摘要以黃瓜抗病高代自交系D9320為試驗(yàn)材料，采用Gateway技術(shù)構(gòu)建了黃瓜霜霉病和棒孢葉斑病菌脅迫下黃瓜酵母雙雜交cDNA文庫(kù)。結(jié)果表明：酵母文庫(kù)克隆數(shù)為350個(gè)，文庫(kù)滴度為3.5×107CFU/mL，重組率達(dá)到100%，插入片段長(zhǎng)度在750～2000bp，平均片段長(zhǎng)度超過1000bp。文庫(kù)容量和重組率及插入片段大小均說明霜霉病菌和棒孢葉斑病菌脅迫下黃瓜酵母雙雜交cDNA文庫(kù)構(gòu)建成功，可用于黃瓜雙抗機(jī)制互作蛋白的篩選。

關(guān)鍵詞黃瓜霜霉??；黃瓜棒孢葉斑??；cDNA文庫(kù)；酵母雙雜交

中圖分類號(hào)S432.1"文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2025）02-0093-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.02.021

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

ConstructionandIdentificationofCucumberYeastTwo-hybridcDNALibraryUnderBiologicalStress

LIUDong，PANChun-qing，ZHANGYan-ju

（CollegeofPlantProtection，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin，Heilongjiang，150030）

AbstractAyeasttwo-hybridcDNAlibraryofcucumberwasconstructedbyGatewaytechnologyunderthestressofPseudoperonosporacubensisandCorynesporacassiicolausingthediseaseresistantinbredlineD9320.Theresultsshowedthatthenumberofyeastlibrarycloneswas350，thetiteroflibrarywas3.5×107CFU/mLandtherateofrecombinationwas100%.Thelengthofallthefragmentswas750-2000bp.Theaveragelengthwasmorethan1000bp.TheyeasttwohybridcDNAlibraryofcucumberunderthestressofPseudoperonosporacubensisandCorynesporacassiicolawasconstructedsuccessfully，whichcouldbeusedforscreeninginteractionproteinsofthedouble-diseaseresistancemechanismincucumber.

KeywordsCucumberdownymildew;Cucumbertargetleafspot;cDNAlibrary;Yeasttwo-hybrid

黃瓜（CucumissativusL.）是重要的蔬菜作物之一，在我國(guó)主要以保護(hù)地栽培為主。黃瓜霜霉病和棒孢葉斑病是黃瓜生產(chǎn)中的重要病害，傳播流行速度快，一旦發(fā)生難以控制，嚴(yán)重影響黃瓜產(chǎn)量及品質(zhì)?；瘜W(xué)藥劑雖能短期快速控制病害使其發(fā)展緩慢，但長(zhǎng)期用藥必然會(huì)造成污染、殘留以及病原菌耐藥性等問題。因此，選育雙抗品種是防治黃瓜病害最安全和高效的方法之一。

常規(guī)育種周期長(zhǎng)，利用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行雙抗品種的培育可大大縮短育種周期。黃瓜抗霜霉病和棒孢葉斑病雙抗分子機(jī)制研究還不深入，單一病害的抗性遺傳規(guī)律研究結(jié)果仍不一致。國(guó)外學(xué)者Abul-Hayja等^［1］將棒孢葉斑病抗、感親本進(jìn)行雜交，發(fā)現(xiàn)1對(duì)參與調(diào)控黃瓜對(duì)棒孢葉斑病的顯性抗病基因Cca。國(guó)內(nèi)學(xué)者與國(guó)外學(xué)者研究結(jié)果相反，2010 年王惠哲等^［2］研究結(jié)果顯示，黃瓜棒孢葉斑病的抗性并非由顯性基因控制，而是由隱性基因調(diào)控，感病性狀與抗病性狀相比，感病性狀呈顯性且為不完全顯性。2015年Wen等^［3］利用 D31（抗病親本）與 D5（感病親本）雜交獲得隱性抗病基因Cca-3。1990年至今，大部分霜霉病抗性遺傳規(guī)律研究結(jié)果顯示抗性是由多個(gè)基因控制^［4-5］，少數(shù)研究顯示抗性是由單一基因控制^［6］。

隨著黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系的建立與優(yōu)化，使霜霉病和棒孢葉斑病抗病基因的研究不僅僅局限在遺傳規(guī)律分析及定位，Wang等^［7］使用抗、感材料，多時(shí)間點(diǎn)接種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)了146個(gè)差異基因，其中包括轉(zhuǎn)錄因子、激素、Ca²⁺代謝通路和防御類基因等多種類型。新鑒定出7個(gè)與抗黃瓜棒孢葉斑病相關(guān)的miRNAs，在黃瓜植株內(nèi)過表達(dá)CsNAC、CsAPE、Cs4CL 和 CsPAL 能增強(qiáng)黃瓜植株對(duì)棒孢葉斑病的抗病性。2017年以來，劉東等^［8-12］對(duì)黃瓜霜霉病和棒孢葉斑病雙抗機(jī)制進(jìn)行品種抗病性、組織病理學(xué)觀察及分子雙抗機(jī)理研究。利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)挖掘到了雙抗相關(guān)基因CsERF004、CsCBS和CsGASA4，過表達(dá)CsERF004的株系對(duì)黃瓜霜霉病和棒孢葉斑病的抗病性明顯增強(qiáng)，CsCBS和CsGASA4能夠積極響應(yīng)2種病原菌的脅迫。目前，已明確CsERF004與黃瓜抗霜霉病和棒孢葉斑病有關(guān)，但與其相關(guān)的互作蛋白尚不清楚，黃瓜抗霜霉病和棒孢葉斑病雙抗反應(yīng)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)不清晰。

酵母雙雜交cDNA文庫(kù)是研究蛋白互作的方法之一。通過構(gòu)建酵母雙雜交cDNA文庫(kù)，可以用來篩選目標(biāo)基因的互作蛋白，對(duì)研究基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)將有很大幫助。酵母雙雜交技術(shù)應(yīng)用于不同脅迫下的多種作物。在番茄作物中，構(gòu)建了生物脅迫（葉霉菌侵染）和非生物脅迫（干旱脅迫）下的酵母雙雜交cDNA文庫(kù)^［13-14］；青枯病菌脅迫下的茄子酵母雙雜交文庫(kù)被構(gòu)建^［15］；大麗輪枝菌生物脅迫下和激素非生物脅迫下的棉花酵母雙雜交文庫(kù)被構(gòu)建等^［16］。黃瓜酵母雙雜交文庫(kù)的構(gòu)建僅見在黃瓜發(fā)育性狀上^［17］，缺乏病原菌生物脅迫下的黃瓜酵母雙雜交文庫(kù)的構(gòu)建。

筆者采用Gateway技術(shù)，以黃瓜抗病高代自交系D9320為試驗(yàn)材料，構(gòu)建霜霉病菌和棒孢葉斑病菌脅迫下的黃瓜酵母雙雜交cDNA文庫(kù)。文庫(kù)的構(gòu)建將為解析黃瓜對(duì)霜霉病和棒孢葉斑病雙抗反應(yīng)中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定基礎(chǔ)，為深入研究黃瓜雙抗分子機(jī)制及品種培育提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

抗病黃瓜高代自交系D9320由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院黃瓜課題組提供。黃瓜棒孢葉斑病菌由天津科潤(rùn)黃瓜研究所贈(zèng)予。

黃瓜霜霉病菌采集自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝試驗(yàn)站。載體：購(gòu)自Invitrogen公司的pDONR222及pGADT7-DEST。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1病原菌脅迫處理。

黃瓜材料的準(zhǔn)備：播種前先進(jìn)行種子表面消毒，消毒使用3%次氯酸鈉溶液。用準(zhǔn)備好的消毒液浸泡黃瓜種子10min進(jìn)行種子表面消毒。消毒后使用無菌水清洗種子，洗去殘留的消毒液，提前準(zhǔn)備好裝有濾紙的培養(yǎng)皿，將消毒好的種子擺放在培養(yǎng)皿內(nèi)，加入無菌水保濕。28℃避光催芽1d，0.5cm胚根長(zhǎng)出后即可進(jìn)行播種。播種后將其置于設(shè)置好溫度及光照（26℃/18℃、16h/8h光周期）的人工氣候箱中培養(yǎng)。

孢子懸浮液的配制：①棒孢葉斑病，使用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)黃瓜棒孢葉斑病菌，28℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7d后，無菌水沖洗培養(yǎng)基表面菌絲，用3層滅菌紗布對(duì)沖洗液進(jìn)行過濾，過濾后在顯微鏡下將孢子懸浮液濃度調(diào)至1×105個(gè)孢子/mL。②霉?。河妹⒉杉降牟∪~上的孢子囊刷到裝有無菌水的燒杯中，將孢子懸浮液濃度調(diào)至5×103個(gè)孢子囊/mL。

接種處理：待黃瓜植株第1片真葉展平時(shí)，采用點(diǎn)滴法將2種配制好的孢子懸浮液交叉點(diǎn)滴各15滴，每滴20L。接種后至少保濕24h。

取材時(shí)間：接種12、24、48、72、96h后，使用手術(shù)剪剪下第1片真葉，錫紙包裹好樣品立即置于液氮中冷凍，冷凍后在-80℃冰箱保存，為后續(xù)RNA提取作準(zhǔn)備。

1.2.2RNA提取、mRNA分離及純化。

采用Trizol 法進(jìn)行黃瓜植物葉片總RNA的提取^［18］。mRNA分離的具體操作步驟則按照Invitrogen公司的產(chǎn)品Oligotex mRNA Midi Kit說明書進(jìn)行分離。mRNA的純化需要用到糖原、NH4OAC及無水乙醇，所用體積分別為2 L、0.5倍體積和2.5倍體積。mRNA與3種藥品混勻，最后通過無水乙醇進(jìn)行清洗則獲得純化的mRNA。

1.2.3病原菌脅迫下黃瓜cDNA初級(jí)文庫(kù)的構(gòu)建。

病原菌脅迫下黃瓜cDNA初級(jí)文庫(kù)構(gòu)建的具體操作按照CloneMiner試劑盒（Invitrogen公司）說明書進(jìn)行，依次完成cDNA第1鏈和第2鏈的合成，cDNA與三框attB1重組接頭連接，cDNA分級(jí)分離及收集，BP重組反應(yīng)和電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B。最終將電轉(zhuǎn)物移至新的15mL離心管中。培養(yǎng)條件為37℃，225～250r/min培養(yǎng)1h，使用涂布棒將培養(yǎng)的菌液涂布于含有Kan抗性的LB培養(yǎng)基平板上進(jìn)行庫(kù)容量的鑒定；剩余培養(yǎng)物按照1∶1的體積加入50%甘油存于-80℃，即為初級(jí)文庫(kù)菌液。

1.2.4病原菌脅迫下黃瓜cDNA次級(jí)文庫(kù)的構(gòu)建。

提取初級(jí)文庫(kù)的質(zhì)粒，進(jìn)行LR重組反應(yīng)體系的建立。反應(yīng)體系中包括初級(jí)文庫(kù)質(zhì)粒、pGADT7-DEST、LRClonaseⅡMix和ddH2O，所用體積分別為1μL（300ng/L）、1μL（300ng/L）、4和14μL；反應(yīng)條件：25℃，16～20h。將LR重組反應(yīng)的產(chǎn)物通過電轉(zhuǎn)化法將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH10B菌株中。最終將電轉(zhuǎn)物移至新的15mL離心管中。培養(yǎng)條件為37℃，225～250r/min培養(yǎng)1h，使用涂布棒將培養(yǎng)的菌液涂布于含有Amp抗性的LB培養(yǎng)基平板上進(jìn)行庫(kù)容量的鑒定；剩余培養(yǎng)物按照1∶1的體積加入50%甘油存于-80℃，即為次級(jí)文庫(kù)菌液。

1.2.5初級(jí)文庫(kù)和次級(jí)文庫(kù)的鑒定。

通過計(jì)算文庫(kù)總CFU、重組率和插入片段長(zhǎng)度對(duì)初級(jí)文庫(kù)和次級(jí)文庫(kù)的質(zhì)量進(jìn)行鑒定。將2個(gè)文庫(kù)的菌液分別進(jìn)行稀釋，每個(gè)文庫(kù)取稀釋好的100倍菌液50L。使用涂布棒在含有Kan抗性和Amp抗性的LB平板上分別進(jìn)行涂布。觀察平板上的克隆數(shù)量，根據(jù)如下公式計(jì)算文庫(kù)總CFU。隨機(jī)選取平板上的克隆，選取24個(gè)進(jìn)行菌落PCR，通過凝膠電泳結(jié)果對(duì)重組率和插入片段長(zhǎng)度進(jìn)行鑒定。

CFU/mL=平板上的克隆數(shù)/50μL×100倍×1×103μL

文庫(kù)總CFU=CFU/mL×文庫(kù)菌液總體積（mL）

1.2.6病原菌脅迫下黃瓜酵母雙雜交文庫(kù)構(gòu)建與鑒定。

次級(jí)文庫(kù)質(zhì)粒的提取使用諾維贊試劑盒，操作流程參照說明書。將次級(jí)文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母Y187菌株中，完成酵母工作液的制備。使用涂布棒將酵母菌液（1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000稀釋液）涂布在SD/-Leu平板上，每個(gè)平板涂布100L稀釋液。培養(yǎng)條件為30℃培養(yǎng)3～6d，檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率。按照“1.2.5”中的公式進(jìn)行庫(kù)容量的計(jì)算。隨機(jī)選取平板上的克隆，選取24個(gè)進(jìn)行菌落PCR，通過凝膠電泳結(jié)果對(duì)重組率和插入片段長(zhǎng)度進(jìn)行鑒定。

2結(jié)果與分析

2.1mRNA與dscDNA的檢測(cè)

黃瓜霜霉病菌和棒孢葉斑病菌脅迫后的12、24、48、72和96h，將黃瓜葉片混合進(jìn)行RNA的提取并進(jìn)行mRNA分離。1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)mRNA，結(jié)果如圖1所示，mRNA在250～2000bp彌散均勻，質(zhì)量好。檢測(cè)dscDNA顯示，彌散區(qū)間較大，質(zhì)量好。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果說明dscDNA可以用于后續(xù)的黃瓜酵母cDNA文庫(kù)的構(gòu)建。

2.2初級(jí)文庫(kù)構(gòu)建與鑒定

將構(gòu)建好的初級(jí)文庫(kù)菌液稀釋100倍后，使用涂布棒將50L菌液涂布于含有Kan抗性的LB培養(yǎng)基平板上進(jìn)行庫(kù)容量的鑒定。如圖2所示，在LB平板上共長(zhǎng)出了1300個(gè)克隆。通過“1.2.5”中的公式進(jìn)行初級(jí)文庫(kù)庫(kù)容量的計(jì)算，結(jié)果為1.04×107CFU。隨機(jī)挑取24個(gè)克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，每個(gè)克隆均有條帶，結(jié)果顯示，重組率達(dá)到100%（圖2），PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，片段在500～2000bp，平均片段長(zhǎng)度大于1000bp，在500～750bp的片段僅1個(gè)。根據(jù)文庫(kù)容量和重組率以及插入片段大小均說明構(gòu)建的初級(jí)文庫(kù)質(zhì)量較好，可以進(jìn)行次級(jí)文庫(kù)的構(gòu)建。

2.3次級(jí)文庫(kù)構(gòu)建與鑒定

將構(gòu)建好的次級(jí)文庫(kù)菌液稀釋100倍后，使用涂布棒將50L菌液涂布于含有Amp抗性的LB培養(yǎng)基平板上進(jìn)行庫(kù)容量的鑒定。如圖3所示，在LB平板上共長(zhǎng)出了1500個(gè)克隆。根據(jù)“1.2.5”中的公式計(jì)算初級(jí)文庫(kù)容量為1.20×107CFU。隨機(jī)挑取24個(gè)克隆進(jìn)行菌落PCR，每個(gè)克隆均有條帶，重組率達(dá)到100%（圖3）。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，平均片段長(zhǎng)度大于1000bp，無低于500bp的條帶。文庫(kù)容量和重組率及插入片段大小均說明次級(jí)文庫(kù)質(zhì)量較好，成功構(gòu)建了次級(jí)文庫(kù)。

2.4病原菌脅迫下黃瓜酵母cDNA文庫(kù)鑒定

將構(gòu)建好的次級(jí)文庫(kù)菌液提取質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化到酵母菌中，酵母菌液進(jìn)行稀釋（1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000稀釋液），取10000倍稀釋液100L用涂布棒涂布在SD/-Leu平板上，30℃培養(yǎng)3～6d，檢測(cè)文庫(kù)滴度。如圖4所示，克隆數(shù)為350個(gè)，根據(jù)“1.2.5”中的公式計(jì)算文庫(kù)滴度為3.5×107CFU/mL。隨機(jī)對(duì)24個(gè)克隆進(jìn)行菌落PCR，每個(gè)克隆均有條帶，重組率達(dá)到100%，所有片段長(zhǎng)度大于750bp，24個(gè)克隆中23個(gè)克隆片段大于1000bp。文庫(kù)容量和重組率及插入片段大小均說明病原菌脅迫下黃瓜酵母雙雜交cDNA文庫(kù)構(gòu)建成功。

3討論與結(jié)論

黃瓜棒孢葉斑病是由多主棒孢霉死體寄生的病原菌侵染引起的一種真菌病害。黃瓜霜霉病是一種由藻物界卵菌門古巴假霜霉菌活體寄生的病原菌侵染引起的卵菌病害。當(dāng)環(huán)境條件適宜時(shí)2種病害發(fā)生嚴(yán)重，且流行速度極快。植物在自然條件下會(huì)遭受多種病原物的侵染，但其對(duì)大多數(shù)病原物侵染都會(huì)呈現(xiàn)出不同的抗性策略。病原物為了能夠成功侵染宿主就會(huì)分泌毒素，突破一系列物理屏障，使植物對(duì)該病原物表現(xiàn)為感病，正是由于這種病原物與植物之間的相互作用形成了植物的先天免疫系統(tǒng)^［19］。

有研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)CsERF004能夠增強(qiáng)黃瓜對(duì)霜霉病和棒孢葉斑病的抗性，同時(shí)增加了水楊酸和乙烯的含量，且使CsPR1和CsPR4上調(diào)表達(dá)^［20］。關(guān)于ERF轉(zhuǎn)錄因子的互作蛋白的研究，有文獻(xiàn)顯示STK 能夠通過磷酸化增強(qiáng) ERF 的活性，使 ERF 表達(dá)，同時(shí)增強(qiáng)ERF激活PR蛋白表達(dá)的活性。Gu等^［21］通過酵母雙雜交的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn) ERF 轉(zhuǎn)錄因子 Pti4 編碼蛋白與 STK 類抗病基因 Pto 編碼蛋白互作，過表達(dá) Pto 能夠使 Pti4 上調(diào)表達(dá)，同時(shí)激活 PR 基因 GluB 和Osm 的表達(dá)。Song 等^［22］研究結(jié)果表明，AtERF7 能夠被絲氨酸、蘇氨酸蛋白激酶 PKS3 磷酸化。

酵母雙雜交cDNA文庫(kù)是一種很好的挖掘互作蛋白，探究調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及解析分子機(jī)理的技術(shù)手段^［23］。黃瓜作物缺乏病原菌脅迫后的酵母雙雜交文庫(kù)的構(gòu)建，進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建將為黃瓜抗霜霉病與棒孢葉斑病雙抗分子機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)。利用Gateway技術(shù)構(gòu)建酵母雙雜交cDNA文庫(kù)對(duì)RNA質(zhì)量的要求高，但在后續(xù)篩選互作蛋白過程中既可以使用Mating法又可以使用共轉(zhuǎn)法，有利于互作蛋白篩選的順利進(jìn)行。由于Smart技術(shù)后續(xù)篩庫(kù)中只能利用Mating的方法，對(duì)于篩庫(kù)的成功率不敢保證，因此筆者選用Gateway方法進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建^［14］。通過對(duì)高代抗病自交系D9320接種黃瓜霜霉病菌和棒孢葉斑病菌后的黃瓜葉片不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取材，混合樣品進(jìn)行RNA的提取、mRNA分離。mRNA和ds cDNA電泳結(jié)果彌散均勻，質(zhì)量好。初級(jí)文庫(kù)庫(kù)容量為1.04×107 CFU，次級(jí)文庫(kù)庫(kù)容量為1.20×107 CFU，且重組率均達(dá)到100%，插入片段均大于1 000 bp。轉(zhuǎn)化酵母菌后，100 μL 10 000倍酵母稀釋液克隆數(shù)為350個(gè)，文庫(kù)滴度為3.5×107 CFU/mL，重組率達(dá)到100%，所有片段長(zhǎng)度大于750 bp，24個(gè)克隆中23個(gè)克隆片段大于1 000 bp。這說明該研究中構(gòu)建的霜霉病菌和棒孢葉斑病菌脅迫下的黃瓜酵母雙雜交cDNA文庫(kù)質(zhì)量高。

該研究完成了黃瓜霜霉病菌和棒孢葉斑病菌脅迫下的黃瓜酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的構(gòu)建，下一步將進(jìn)行互作蛋白的篩選，研究抗病基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，解析黃瓜抗霜霉病和棒孢葉斑病雙抗分子機(jī)理，為黃瓜抗病育種提供理論基礎(chǔ)。

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