摘要以秦?zé)?號(hào)無菌幼苗為供試材料克隆出HSP18.1基因的CDS區(qū)，構(gòu)建重組質(zhì)粒，對(duì)該基因蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)條件優(yōu)化，通過生物信息學(xué)分析，研究其在不同組織中非生物脅迫表達(dá)。結(jié)果表明：該基因?qū)儆贖SP20家族，全長(zhǎng)615bp，CDS全長(zhǎng)579bp，編碼192個(gè)氨基酸，且含多個(gè)磷酸化和糖基化位點(diǎn)，二級(jí)結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主；煙草HSP18.1蛋白與擬南芥HSP18.1蛋白同源，且與多個(gè)蛋白相互作用。系統(tǒng)發(fā)育表明，煙草HSP18.1與文冠果的親緣關(guān)系較近，與小米椒的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；在熱脅迫下NtHSP18.1基因在根、莖葉中被強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)，表明NtHSP18.1基因是調(diào)節(jié)植物耐熱性的關(guān)鍵。

關(guān)鍵詞煙草；HSP18.1基因；生物信息學(xué)；蛋白誘導(dǎo)表達(dá)；熱脅迫

中圖分類號(hào)S572"文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A"文章編號(hào)0517-6611（2025）01-0113-10

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.01.023

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

CloningandExpressionAnalysisofTobacco"HSP18.1"GeneUnderAbioticStress

LIUChen，WEIJin-bin，SONGKaietal

（TechnologyCenter，GansuTobaccoIndustryCo.，Ltd.，Lanzhou，Gansu730050）

AbstractTheCDSregionof"HSP18.1"genewasclonedfromthesterileseedlingofQinyanNo.""andtherecombinantplasmidwasconstructedtoinducetheexpressionofthegeneproteinandoptimizetheexpressionconditions.Bybioinformaticsanalysis，theabioticstressexpressionofthegeneindifferenttissueswasinvestigated.Theresultsshowedasfollows："thisgenebelongstotheHSP20family，withatotallengthof615bpandatotallengthof579bpforCDS，encoding192aminoacids，andcontainingmultiplephosphorylationandglycosylationsites，andthesecondarystructureismainlyrandomcurling;tobaccoHSP18.1proteinishomologoustoArabidopsisHSP18.1proteinandinteractswithmultipleproteins.PhylogeneticresultsshowedthattobaccoHSP18.1wascloselyrelatedtothefruit，butfarrelatedtothemilletpepper.Theexpressionof"NtHSP18.1"genewasstronglyinducedinroots，stemsandleavesunderheatstress，indicatingthat"NtHSP18.1"geneisthekeytoregulateplantheattolerance.

KeywordsTobacco;HSP18.1"gene;Bioinformatics;Proteininducedexpression;Heatstress

基金項(xiàng)目中煙實(shí)業(yè)科技項(xiàng)目（ZYSY-2022-4）。

作者簡(jiǎn)介劉晨（1987—），男，山東齊河人，工程師，碩士，從事煙草分子生物學(xué)與微生物學(xué)研究。*通信作者：張建棟，工程師，從事煙草工程研究；王禎，工程師，碩士，從事煙草微生物學(xué)研究。

煙草（ Nicotiana tabacum ）是一種異源四倍體（ 2n =48），起源于絨毛狀煙草（ Nicotiana tomentosiformis ）（ 2n =24）和美花煙草（ Nicotiana sylvestris ）（ 2n =24）種內(nèi)雜交后的加倍染色體^［1］。煙草是茄科重要的經(jīng)濟(jì)作物，在 120 多個(gè)國家種植，為世界各國的經(jīng)濟(jì)發(fā)展作出了重大貢獻(xiàn)^［2］。然而，煙草在生長(zhǎng)發(fā)育過程中經(jīng)常受到各種生物和非生物脅迫的影響，如干旱、病原菌、寒冷、高溫、重金屬等^［3］，這些壓力會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育不良、衰老、產(chǎn)量降低，甚至死亡^［4］。然而，由于缺乏完整注釋的參考基因組，在煙草中許多的基因功能仍未得到探索。

小分子熱激蛋白（sHSPs）在植物中含量豐富，種類以及功能多樣，是一類重要的脅迫誘導(dǎo)蛋白，在逆境脅迫下的表達(dá)增強(qiáng)可提高植物抗御各種逆境因子脅迫的能力。一般來說，根據(jù)分子量和序列同源性，HSP可分為5個(gè)蛋白質(zhì)家族：HSP100s/ClpB、HSP90s、HSP70s/DnaK、HSP60s和HSP20s^［5］。HSP20又稱為小HSP（sHSP），其分子量在12～42 kD^［6］。通常，HSP20 以不依賴于 ATP 的方式捕獲底物蛋白，并防止應(yīng)激變性蛋白的不可逆聚集^［7］。HSP20 序列包含中央保守結(jié)構(gòu)域、α-晶狀體蛋白結(jié)構(gòu)域（ACD），其兩側(cè)是可變的 N 端區(qū)域和短的 C 端延伸^［8］。ACD是HSP20的標(biāo)志結(jié)構(gòu)域，含有80～100個(gè)氨基酸，其在植物中的結(jié)構(gòu)是β-三明治，包括反向平行方向的三鏈和四鏈以及延伸鏈^［9］。與其他 HSP 家族不同，HSP20 家族在植物界變異性更大，且趨于分化^［9］。根據(jù)亞細(xì)胞位置，HSP20蛋白可分為12個(gè)亞家族（CI、CII、CIII、CIV、CV、CVI、CVII、MI、MII、ER、P和Po）^［9］。Hsp20也是植物中變異最大、最多樣化的家族之一，被認(rèn)為是許多高等植物在熱應(yīng)激條件下產(chǎn)生最多的蛋白質(zhì)之一。植物 sHSP 的體內(nèi)功能很大程度上未知，很少有研究證明其作為體外分子伴侶的功能^［10］。由于植物在生長(zhǎng)季節(jié)甚至白天經(jīng)常暴露在次優(yōu)的環(huán)境條件下，因此它們必須形成保護(hù)機(jī)制。由于其豐富度（高達(dá)總蛋白的 1%），sHSP 被認(rèn)為直接參與其中體內(nèi)耐熱性，并且熱休克轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)失調(diào)導(dǎo)致組成型 sHSP 表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物確實(shí)表現(xiàn)出增強(qiáng)的耐熱性^［11］。植物 sHSP的大小為 200～240 kD，未證明磷酸化作用，豌豆 HSP18.1 由排列成球狀結(jié)構(gòu)的 12 個(gè)亞基組成^［12］，豌豆 HSP18.1蛋白已被證明可以結(jié)合其表面的熱變性蛋白，并將其保持可折疊狀態(tài)。

目前國內(nèi)對(duì)煙草NtHSP18.1基因的研究鮮見報(bào)道。因此，為了研究植物sHSP的行為，筆者克隆了煙草NtHSP18.1，它是sHSP胞漿I類家族的成員，在成熟煙草花粉粒中微弱表達(dá)，并在體外花粉胚胎發(fā)生過程中由饑餓應(yīng)激誘導(dǎo)。筆者首先克隆了該基因，在大腸桿菌中過表達(dá)NtHSP18.1蛋白，確認(rèn)該蛋白原核生物重組表達(dá)的可行性，為后續(xù)對(duì)NtHSP18.1蛋白離體研究提供理論基礎(chǔ)，并通過生物信息學(xué)分析了該基因編碼蛋白的基本性質(zhì)。該研究結(jié)果可為煙草NtHSP18.1基因功能鑒定提供參考，為進(jìn)一步提高煙草抗逆性研究提供參考。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)所用煙草（秦?zé)?號(hào)）來自甘肅煙草工業(yè)有限責(zé)任公司生物實(shí)驗(yàn)室，基因克隆所用材料為無菌苗幼葉。

1.2方法

1.2.1"HSP18.1基因克隆。

取煙草（秦?zé)?號(hào)）葉片不同部位剪取小塊組織約0.2g，加無菌水清洗1遍，保存于液氮中，用于總RNA的提取。

總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄：采用Trizol法提取煙草葉片的總RNA^［13］，然后參照cDNA合成試劑盒的方法，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及cDNA合成。

在煙草基因組數(shù)據(jù)庫下載HSP18.1基因的編碼序列（codingsequence，CDS），設(shè)計(jì)特異性引物，上、下游引物hsp18-F、hsp18-R序列分別為GAATTCAATGTCTCTTATCCCAAGCATTTTCGGTGG、CTCGAGGTGGTGGTGGTGACCAG-ATATCTCAATGGCTTT。以煙草幼苗cDNA為模板，利用特異引物擴(kuò)增目的基因，通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)目的基因，PCR反應(yīng)總體系為30μL，其中LATAQPCRMix10μL，PrimerMix2μL，Nuclease-freewater3μL，cDNA模板5μL，用ddH2O補(bǔ)充至30μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3min，95℃變性30s，55℃退火40s，72℃延伸1min；40個(gè)循環(huán)，最終72℃延伸10min。將上述目標(biāo)CDS擴(kuò)增產(chǎn)物通過膠回收試劑盒對(duì)目的基因進(jìn)行純化回收，將純化后的目的片段連接至T載體，利用熱激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入DH5α大腸桿菌（Escherichiacoli），通過藍(lán)白斑篩選，獲得陽性克隆，進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)并測(cè)序，合適序列用于后期序列分析。

1.2.2"HSP18基因重組質(zhì)粒構(gòu)建。

先將目的基因產(chǎn)物純化后，連接到pMD-19T載體，轉(zhuǎn)化篩選陽性克隆并測(cè)序。再將載體pET22b-HIS（圖1）和攜帶有HSP18目的基因的pMD-19T載體用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoI酶切90min，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收純化目的基因片段和質(zhì)粒骨架，在T4連接酶作用下16℃連接過夜。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10克隆宿主感受態(tài)細(xì)胞，在氨芐青霉素抗性平板上篩選陽性克隆轉(zhuǎn)化子。最后挑取轉(zhuǎn)化子，并提取質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主BL21（DE3）與Rosetta（DE3），對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行平板篩選和測(cè)序。

1.2.3rHSP18.1的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)條件優(yōu)化。

用LB氨芐青霉素平板活化重組菌株，分別挑取BL21（DE3）與Rosetta（DE3）單菌落接入2mL含有終濃度50μg/mL氨芐青霉素的LB試管中，培養(yǎng)15h后再按2%接種量轉(zhuǎn)接于5mLLB發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃200r/min培養(yǎng)至OD600約為0.8后，用不同濃度的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，分別添加終濃度為0.5、1.0mmol/LIPTG，30℃200r/min誘導(dǎo)12h后，離心12000g×30s收獲沉淀菌泥，進(jìn)行SDS-PAGE、WesternBlot分析，WesternBlot檢測(cè)中使用上海生工Anti-HisTag抗體特異性檢測(cè)帶有Histag的rHSP18.1目標(biāo)蛋白，以確認(rèn)目標(biāo)蛋白是否表達(dá)。

1.2.4"HSP18.1編碼蛋白的基本結(jié)構(gòu)分析。

通過Expasy平臺(tái)的ProtParam tool工具對(duì) HSP18.1 基因編碼蛋白的基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析。根據(jù)Relative mutability參數(shù)，Zimmerman方案，Hopp amp; Woods方案，Transmembrane tendency參數(shù)，Average flexibility參數(shù)，Janin方案，預(yù)測(cè)蛋白相對(duì)突變性、極性、親水性、跨膜性、柔韌性、可及性理化性質(zhì)等一級(jí)結(jié)構(gòu)。通過NPS@：GOR4軟件（https：∥npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/-npsa_automat.pl？page=npsa_gor4.html）預(yù)測(cè)該基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；TMHMM-2.0（https：∥services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）在線網(wǎng)站用于預(yù)測(cè)該基因編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域；SignalP 5.0（https：∥services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）用于預(yù)測(cè)編碼蛋白的信號(hào)肽；利用 Scratch Protein Predictor 軟件的Dlp功能對(duì)該蛋白的二硫鍵進(jìn)行預(yù)測(cè)；運(yùn)用NetPhos 3.1（https：∥services.healthtech.dtu.dk/service.php？NetPhos-3.1）在線軟件對(duì)磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測(cè)；NetOGlyc 4.0（https：∥services.healthtech.dtu.-dk/service.php？NetOGlyc-4.0）用于預(yù)測(cè)糖基化位點(diǎn)。在NCBI的功能界面 CDD 網(wǎng)站（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/-cdd/wrpsb.cgi）對(duì) HSP18.1 基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了預(yù)測(cè)。通過 SWISSMODEL（https：∥swissmodel.expasy.org/）對(duì) HSP18.1 基因編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模^［14］。蛋白互作分析借助String（https：∥cn.string-db.org/）在線網(wǎng)址，以擬南芥已知網(wǎng)絡(luò)為基礎(chǔ)。通過DNAMAN進(jìn)行多序列比對(duì)，并使用MEGA-X 軟件的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，重復(fù)次數(shù)為1 000，分析其進(jìn)化關(guān)系^［15］。

1.2.5"HSP18.1基因非生物脅迫下表達(dá)分析。

試驗(yàn)所用材料種植于試驗(yàn)基地，在這項(xiàng)研究中使用煙草作為研究材料。將100粒種子浸入溫水中，在55℃無菌水中放置20min，然后轉(zhuǎn)移到28℃室溫水中4h，在28℃暗室中發(fā)芽1d。將發(fā)芽的種子播種在帶有底物（蛭石∶珍珠巖∶園土=1∶1∶1）的50孔育苗盤中。播種后，將種子放入光箱中生長(zhǎng)［相對(duì)濕度70%，光照/黑暗16h/8h；白天/晚上溫度28℃/18℃；光照強(qiáng)度190～600μmol/（m2·s）］。當(dāng)煙草幼苗長(zhǎng)到四葉一心時(shí)，將其進(jìn)行脅迫處理。低溫處理：在4℃下進(jìn)行處理。SA和ABA脅迫：100μmol/LABA與SA。干旱處理：20%PEG。在脅迫處理后的0、3、6、9、12和24h取煙草幼苗的葉。對(duì)于熱脅迫，在熱應(yīng)激處理（42℃）后的0、3、6、9、12和24h取煙草幼苗的根、莖和葉。3個(gè)獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)包含3～6個(gè)單獨(dú)的煙草植株樣品。樣品液氮速凍后-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，用于后期RNA提取，反轉(zhuǎn)錄及目的基因的克隆、生物信息學(xué)分析及qRT-PCR分析。

使用RNeasy mini試劑盒（QIAGEN，Hilden，德國）從收集的樣品中提取總RNA。使用不含RNase的DNase I試劑盒（Qiagen，Hilden，德國）去除基因組DNA污染。RNA濃度和質(zhì)量用NanoDrop1 000分光光度計(jì)（Wilmington，DE，USA）測(cè)定。使用Superscript III First-Strand cDNA合成試劑盒（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA），每個(gè)樣品使用1 μg總RNA進(jìn)行第一鏈cDNA 合成。對(duì)于定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）分析，使用 Primer 5軟件設(shè)計(jì)基因特異性引物^［16］。番茄的18S rRNA被用作標(biāo)準(zhǔn)化參考。實(shí)時(shí)PCR分析使用Lightcycler96SW1.1 儀器（Roche，德國）在 96 孔板上進(jìn)行，采用 SYBR Green PCR試劑盒（Qiagen，Hilden，德國）。反應(yīng)體系：10 μL "iTaq ^TM，75～80 ng/μL cDNA，正向和反向引物各2 μL和7 μL雙蒸餾水組成，總共體積為20 μL。qPCR條件：在95 ℃" 初始變性5 min，然后在94 ℃下40個(gè)循環(huán)10 s，在58 ℃退火10 s，在72 ℃延伸15 s。每個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量由2^-ΔΔCt方法確定。對(duì)于脅迫處理，相對(duì)表達(dá)值相對(duì)于0 h收獲的葉片樣品值進(jìn)行了歸一化處理。相對(duì)表達(dá)數(shù)據(jù)的顯著差異用 SPSS 進(jìn)行分析。

2結(jié)果與分析

2.1"HSP18.1基因的克隆

以煙草葉片為材料提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用1%瓊脂糖凝膠電泳，在500～750bp有1條清晰明亮的條帶（圖2），條帶經(jīng)回收純化后送樣測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果用DNAMAN進(jìn)行分析并翻譯成蛋白序列。同時(shí)，在NCBI網(wǎng)站上分析序列。結(jié)果顯示，該基因全長(zhǎng)為615bp，其中CDS長(zhǎng)579bp，編碼192個(gè)氨基酸。

2.2rHSP18.1的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)條件優(yōu)化

對(duì)E.coli"BL21/RosettapET22b-HIS和構(gòu)建的重組菌株進(jìn)行粗酶液的SDS-PAGE（圖3）、WesternBlot（圖4）分析驗(yàn)證。與空白組1號(hào)泳道誘導(dǎo)0h對(duì)比，重組菌E.coli"BL21/pET22b-HSP18.1-HIS、Rosetta/pET22b-HSP18.1-HIS分別在約25kD處有1條明顯的特征條帶，該條帶表明基因NtHSP18.1編碼的HSP18.1蛋白在大腸桿菌中成功表達(dá)。

將BL21與Rosetta表達(dá)結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，Rosetta作為表達(dá)宿主，會(huì)使HSP18.1的表達(dá)量更高，將Rosetta與BL21宿主比較，可知Rosetta系列菌株來源BL21系列宿主菌，Rosetta系列菌株含有原本在大腸桿菌中稀少的真核細(xì)胞密碼子，可以增加來源于真核細(xì)胞蛋白的表達(dá)水平。一定程度上也說明了表達(dá)的HSP18.1蛋白的DNA序列可以通過密碼子優(yōu)化繼續(xù)提升蛋白表達(dá)水平。

2.3HSP18.1蛋白結(jié)構(gòu)分析

2.3.1一級(jí)結(jié)構(gòu)。

MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAMDIGI-

NSDPNSMSLIPSIFGGRRSNVFDPLSLDMWDPFEGFPLSSNLV-

NVPSSARETSAFANARIDWKETPEAHVFKAYLPGLKKEEVK-

VEVEEGKVLQISGETSKEQEEKNEQWHRVERSSGKFLRRFR-

LPENAKMDQVKASMENGVLTVTVPKEEVKKPEVKANEISG。

該研究對(duì)煙草HSP18.1基因及編碼的蛋白序列進(jìn)行了分析，如圖5所示。預(yù)測(cè)顯示，該基因共編碼192個(gè)氨基酸，分子量為21345.38，等電點(diǎn)為5.59，帶負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)（Asp+Glu）為28，帶正電荷殘基數(shù)（Arg+Lys）為25個(gè)；其分子式為C947H1511N257O289S7，原子數(shù)為3011個(gè)，不穩(wěn)定指數(shù)為50.87，脂肪酸指數(shù)為79.74；當(dāng)所有的半胱氨酸均形成胱氨酸時(shí)，消光系數(shù)為19480mol/L，相應(yīng)的吸光值為0.913，脂肪族氨基酸指數(shù)為50.87。疏水性指數(shù)為-0.440。此外，對(duì)編碼的氨基酸組成進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)該基因編碼19種氨基酸，其中谷氨酸、亮氨酸與絲氨酸比例最高，分別為109%、8.9%與8.9%，組氨酸與酪氨酸的比例最小，均為1.0%。

Expasy在線軟件預(yù)測(cè)了相對(duì)突變性（relativemutability），發(fā)現(xiàn)該值位于51.0333～108.8890（圖6A），即該蛋白高突變區(qū)位于31～149位氨基酸；可及性得分位于0.058～34646（圖6B），由此可知該蛋白高極性區(qū)位于12～135位氨基酸；Hoppamp;Woods評(píng)分顯示，該值-1.022～2.078（圖6C），因此該蛋白高親水性區(qū)域位于21～131位氨基酸；跨膜趨勢(shì)值（Transmembranetendency）-2.647～0.957（圖6D），可得到跨膜區(qū)間位于12～132位氨基酸；平均柔韌性（averageflexibility）值在0.397～0.496（圖6E），因此其高柔韌性區(qū)域在19～127位氨基酸；Janin方案評(píng)分在-0.922～0.389（圖6F），其高可及性區(qū)位于12～132位氨基酸之間。

2.3.2二級(jí)結(jié)構(gòu)分析預(yù)測(cè)。

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要指肽鏈中的主鏈借助氫鍵有規(guī)則地卷曲折疊成沿一維方向具有周期性結(jié)構(gòu)的構(gòu)象，如圖7所示。該預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、延伸連與無規(guī)則卷曲組成。其中，無規(guī)則卷曲占比最多，為48.44％，其組成的氨基酸為79個(gè)，其組成的突出區(qū)域?yàn)?1～77；其次為α-螺旋，為41.15%，79個(gè)氨基酸，其較突出部位在7～22；最后為延伸連，僅10.42%，由20個(gè)氨基酸組成。這暗示 HSP18.1 基因編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)元件為無規(guī)則卷曲與α-螺旋。按照Skolnick等^［17-19］報(bào)道的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分型標(biāo)準(zhǔn)， HSP18.1 基因編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)可歸為混合型。

在TMHMM-2.0（https：∥services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)了該基因編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示：192個(gè)氨基酸均位于細(xì)胞膜外，不存在跨膜結(jié)構(gòu)域（圖8）。

SignalP5.0（https：∥services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）用于預(yù)測(cè)編碼蛋白的信號(hào)肽，如圖9所示，該蛋白在22和23號(hào)氨基酸間存在信號(hào)肽，其可能性為0.9986。利用ScratchProteinPredictor軟件的Dlp功能對(duì)該蛋白的二硫鍵進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，由于該序列中存在少于2個(gè)的半胱氨酸，因此不能形成二硫鍵。

2.3.3"HSP18.1基因編碼蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)。

在NCBI的功能界面CDD網(wǎng)站（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd-/wrpsb.cgi）對(duì)HSP18.1基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該蛋白在86～177號(hào)氨基酸存在ACD結(jié)構(gòu)域（圖10），屬于HSP26亞家族，該亞家族是HSP20家族的成員之一。

2.3.4蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)與糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)。

運(yùn)用NetPhos3.1（https：∥services.healthtech.dtu.dk/service.php？NetPhos-3.1）在線軟件對(duì)煙草HSP18.1蛋白的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測(cè)。如圖11所示，該序列上的24個(gè)氨基酸具有磷酸化的可能性，其中絲氨酸（Ser）位點(diǎn)16個(gè)，蘇氨酸（Thr）位點(diǎn)8個(gè)，而NetOGlyc4.0（https：∥services.healthtech.dtu.dk/service.php？-NetOGlyc-4.0）結(jié)果顯示，該蛋白含有23個(gè)糖基化位點(diǎn)，分別位于第7、29、33、35、39、46、53、66、67、74、75、79、80、92、123、126、127、143、144、165、172、174與191號(hào)氨基酸上。

2.3.5"HSP18.1基因編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

借助SWISS-Model軟件，預(yù)測(cè)了HSP18.1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。如圖12所示，共出現(xiàn)4種模型，其中以K4AIN9.1.A為模板的模型可靠度最高，其相似程度達(dá)到75.90%，暗示該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)較為簡(jiǎn)單。其中，無規(guī)則卷曲占比最多，該結(jié)構(gòu)對(duì)其生物學(xué)功能的發(fā)揮起著關(guān)鍵作用。

2.3.6蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖分析。

該研究基于已知的擬南芥互作網(wǎng)絡(luò)圖（圖13），預(yù)測(cè)了煙草HSP18.1蛋白互作的關(guān)鍵蛋白，發(fā)現(xiàn)煙草HSP18.1蛋白與擬南芥HSP18.1蛋白同源，而HSP18.1蛋白與10個(gè)蛋白（HSP90-1、HSP70-5、HSP70-8、HSP70-4、HSFA1A、HSA32、APX2、HSFA2、HSFA3、CLPB1）相互作用，暗示其復(fù)雜的調(diào)控作用。

2.3.7序列比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建。

利用已知的序列信息，進(jìn)行了該蛋白的序列比對(duì)分析，如圖14所示，該蛋白的氨基酸序列存在高度保守性，說明該基因在進(jìn)化過程中具有穩(wěn)定的功能。該研究基于MEGA軟件的鄰近法，構(gòu)建了NtHSP18.1蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，如圖15所示，其與NtHSP18.2的序列相似程度最高。就物種間比較發(fā)現(xiàn)，其與文冠果（Xanthocerassorbifolium）間的親緣關(guān)系最近，與小米椒（Capsicum"frutescens）的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.4非生物脅迫下表達(dá)模式的分析

此外，研究了煙草幼苗中該基因?qū)?種脅迫的響應(yīng)（圖16）。在20%PEG6000處理的葉中，該基因呈先升高后下降的表達(dá)趨勢(shì)，并在處理后3h相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大值，是CK（0h）的9倍。在4℃低溫處理中，該基因的相對(duì)表達(dá)量在9h達(dá)到最大值，其余時(shí)間點(diǎn)均低于CK，說明該基因參與低溫調(diào)控。該基因在100μmol/L水楊酸處理后，呈增大—減小—增大—減小的表達(dá)模式，并在處理后6h相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大值，為11.38。同時(shí)觀察到該基因在水楊酸處理下的相對(duì)表達(dá)量均高于CK（0h），說明該基因在水楊酸處理的葉中發(fā)揮正調(diào)控作用。在100μmol/L脫落酸處理下，該基因呈增大—減小—增大的表達(dá)模式，且在處理后24h相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大值，為5.53。且在脫落酸處理下該基因的相對(duì)表達(dá)量也均高于CK（0h），說明該基因在脫落酸處理的葉中發(fā)揮正調(diào)控作用。

在42℃熱脅迫下，NtHSP18.1基因在根、莖與葉中均呈先增后減的表達(dá)模式，根與莖中表達(dá)量在處理后9h達(dá)到最大值，分別為CK（0h）的6.40倍與5.41倍，葉中在處理后6h達(dá)到最大值，為CK的7.6倍，說明NtHSP18.1基因在熱處理中起正調(diào)控作用（圖17）。

3討論

NtHSP18.1屬于HSP20中的成員之一，HSP20作為分子伴侶，是原核生物和真核生物中普遍存在的蛋白家族，也是植物中最豐富的熱休克蛋白家族之一^［5］。隨著植物基因組和轉(zhuǎn)錄組的可用性不斷增加，已經(jīng)從一些單子葉植物和雙子葉植物中鑒定出了 HSP20 基因，如擬南芥^［20］、馬鈴薯^［21］、蘋果^［22］和水稻^［23］。然而，目前尚未對(duì)煙草的 HSP20 基因進(jìn)行全面鑒定和表征。該研究從煙草中克隆獲得了1個(gè) HSP20 轉(zhuǎn)錄因子家族成員基因 NtHSP18.1 。經(jīng)PCR擴(kuò)增和測(cè)序鑒定后對(duì) NtHSP18.1 的核苷酸和氨基酸序列Blast比對(duì)表明，其與 NtHSP18.2 同源相似性最高，系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析表明，該基因在多個(gè)物種中含有高度保守的α-晶狀體蛋白結(jié)構(gòu)域（ACD），因此該基因?qū)儆贖SP20轉(zhuǎn)錄因子家族成員。ACD是HSP20的標(biāo)志結(jié)構(gòu)域，含有80～100個(gè)氨基酸，其在植物中的結(jié)構(gòu)是β-三明治，包括反向平行方向的三鏈和四鏈及延伸鏈^［9］?；蛲ㄟ^相互作用網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)功能和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。因此，研究與基因家族相關(guān)的潛在相互作用網(wǎng)絡(luò)有助于了解它們的功能^［24］。在該研究中 NtHSP18.1 基因受多個(gè)基因的調(diào)節(jié)，因此該基因可能參與復(fù)雜的生物學(xué)過程。此外，通過大腸桿菌可實(shí)現(xiàn) NtHSP18.1 基因的體外重組表達(dá)。作為真核來源的 NtHSP18.1 基因，其在原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行體外重組表達(dá)時(shí)，可選擇更利于真核來源基因表達(dá)的宿主細(xì)胞，如含有原本在大腸桿菌中稀少的真核細(xì)胞密碼子Rosetta系列菌株，或者選擇一些真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，并根據(jù)宿主的密碼子偏好性，針對(duì)性地進(jìn)行密碼子的優(yōu)化，可提高其蛋白的表達(dá)量。通過有利的體外重組表達(dá)，可實(shí)現(xiàn)NtHSP的進(jìn)一步研究和應(yīng)用。

許多HSP20可以形成高分子量的寡聚體，并參與維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，使植物獲得性 HSP20 基因可能導(dǎo)致不同的應(yīng)激^［22］。如大多數(shù)非洲狗牙 CtHSP20s 基因在干旱、低溫與鹽脅迫下差異表達(dá)^［25］。馬鈴薯中14個(gè) StHsp20 基因（ StHsp20 -4，6、7、9、20、26、33、34、35、37、41、43、44和46）在干旱與鹽脅迫下顯著上調(diào)^［21］。此外，該研究也證明， NtHSP18.1 基因在在干旱、低溫、激素處理下其表達(dá)量均發(fā)生顯著變化，其可能參與這些生物與非生物調(diào)節(jié)過程。該研究結(jié)果可為煙草抗逆研究提供理論依據(jù)。此外， HSP20 家族基因在耐熱性的形成中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用^［26］。如，辣椒和蘋果物種中的大多數(shù) HSP20 基因是由熱應(yīng)激誘導(dǎo)的^［22］。其他研究已經(jīng)驗(yàn)證了轉(zhuǎn)基因植物中熱休克蛋白的耐熱性。毛果楊 "HSP20基因PtHSP17.8 參與耐熱性^［27］。水稻HSP20蛋白 sHsp17.7 賦予轉(zhuǎn)基因水稻植物耐熱性^［28］。過表達(dá)玉米 HSP20基因ZmHSP16.9 的轉(zhuǎn)基因煙草表現(xiàn)出增強(qiáng)的耐熱性^［29］。該研究也表明在熱脅迫下 NtHSP18.1 基因在根、莖和葉中被強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)，總體來說，這些研究表明 NtHSP18.1 基因是調(diào)節(jié)植物耐熱性的關(guān)鍵。

4結(jié)論

該研究在煙草中克隆了HSP18.1基因，分析表明該基因全長(zhǎng)615bp，CDS全長(zhǎng)579bp，編碼192個(gè)氨基酸，含有多個(gè)磷酸化和糖基化位點(diǎn)，二級(jí)結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主。三級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)較為簡(jiǎn)單，其中無規(guī)則卷曲占比最多，該結(jié)構(gòu)對(duì)其生物學(xué)功能的發(fā)揮起著關(guān)鍵作用。蛋白互作分析表明，煙草HSP18.1蛋白與擬南芥HSP18.1蛋白同源，且與多個(gè)蛋白相互作用。系統(tǒng)發(fā)育表明，煙草HSP18.1與文冠果的親緣關(guān)系較近，與小米椒的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。在熱脅迫下NtHSP18.1基因在根、莖和葉中被強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)，表明NtHSP18.1基因是調(diào)節(jié)植物耐熱性的關(guān)鍵。

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