摘要［目的］選擇四川省栽培面積最大、產(chǎn)量最多的核桃品種“鹽源早”（Juglansregia“Yanyuanzao”），探索“鹽源早”的親緣關(guān)系。［方法］選擇“鹽源早”、“三臺泡核桃”（Juglanssigillata‘Santai’）、“漾濞泡核桃”（Juglanssigillata“Yangbi”）、“溫185”（Juglansregia“Wen185”）、“新新2”（Juglansregia“Xinxin2”）5個核桃品種為試驗材料，測定單果重、果仁重、出仁率、堅果三徑、果形指數(shù)、種殼厚以及果仁成分（粗蛋白、粗脂肪）等指標(biāo)，通過方差、相關(guān)性、聚類與主成分分析等探索5個核桃品種的表型性狀和果仁成分多樣性；利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)探究“鹽源早”等5個核桃品種的遺傳多樣性和遺傳關(guān)系。［結(jié)果］果實的表型性狀與果仁成分多樣性分析結(jié)果表明，

5個核桃品種的單果重、果仁重、出仁率、側(cè)徑、橫徑、縱徑、果形指數(shù)、種殼厚及果仁成分（粗脂肪、粗蛋白含量）之間差異極顯著或顯著（Plt;0.01或Plt;0.05）。聚類分析和主成分分析結(jié)果表明，可將5個核桃品種聚為三大類群，第Ⅰ類為“溫185”，第Ⅱ類為“新新2”“鹽源早”“漾濞泡核桃”，第Ⅲ類為“三臺泡核桃”。利用ISSR分子標(biāo)記篩選出10條圖譜條帶清晰，背景明亮，重復(fù)性強，多態(tài)性較好，穩(wěn)定性強的引物。通過對擴增圖譜進行多態(tài)性分析結(jié)果表明，5個核桃品種的有效等位基因數(shù)均值為1.3370，Nei’s基因多樣性指數(shù)均值為0.1935，Shannon信息指數(shù)均值為0.2858。聚類分析和主成分分析表明，“鹽源早”和“漾濞泡核桃”聚為一類，表明親緣關(guān)系表現(xiàn)較近，且相同地區(qū)的“溫185”和“新新2”聚為一類，“三臺泡核桃”聚為一類。［結(jié)論］通過對5個核桃品種的果實表型性狀、果仁成分及ISSR分子標(biāo)記的聚類分析得出，“鹽源早”與“漾濞泡核桃”親緣關(guān)系較近。

關(guān)鍵詞核桃品種；表型性狀；果仁成分；ISSR分子標(biāo)記

中圖分類號S664.1"文獻標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611（2025）02-0117-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.02.025

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

IdentificationofGeneticRelationshipsAmongFiveWalnutVarietiesBasedonPhenotypicTraitsandISSRAnalysis

WUYu-huaLIPi-jun2，XIONGFu-bo1etal

（1.SchoolofForestryamp;LandscapeArchitecture，AnhuiAgriculturalUniversity，Hefei，Anhui230036;2.SichuanAcademyofForestrySciences，Chengdu，Sichuan610081）

Abstract［Objective］SelectthewalnutvarietyJuglansregia‘Yanyuanzao’withthelargestcultivationareaandthelargestproductioninSichuanProvince，andexplorethegeneticrelationshipofJuglansregia‘Yanyuanzao’.［Method］Thisstudyselectedfivewalnutvarieties，Juglansregia‘Yanyuanzao’，Juglanssigillata‘Santai’，Juglanssigillata‘Yangbi’，Juglansregia‘Wen185’andJuglansregia‘Xinxin2’asresearchmaterials.Thesinglefruitweight，kernelweight，kernelyield，nutdiameter，fruitshapeindex，seedshellthickness，andkernelcomposition（crudeprotein）weremeasured，andthediversityofphenotypiccharactersandkernelcomponentoffivewalnutcultivarswerestudiedbytheANOVA，correlation，clusteringandprincipalcomponent.Thegeneticdiversityoffivewalnutvarietyincluding‘Yanyuanzao’wereinvestigatedbyISSRmolecularmarkertechnology.［Result］

Thesinglefruitweight，kernelweight，kernelyield，lateraldiameter，transversediameter，longitudinaldiameter，fruitshapeindex，seedshellthickness，andkernelcomposition（crudefatandcrudeproteincontent）ofthefivewalnutvarietiesshowedextremelysignificantorsignificantdifferences（Plt;0.01orPlt;0.05）.Theresultsofclusterandprincipalcomponentanalysisshowedthatthefivewalnutvarietiescouldbeclusteredintothreemajorclasses，withtheclassⅠbeing‘Wen185’，theclassⅡbeing‘Xinxin2’and‘Yanyuanzao’and‘Yangbi’，andtheclassⅢwas‘Santai’.10primerswithclearbands，brightbackground，highreproducibility，goodpolymorphismandhighstabilitywerescreenedbyusingISSRmolecularmarkers.Theresultsofpolymorphismanalysisshowedthatthemeannumberofeffectiveallelesofthefivewalnutvarietieswas1.3370，themeangenediversityindexwas0.1935，andthemeanShannoninformationindexwas0.2858.Theclusteringandprincipalcomponentanalysisshowedthat‘Yanyuanzao’and‘Yangbi’wereclusteredtogether，indicatingthattherelativesofthemwerecloser，and‘Wen185’and‘Xinxin2’wereclusteredtogetherinthesamearea，andthe‘Santai’wasclusteredintoonecategory.［Conclusion］Clusteranalysisofthefruitphenotypictraits，kernelcomponentsandISSRmolecularmarkersoffivewalnutvarietiesshowedthat，‘Yanyuanzao’and‘Yangbi’hadaclosegeneticrelationship.

KeywordsWalnutvarieties;Phenotypictraits;Fruitkernelingredients;ISSRmolecularmarker

核桃（Juglans regia L.）系胡桃科（Juglandaceae）胡桃屬（Juglans）植物，是一些具有經(jīng)濟和栽培價值的種的統(tǒng)稱^［1］。核桃為世界四大干果（核桃、扁桃、腰果、榛子）之首，素有“木本油料之王”的稱號，是重要的食用干果和油料樹種，在我國糧油安全和新能源戰(zhàn)略中占有重要地位^［2-3］。核桃作為我國悠久的傳統(tǒng)作物之一，栽培歷史已超過3 000年。我國作為世界核桃的主產(chǎn)地之一，主要分布區(qū)在四川、云南、新疆、陜西、河南、山東、天津、河北、遼寧、黑龍江等?。▍^(qū)、市）。其中，四川省作為我國核桃種植的主要省份之一^［4］，“鹽源早”（Juglans regia “Yanyuanzao”）核桃品種作為栽培于四川省面積最廣、產(chǎn)量最高的核桃品種^［5］，主要栽培于川西高山峽谷區(qū)域以及川西南山地區(qū)，受低緯度高海拔的地理條件和半干旱、高濕的氣候條件限制，發(fā)展核桃種植業(yè)的難度很大。目前，四川省核桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展受到了一些問題的制約。這些問題主要包括核桃品種布局不完善、良種使用不規(guī)范等方面。這些問題嚴(yán)重影響了該產(chǎn)業(yè)的效益。因此，需要對全省的種質(zhì)資源、優(yōu)良品種進行科學(xué)認識和充分利用，以更好地發(fā)揮資源優(yōu)勢。為了使得“鹽源早”能夠有更大的推廣應(yīng)用，應(yīng)通過研究其遺傳多樣性改良核桃品種，以提高產(chǎn)量，增強抗逆性和改善品質(zhì)，為我國核桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。

植物的親緣關(guān)系是指不同植物之間的遺傳關(guān)系和進化關(guān)系。這些關(guān)系可以通過植物形態(tài)、生理學(xué)特征、基因組成和分子結(jié)構(gòu)等方面的相似性來確定。植物的親緣關(guān)系可以用來研究植物分類學(xué)、進化和生態(tài)學(xué)等方面的問題。常見的確定植物親緣關(guān)系的方法包括形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、細胞學(xué)、分子生物學(xué)等^［6-7］。我國幅員遼闊，核桃品種繁多。隨著農(nóng)業(yè)科技的不斷進步，新的核桃品種不斷涌現(xiàn)和選育。因此，研究親緣關(guān)系有助于評估當(dāng)前生物的狀態(tài)并預(yù)測其未來的發(fā)展趨勢，以便為制訂有效的發(fā)展策略和措施提供依據(jù)。王亞楠等^［8］對新疆杏品種的花器官特征性狀進行親緣關(guān)系及遺傳多樣性分析。魏杰等^［9］通過ISSR分析31份櫻屬材料，通過聚類分析為櫻屬品種鑒定提供理論依據(jù)。

核桃育種周期長，育種過程中不可控因素多。為了明確不同品種之間的親緣關(guān)系以及為后續(xù)的核桃良種種質(zhì)資源提供理論基礎(chǔ)，筆者以“鹽源早”（Juglansregia“Yanyuanzao”）、“三臺泡核桃”（Juglanssigillata“Santai”）、“漾濞泡核桃”（Juglanssigillata“Yangbi”）、“溫185”（Juglansregia“Wen185”）、“新新2”（Juglansregia“Xinxin2”）5個核桃品種為研究對象，測定果實表型性狀、果仁成分，獲得果實表型性狀與果仁成分的差異與親緣關(guān)系；其次，在分子水平上利用ISSR分子標(biāo)記明確目前四川省良種“鹽源早”等5個核桃品種的親緣關(guān)系，旨在通過表型性狀、果仁成分與分子標(biāo)記相結(jié)合的方式，對5個核桃品種進行親緣關(guān)系鑒定，以期為核桃種質(zhì)資源的分類利用與選優(yōu)評價提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

經(jīng)過前期篩選，選擇5個核桃品種。①“鹽源早”：2021年通過國家林業(yè)和草原局林木品種審定委員會認定。表現(xiàn)出了較好的早實性、適生性、豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)性、抗逆性和商品性等。

②“漾濞泡核桃”：2012年通過云南省林木品種審（認）定委員會審定為地方優(yōu)良品種，引進到四川省種植，具有早實、豐產(chǎn)、長壽、品質(zhì)優(yōu)良等許多優(yōu)良特性，投資少、見效快、收益大，是優(yōu)良油料樹種。

③“三臺泡核桃”：2012年通過云南省林木品種審（認）定委員會審定為地方優(yōu)良品種，引進到四川省種植，具有產(chǎn)量高、質(zhì)量高、美觀、香甜美味、易加工、抗逆性強的優(yōu)點。

④“溫185”：1995年通過新疆林木良種委員會審定，引進到四川省種植，具有結(jié)實早、品種優(yōu)良、市場價格高、抗逆性強等優(yōu)點。

⑤“新新2”：2004年通過新疆林木良種委員會審定，引進到四川省種植，具有適應(yīng)性強，耐干旱、耐低溫，抗病蟲害能力強。

用于測定表型性狀與果仁成分的果實，在最佳采收期采集，即以從四川省收集的5個核桃品種的堅果為試驗材料，每個品種收集50個。用于測定ISSR分子標(biāo)記遺傳多樣性的材料是5個核桃品種的盆栽“2+1”嫁接苗（砧木2年，接穗1年）的葉片，5個待測品種盆栽嫁接苗基本特征見表1。

1.2方法

1.2.1堅果果實表型性狀和果仁成分的測定。

單果重、果仁重、出仁率：參考中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NYT2935—2016（核桃種質(zhì)資源描述規(guī)范），使用稱重計算法測定核桃堅果的單果重、果仁重和出仁率。各樣品隨機選取30個堅果，手工去殼取出核桃仁，然后測量其單果重（mg）和果仁重（m2，g），出仁率按下式計算：

出仁率（%）=m1/m2×100

核桃單果三徑、殼厚度測量：各樣品隨機選取30個堅果，采用游標(biāo)卡尺測量核桃單果三徑與殼厚度。核桃堅果中部至胴部之間的距離記為側(cè)徑（mm），核桃堅果中部縫合線之間的距離記為橫徑（mm），核桃堅果頂部與底部之間的距離記為縱徑（mm），堅果果實胴部記為殼厚度（mm）。

粗脂肪含量測定：按GB/T14772—2008的方法測定果仁粗脂肪含量，重復(fù)3次，取其均值進行分析。

粗蛋白含量測定：按GB5009.5—2010的方法測定果仁中粗蛋白含量，重復(fù)3次，取其均值進行分析。

1.2.2DNA提取。

所采集的幼嫩葉片進行沖洗、晾干和剪碎等操作，將其放入密封袋中，并進行編號標(biāo)記。隨后，將密封袋中的樣品放入冰箱中冷藏備用。接下來使用TSINGKE植物DNA提取試劑盒（通用型）進行DNA提取，以所采集的幼葉為供試模板。具體操作步驟按照試劑盒說明進行。

1.2.3ISSR引物篩選與PCR擴增。

提取的5個DNA樣品作為PCR模板，以2×T8High-FidelityMasterMix進行擴增，擴增體系各組分見表2。

以上擴增體系按表3中擴增程序進行擴增。

1.3數(shù)據(jù)分析

使用SPSS26.0對果實表型性狀、生理生化指標(biāo)進行單因素方差分析、多重比較分析及相關(guān)性分析；使用ORIGIN2021對所得數(shù)據(jù)進行聚類分析及主成分分析。

將5個核桃樣品所擴增出的條帶數(shù)作為原始矩陣，對圖譜中的清晰條帶進行賦值，將有條帶的DNA片段和無條帶的DNA片段分別賦值為1和0，構(gòu)建分子標(biāo)記的矩陣數(shù)據(jù)。運用NTSYS-pc2.1e軟件計算出核桃品種間的相似系數(shù)，進行UPGMA聚類分析，繪制出親緣關(guān)系樹狀圖。用軟件Popgene1.32軟件對ISSR擴增結(jié)果進行遺傳多樣性分析，分別計算多態(tài)位點百分率（PPB）、Shannon信息指數(shù)（I）、Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）、觀測等位基因（Na）、有效等位基因（Ne）。

2結(jié)果與分析

2.15個核桃品種表型性狀與果仁成分的遺傳多樣性

2.1.1表型性狀分析。

ANOVA分析結(jié)果表明，5個核桃品種的果實表型性狀均存在顯著差異（表4）。5個核桃品種的單果重、果仁重、出仁率、側(cè)徑、橫徑、縱徑、果形指數(shù)的差異極顯著（Plt;0.01），種殼厚差異顯著（Plt;0.05）。

2.1.2果仁成分分析。

單因素方差分析結(jié)果表明（表5），5個核桃品種的粗脂肪、粗蛋白均表現(xiàn)為極顯著差異（Plt;0.01）。5個核桃品種的粗脂肪與粗蛋白含量最大為“溫185”（6.998、1.701mg/g），顯著高于“新新2”“漾濞泡核桃”“鹽源早”，最小為“三臺泡核桃”（3.240、0.668mg/g）。

2.1.3表型性狀和果仁成分的UPGMA聚類分析。

5個核桃品種表型性狀和果仁成分的UPGMA聚類分析結(jié)果表明，歐氏距離為6處，可將5個核桃品種聚為三大類群。第Ⅰ類為“溫185”，第Ⅱ類為“新新2”“鹽源早”“漾濞泡核桃”，第Ⅲ類為“三臺泡核桃”（圖1）。

2.25個核桃品種ISSR分子標(biāo)記的遺傳多樣性

2.2.1引物擴增。

從加拿大哥倫比亞大學(xué)公布的100條ISSR序列中通過查閱相關(guān)文獻選擇39條進行引物合成，經(jīng)過初篩、復(fù)篩、再復(fù)篩，最后挑選出10條圖譜條帶清晰、背景明亮、重復(fù)性強、多態(tài)性較好、穩(wěn)定性強的引物（表6）。然后用篩選出的10條ISSR引物將5個核桃品種總基因組DNA模板進行PCR擴增試驗。

由ISSR引物擴增的結(jié)果可知，10條引物共檢測出61個等位基因位點（圖2，表7）。其中，最小等位基因數(shù)目為4（UBC842），最大等位基因數(shù)目為8（UBC826），平均每個位點等位基因數(shù)目為6.10。5個核桃品種多樣性參數(shù)見表8。

2.2.2遺傳多樣性分析。

由相似系數(shù)矩陣可知，5個核桃品種遺傳距離較近，遺傳相似性系數(shù)為0.7415～0.9111（表9）?！靶滦?”與“溫185”的遺傳相似系數(shù)達到0.911"說明二者的親緣關(guān)系接近；其次是“鹽源早”與“漾濞泡核桃”，遺傳相似系數(shù)達到0.8817，說明這2份材料遺傳關(guān)系很接近，親緣關(guān)系較近；“三臺泡核桃”與“溫185”的遺傳相似性系數(shù)最?。?.7415），表明這兩者間的遺傳差距最大，親緣關(guān)系最遠。

（1）聚類分析。從遺傳樹狀圖可以看出，當(dāng)遺傳系數(shù)在0.85時，5個核桃品種分為2類，其中“溫185”和“新新2”為一類，另一類為“鹽源早”“漾濞泡核桃”“三臺泡核桃”（圖3）。當(dāng)遺傳系數(shù)在0.88時，5個核桃品種分為3類，其中“溫185”和“新新2”為一類，“鹽源早”和“漾濞泡核桃”為一類，“三臺泡核桃”為一類。

（2）主成分分析?；贜ei’s的遺傳距離，對5個核桃品種進行了主成分分析，結(jié)果顯示“鹽源早”與“漾濞泡核桃”距離最近，“新新2”與“溫185”距離較近，離“三臺泡核桃”較遠（圖4）。

3討論與結(jié)論

3.1核桃品種表型性狀、果仁成分與ISSR分子標(biāo)記親緣關(guān)系鑒定

表型性狀與分子標(biāo)記是遺傳學(xué)研究中的2個重要方面，它們可以相互關(guān)聯(lián)，通過分析它們之間的關(guān)系，可以揭示基因與表型性狀之間的聯(lián)系，從而深入了解遺傳學(xué)機

制^［10］。表型性狀是指生物個體在形態(tài)、生理和行為等方面的表現(xiàn)^［11］；分子標(biāo)記則是指基因組DNA序列中的特定區(qū)域或位點^［12］。該研究發(fā)現(xiàn)，5個核桃品種之間的表型性狀和果仁成分存在著不同程度的差異性與相關(guān)性。這與陳素傳等^［13］對山核桃優(yōu)株果實主要經(jīng)濟性狀和營養(yǎng)成分的差異分析的結(jié)果具有相似性。此外，對5個核桃品種的果實表型性狀、果仁成分進行分析，結(jié)果表明，第 Ⅰ 類為“溫 185”，第 Ⅱ 類為“新新 2”“鹽源早”“漾濞泡核桃”，第 Ⅲ 類為“三臺泡核桃”；通過對5個核桃品種進行DNA提取、引物篩選、PCR擴增，經(jīng)過多態(tài)性分析結(jié)果表明，5個品種之間多態(tài)性良好。聚類分析、主成分分析結(jié)果表明，“溫 185”和“新新 2”為第 Ⅰ 類，“鹽源早”和“漾濞泡核桃”為第 Ⅱ 類，“三臺泡核桃”為第 Ⅲ 類。相比表型性狀與分子標(biāo)記2個結(jié)果可以看出，2種方法親緣關(guān)系分析結(jié)果存在一定差異，但大部分材料都被聚到同一類中。

對表型性狀、果仁成分進行遺傳多樣性分析時，未將“新新 2”和“鹽源早”2個品種區(qū)分開，而ISSR分子標(biāo)記將兩者區(qū)分開。雖然觀察和測定植物表型性狀和果仁成分是研究植物親緣關(guān)系的最簡單和最直觀的方法之一^［14］，但是表型性狀和果仁成分由植物基因型決定，往往會受土壤狀況、栽培技術(shù)及氣候等多方面的影響^［15］。而分子標(biāo)記不易受外界環(huán)境影響，且ISSR分子標(biāo)記技術(shù)重復(fù)性好，穩(wěn)定性高，操作簡單，多態(tài)性豐富^［16］。

雖然表型性狀、果仁成分標(biāo)記研究和分子標(biāo)記研究都是植物親緣關(guān)系與遺傳多樣性研究的重要方法，但2種方法的結(jié)果往往存在分歧。這主要是由于兩者從不同的層面上表現(xiàn)植物遺傳多樣性。植物的表型性狀、果仁成分主要區(qū)分遺傳變異和種屬之間的差別，這些性狀通常會受到環(huán)境和基因的共同影響^［17］。相比之下，分子標(biāo)記則是直接反映種質(zhì)間基因型差異的技術(shù)手段，不受基因表達和外部環(huán)境條件的影響，因此其親緣關(guān)系分析結(jié)果比較準(zhǔn)確^［18］。雖然2種方法分類結(jié)果存在不一致現(xiàn)象，但存在一定的關(guān)系。表型性狀、果仁成分標(biāo)記可以為分子標(biāo)記提供參考，更能客觀、準(zhǔn)確地確定種質(zhì)資源的親緣關(guān)系。近年來研究表明，這2種方法可在植物分類、品種鑒別及遺傳多樣性分析中起到互補作用。

3.25個核桃品種的表型性狀與果仁成分多樣性分析

5個核桃品種的單果重、果仁重、出仁率、側(cè)徑、橫徑、縱徑、果形指數(shù)、種殼厚及果仁成分（粗脂肪、粗蛋白含量）之間呈差異極顯著或顯著（Plt;0.01或Plt;0.05）。

聚類分析結(jié)果表明：在歐氏距離為6處，可將5個核桃品種聚為三大類群。第Ⅰ類為“溫185”，第Ⅱ類為“新新2”“鹽源早”“漾濞泡核桃”，第Ⅲ類為“三臺泡核桃”。主成分分析結(jié)果表明：可將5個核桃品種分為3組，第1組為“新新2”“鹽源早”“漾濞泡核桃”，第2組為“三臺泡核桃”，第3組為“溫185”。這表明“鹽源早”“新新2”“漾濞泡核桃”在果實表型性狀的親緣關(guān)系較近。

3.35個核桃品種的ISSR分子標(biāo)記親緣關(guān)系

利用最佳的ISSR-PCR反應(yīng)體系篩選出10條擴增條帶清晰、重復(fù)性高、多態(tài)性好的引物。根據(jù)“鹽源早”等品種ISSR擴增產(chǎn)生的條帶計算出5個核桃品種之間遺傳相似性系數(shù)為0.7415～0.911"5個核桃品種的有效等位基因數(shù)均值為1.3370，Nei’s基因多樣性指數(shù)均值為0.1935，Shannon信息指數(shù)均值為0.2850，表明這5個核桃品種遺傳距離較近。其中“新新2”與“溫185”的遺傳相似系數(shù)達到0.911"說明兩者的遺傳物質(zhì)存在很大程度上的相似甚至一致性，親緣關(guān)系接近；其次是“鹽源早”與“漾濞泡核桃”，遺傳相似系數(shù)達到0.8817，說明這2個核桃品種遺傳關(guān)系很接近，親緣關(guān)系較近?！叭_泡核桃”與“溫185”的遺傳相似性系數(shù)最小0.7415，表明這兩者間的遺傳差距最大，親緣關(guān)系最遠。

基于ISSR標(biāo)記擴增圖譜的聚類結(jié)果表明，當(dāng)遺傳系數(shù)在0.85時，5個核桃品種分為2類，其中“溫185”和“新新2”為一類，另一類為“鹽源早”“漾濞泡核桃”“三臺泡核桃”。當(dāng)遺傳系數(shù)在0.88時，5個核桃品種分為3類，其中“溫185”和“新新2”為一類，“鹽源早”“漾濞泡核桃”為一類，“三臺泡核桃”為一類。主成分分析結(jié)果表明，“鹽源早”“漾濞泡核桃”品種表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系；并且相同地區(qū)的也往往聚為一類，如“溫185”和“新新2”核桃品種也聚為一類。

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