[26]Nikolaus S， Schulte B， Al-Massad N， et al. Increased tryptophan

metabolism is associated with activity of inflammatory bowel

diseases[J]. Gastroenterology， 2017， 153（6）： 1504-16. e2.

[27]Prendergast GC， Smith C， Thomas S， et al. Indoleamine 2， 3-

dioxygenase pathways of pathogenic inflammation and immune

escape in cancer[J]. Cancer Immunol Immunother， 2014， 63（7）：

721-35.

（編輯：經(jīng) 媛）