摘要［目的］比較優(yōu)化適用于多種甲殼動物血細胞分析的流式方法和分類標(biāo)準(zhǔn)。［方法］對比分析了圖像流式細胞術(shù)和顯微觀察法在三疣梭子蟹和口蝦蛄2種海產(chǎn)甲殼動物血細胞分類中的應(yīng)用。［結(jié)果］顯微觀察參考可辨的胞內(nèi)顆粒，從2種動物血細胞中區(qū)分出無顆粒細胞、小顆粒細胞及大顆粒細胞3種，但分類標(biāo)準(zhǔn)主觀性較強，批次統(tǒng)計波動相對較大；流式測量以更加客觀的側(cè)向散射強度和面積測量值為標(biāo)準(zhǔn)，將血細胞清晰分為無顆粒、小顆粒、中顆粒和大顆粒細胞4類，其中無顆粒細胞占比均在30%左右，含有顆粒的細胞占比較大，總體與顯微觀察結(jié)果相近。從細胞大小來看，2種方法呈現(xiàn)出一致的分析結(jié)果，一方面從無顆粒細胞到大顆粒細胞，呈現(xiàn)逐漸增大的特征；另一方面，口蝦蛄的各類血細胞均大于三疣梭子蟹的血細胞。［結(jié)論］2種方法評價標(biāo)準(zhǔn)既有區(qū)別又有聯(lián)系，因此結(jié)果相近；在適用范圍方面具有一定的互補性，流式測量能區(qū)分4類細胞，而且通量高，適合大量樣本的精細分析。

關(guān)鍵詞三疣梭子蟹；口蝦蛄；血細胞；流式細胞術(shù)；分類

中圖分類號S917.4"文獻標(biāo)識碼A"文章編號0517-6611（2025）01-0102-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.01.021

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

HemocytesClassificationof"Portunustrituberculatus"and"Oratosquillaoratoria"byImagingFlowCytometry

KONGLei，CHENYu-xiang，CUIYu-chenetal

（CollegeofLifeScience，TianjinNormalUniversity/TianjinKeyLaboratoryofAnimalandPlantResistance，Tianjin300387）

Abstract［Objective］Tooptimizeflowcytometrybasedmethodsandstandardsforcrustaceanbloodcellclassification.［Method］Imagingflowcytometryandmicroscopicobservationwerecomparedonbloodcellclassificationof"Portunustrituberculatus"and"Oratosquillaoratoria.［Result］Threecelltypescouldbeseparatedfrombothanimalsbasedonmicroscopicobservation，whichreferredtothedifferencesofdistinguishableintracellularparticles，buttheresultswerefluctuatedbybatch.Flowcytometry，basedonmoreobjectivemeasurementofintensityandareaofsidescattering，couldclearlydividebloodcellsintofourpopulationsofnon-granularhemocyte（NG），small-granularhemocyte（SG），intermediate-granularhemocyte（MG），andlarge-granularhemocyte（LG）.Accordingtoflowcytometrymeasurement，about30%werenon-granularhemocytesinbothanimals，cellswithrefractivestructurescountforthemainpartofwholebloodcells，whichwassimilartothatofmicroscopicobservationresults.Intermsofcellsize，bothmethodsshowedthesameresults.Ononethehand，cellsizeincreasedgraduallyfromnon-granularhemocytetolarge-granularhemocyte;Ontheotherhand，allhemocytesof"Oratosquillaoratoria"werelargerthanthosein"Portunustrituberculatus.［Conclusion］Microscopicobservationandflowcytometrywerecomplementarityforeachother;flowcytometrycoulddistinguishmorecellpopulations，wasmorereliableduetoitsobjectivity，andsuitableforhighthroughputfineanalysis.

Keywords"Portunustrituberculatus;Oratosquillaoratoria;Hemocyte;Flowcytometry;Classification

基金項目天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃項目（19JCYBJC29700，15JCZDJC33800）；天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室開放基金項目（TJAE2015005）。

作者簡介孔磊（2000—），女，山東菏澤人，碩士研究生，研究方向：水生生物學(xué)。*通信作者，副教授，從事水生生物學(xué)研究。

甲殼類（Crustacea）屬于節(jié)肢動物（Arthropoda）中的一個重要的亞門，大多生活在水環(huán)境內(nèi)，以海水中為主，日常食用的各種蝦、蟹都是其典型代表。三疣梭子蟹（ Portunus trituberculatus ）和口蝦蛄（ Oratosquilla oratoria ）是軟甲綱中2種經(jīng)濟價值較高的海產(chǎn)甲殼動物。前者屬于十足目（Decapoda）梭子蟹科（Portunidae）梭子蟹屬（ Portunus ），俗稱梭子蟹、槍蟹、海蟹以及門蟹等，廣泛分布在中國、日本、朝鮮、馬來群島和紅海等海域^［1］。后者常被稱為爬蝦、皮皮蝦、螳螂蝦等，屬于口足目（Stomatopoda）蝦蛄科（Squillidae）口蝦蛄屬（ Oratosquilla ），多沿俄羅斯、中國、日本、韓國與越南一線以及澳大利亞近海分布^［2］。梭子蟹和口蝦蛄味道鮮美，富含蛋白質(zhì)，具有較高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值^［3］。隨著口蝦蛄等甲殼動物人工培育技術(shù)的發(fā)展^［4］，養(yǎng)殖甲殼動物的種類、面積和產(chǎn)量等也在逐漸增加，與此同時各種病害也隨之而來，因此有必要對其免疫系統(tǒng)開展深入研究。血細胞是免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組分，承擔(dān)大部分免疫功能，但是甲殼動物血細胞分類和功能研究尚不充分，需要從技術(shù)方法等方面予以完善。胡錦麗等^［5-6］利用圖像流式細胞術(shù)，以量化標(biāo)準(zhǔn)將甲殼動物血細胞清晰分為4類，并通過微球吞噬測試發(fā)現(xiàn)，各類細胞均具有吞噬功能，但無顆粒和小顆粒細胞是主要行使吞噬功能的細胞類群。

各類血細胞在免疫系統(tǒng)中扮演著重要角色，可以通過吞噬等發(fā)揮細胞免疫功能，還能夠釋放多種免疫因子參與體液免疫^［7］。血細胞的分類與功能分析緊密相連，但是甲殼動物血細胞的類群劃分尚未形成統(tǒng)一觀點，目前多以顯微觀察和染色輔助為主，帶有一定的主觀性。筆者采用流式分析的方法，根據(jù)關(guān)鍵參數(shù)的測量差異對細胞類群加以區(qū)分，為更精細的功能解析提供必要參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1實驗動物。

試驗用三疣梭子蟹和口蝦蛄購自水產(chǎn)市場。梭子蟹體重為（140±5）g，口蝦蛄體重為（30±5）g，置于實驗室循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)暫養(yǎng)，鹽度為（30±1）‰，水溫為（20±1）℃。暫養(yǎng)5d后，選擇活力旺盛、體表無明顯傷殘的個體用于采血分析和測量。

1.1.2試驗試劑。

抗凝劑參考文獻［8］配制，檸檬酸三鈉30mmol/L，氯化鈉338mmol/L，葡萄糖115mmol/L，乙二胺四乙酸二鈉10mmol/L，pH=7.0，4%多聚甲醛固定液購自生工生物工程（上海）股份有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.1.3試驗儀器。

顯微觀察使用Leica公司的DM5000型熒光顯微鏡；流式測量使用MerckMillipore公司的FlowSight型圖像流式細胞儀。

1.2試驗方法

1.2.1細胞樣品制備。

使用一次性注射器，按抗凝劑與血淋巴體積比1∶分別從梭子蟹和口蝦蛄附肢基部抽血，迅速混勻后轉(zhuǎn)入15mL離心管，再加入等體積的4%多聚甲醛溶液，用吸頭輕輕混勻，冰浴固定10min，用PBS洗滌后重懸，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2顯微鏡觀察。

使用上述未經(jīng)染色處理的血細胞懸液制作滴片，顯微鏡觀察并照相，根據(jù)胞內(nèi)可辨顆粒的數(shù)量和大小等綜合差異，對血細胞進行歸類和統(tǒng)計分析。

1.2.3圖像流式測量。

用70μm規(guī)格細胞篩過濾前述固定、洗滌處理的細胞懸液，去除多細胞團，流式測量每個樣品采集10000個樣點的數(shù)據(jù)和圖像，使用IDEASApplication軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2結(jié)果與分析

2.1血細胞的顯微觀察和分類

梭子蟹和口蝦蛄血細胞的形態(tài)較相似，主要為橢圓形或近圓形，部分細胞內(nèi)可見明顯的顆粒結(jié)構(gòu)。根據(jù)細胞內(nèi)顆粒的大小和數(shù)量，2種動物的血細胞均分為無顆粒細胞、小顆粒細胞和大顆粒細胞3種。無顆粒細胞以胞內(nèi)沒有明顯可辨的顆粒為主要特征，從外部觀察細胞膜較平坦，細胞核清晰易辨，核質(zhì)比大，胞質(zhì)較少。小顆粒細胞內(nèi)多含有數(shù)量不等、大小差異顯著的細碎顆粒，粒徑為細胞直徑的5%～10%，顆粒多分布在細胞核周圍，質(zhì)膜在顆粒部位有顯著隆起，核質(zhì)比居中。大顆粒細胞最顯著的特征是胞內(nèi)密集分布較大的顆粒結(jié)構(gòu)，粒徑為細胞直徑的10%左右，大小較均勻，細胞核多被顆粒完全遮擋，質(zhì)膜上緊貼顆粒的區(qū)域起伏較顯著（圖1）。

從2種動物血細胞大小對比來看，口蝦蛄的血細胞整體大于梭子蟹，其最小的一類血細胞也略大于后者體積最大的。另一方面，從每種動物各自3類血細胞大小的對比來看，無顆粒細胞在2種甲殼動物中都屬于最小的一類，而大顆粒細胞都是最大的。分類統(tǒng)計結(jié)果顯示，2種甲殼動物血淋巴中帶有顆粒的細胞占比較大，而且都以小顆粒細胞為主，分別占（47.13±7.69）%和（38.31±10.38）%，而大顆粒細胞占比則較為接近（表1）。

2.2血細胞的圖像流式測量和分類

流式分析采用精細的測量模塊，通過對比細胞樣點在側(cè)向散射強度和面積方面的差異對血細胞進行分類。2種甲殼動物血細胞的測量樣點在散點圖中具有相似的分布特征。圖中測量值相近的會聚集分布，各個聚集類群之間樣點稀疏，形成明顯的分隔，因此可以據(jù)此將其血細胞分為4個類群。由于側(cè)向散射特征反映的是胞內(nèi)折光物質(zhì)，即顆粒的復(fù)雜程度和豐度等特征，可將4類血細胞稱為無顆粒、小顆粒、中顆粒和大顆粒細胞，分別用NG、SG、MG和LG表示（圖2）。需要指出的是，顆粒并不完全等同于顯微觀察所指的可辨近圓形胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，而是以折光性為主要特征的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。兩者之間可能在一定程度上具有重疊性，但又不完全等同。位于流式分析散點圖底部的類群側(cè)向散射面積極小，表明其中幾乎不含折光性物質(zhì)，因此屬于無顆粒細胞（NG），在2種甲殼動物中占比約30%。同步采集的側(cè)向散射圖像中觀察不到顯著的信號影像。該類血細胞在2種甲殼動物中都是最小的，但口蝦蛄該類細胞的平均體積要大于梭子蟹。位于散點圖左側(cè)中部的一群細胞的側(cè)向散射強度不高，但側(cè)向散射面積較大，提示其中含有結(jié)構(gòu)不太復(fù)雜的折光物質(zhì)，分布較廣，屬于小顆粒細胞（SG），其體積比無顆粒細胞（NG）略大。在圖像右側(cè)偏下區(qū)域分布的一群細胞樣點側(cè)向散射強度高，但面積小，反映出胞內(nèi)含有少量高折光性物質(zhì)，屬于中顆粒細胞（MG），同步采集的側(cè)向散射圖像的信號明顯強于前2類細胞。2種甲殼動物中都有約10%的血細胞樣點分布在散點圖右上區(qū)域，提示胞內(nèi)具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的物質(zhì)含量相對較高，屬于大顆粒細胞（LG）。側(cè)向散射通道的圖像清晰顯示了胞內(nèi)含有的大量高折光物質(zhì)及其分布特征。從流式測量結(jié)果來看，2種甲殼動物血細胞大小有著明顯差異，口蝦蛄的血細胞比梭子蟹要大很多，在顯微觀察中也發(fā)現(xiàn)同樣的特征，但是2種動物血細胞由小到大依次為無顆粒細胞、小顆粒細胞、中顆粒細胞、大顆粒細胞（表2）。

3討論與結(jié)論

甲殼動物的血細胞在形態(tài)方面有一定獨特性，一些細胞內(nèi)存在大小不一的顆粒，還有一部分細胞中富含較大的近球形顆粒，這些顆粒樣結(jié)構(gòu)既是用于分類的識別特征，又是長期以來分類觀點不能完全統(tǒng)一的原因。胞內(nèi)顆粒有幾種，分別用什么量化標(biāo)準(zhǔn)區(qū)分等尚未解決的問題一直制約著甲殼動物血細胞研究。廖永巖等^［9］采用Wright染料、Geimsa染料及Wright-Geimsa混合染料對斑節(jié)對蝦 （Penaeus monodon）和黑斑口蝦蛄（Oratosquilla kempi） 的血細胞進行了染色觀察和比較，以細胞大小、核質(zhì)比及細胞質(zhì)中顆粒的有無為依據(jù)，把兩者的血細胞分為無顆粒細胞、小顆粒細胞和大顆粒細胞3種類型；陳孝煊等^［10］通過Geimsa染色，對比研究了克氏原螯蝦 （Procambarus clarkii）與紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）血細胞，認(rèn)為其均由無顆粒細胞、小顆粒細胞和大顆粒細胞組成；陸宏達^［11］利用顯微和亞顯微觀察對比，根據(jù)血細胞有無顆粒、顆粒大小、染色特性、折光性及形成方式將中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）血細胞分為無顆粒細胞、小顆粒細胞、大小顆粒中間型細胞和大顆粒細胞4種類型。

精準(zhǔn)的測量是精細區(qū)分的基礎(chǔ)，流式細胞儀可以高通量對細胞的多項指標(biāo)進行準(zhǔn)確測量，廣泛用于各類細胞以及顆粒結(jié)構(gòu)的分析。該研究對比了顯微觀察與流式分析在2種海產(chǎn)甲殼動物血細胞研究中的應(yīng)用。顯微觀察是常規(guī)的研究方法，根據(jù)胞內(nèi)可辨的顆粒狀結(jié)構(gòu)或利用染色等增強顯示的輔助方式，大都能將血細胞分為3～4種，流式測量也可以通過優(yōu)化參數(shù)選擇將甲殼動物血細胞分為3～4種?？傮w來說，流式測量鑒別出的大顆粒細胞占比多在10%左右，要低于顯微觀察的統(tǒng)計結(jié)果（表3）。由于對胞內(nèi)顆粒缺乏普遍適用的統(tǒng)一分析標(biāo)準(zhǔn)，顆粒的種類、大小與數(shù)量等方面差異的綜合評價在一定程度上帶有主觀性。通過參考既有研究，對多種甲殼動物各類血細胞基本特征的描述，有助于減少主觀判斷的影響。筆者利用顯微觀察未經(jīng)染色的血細胞，只能辨識出形態(tài)差異較大的3種。無顆粒細胞比較容易區(qū)分，質(zhì)膜均勻，缺少起伏；小顆粒細胞總體特征是胞內(nèi)顆粒細碎且數(shù)量變化范圍較大，大顆粒細胞則以胞內(nèi)富含大而近圓形顆粒狀結(jié)構(gòu)為辨識特征。在流式測量中，該研究選擇了側(cè)向散射強度與面積2個參數(shù)，針對折光物質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度以及含量進行分析，與顯微觀察的判定標(biāo)準(zhǔn)不完全一致，但也有一定的關(guān)聯(lián)。胞內(nèi)顆粒通常具有較為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，其數(shù)量和分布也在一定程度上決定了側(cè)向散射面積的大小。因此，通過流式測量劃分的類群與顯微觀察辨識的各種細胞之間也會具有一定的重疊。2種方法在含有顆粒細胞總的占比方面分析結(jié)果比較接近，均呈現(xiàn)出含有顆粒的細胞占比較大的特征。從顯微觀察統(tǒng)計結(jié)果來看，2種實驗動物的無顆粒細胞含量均在40%以下，但存在約15%的差異，而流式測量兩者無顆粒細胞比例則在30%左右，一致性較高。另一方面，從大顆粒細胞含量來看，顯微觀察統(tǒng)計2種動物都在25%左右，與流式測量的2種動物的大顆粒和中顆粒細胞占比之和相當(dāng)。在細胞大小方面顯微觀察與流式測量的結(jié)果保持一致，都提示口蝦蛄的各種血細胞都大于三疣梭子蟹最大的一類血細胞。

蝦蟹類缺乏獲得性的免疫系統(tǒng)，依靠先天免疫機制應(yīng)對病原等入侵^［16］。其先天性免疫防御分為體液免疫和細胞免疫。前者依靠血淋巴中的多種免疫因子發(fā)揮作用，如凝集素、酚氧化酶系統(tǒng)以及抗菌肽等^［17-18］。細胞免疫則以吞噬、包囊及結(jié)節(jié)生成等作用為主。吞噬可清除小的病原；較大的病原體則由多個血細胞協(xié)作以包囊或結(jié)節(jié)的形式固定。每種血細胞在生物體內(nèi)沿著各自的路徑分化成熟，并各司其職，細胞類型區(qū)分越準(zhǔn)確，功能分析就越精細。流式分析基于精準(zhǔn)的測量，而且具有很高的通量，因此在可重復(fù)性和對結(jié)果判定的客觀性方面具有一定的優(yōu)勢。胡錦麗等^［6］利用流式測量分析中華絨螯蟹血細胞類群并探討了應(yīng)答感染的過程，認(rèn)為散點圖中各類血細胞測量樣點分布相對獨立，無明顯的過渡，提示血細胞之間沒有相互轉(zhuǎn)化；流式測量發(fā)現(xiàn)在感染早期無顆粒細胞數(shù)量波動較大，顯微觀察輔助證實該類細胞是主要的吞噬類群。李榮等^［19］在凡納濱對蝦 （Litopenaeus vannamei） 感染分析中也發(fā)現(xiàn)同樣的特征，認(rèn)為無顆粒細胞通過吞噬及黏附等方式，將病原攝入細胞并固定于體內(nèi)特定部位，從而減少循環(huán)中的病原數(shù)量。由于研究方法不同，關(guān)于甲殼動物每種血細胞的免疫功能存在不同的觀點，Li等^［20］在紅螯螯蝦的研究中認(rèn)為各種細胞均具有吞噬功能，其中透明細胞為主要吞噬類群，大顆粒細胞是由透明細胞發(fā)育成熟而來；Sderhll等^［21-22］分別在歐洲青蟹（ Carcinus maenas）以及艾氏濱蟹（Carcinus aestuarii） 的研究中發(fā)現(xiàn)，透明細胞是主要的吞噬細胞，而小顆粒細胞和大顆粒細胞的吞噬活性則相對有限；但Gargioni等^［23］在羅氏沼蝦（ Macrobrachium rosenbergii）、阿肯色沼蝦（Macrobrachium acanthurus）以及圣保羅對蝦（Penaeus paulensis） 血細胞的分析中發(fā)現(xiàn)，酵母細胞主要由小顆粒細胞與顆粒細胞吞噬；而在另一項研究中，Sung等^［24］認(rèn)為，玻璃微球是由斑節(jié)對蝦的透明細胞吞噬。組學(xué)是從分子層面了解細胞功能的先進方法，單細胞轉(zhuǎn)錄組在甲殼動物中也開始應(yīng)用，Koiwai等^［25］在日本對蝦（ Marsupenaeus japonicus ）血細胞的單細胞分析中，挖掘出6種類型，但其使用常規(guī)流式測量只能區(qū)分出2個混合類群。Cui等^［26］利用單細胞測序以及原位流式方法從凡納濱對蝦血細胞中識別出10種類型。

目前不依賴抗體或探針等增強方法，常規(guī)流式在區(qū)分甲殼動物血細胞方面尚有不足。該研究用側(cè)向散射強度和面積2個參數(shù)特征，無需抗體等輔助，即可將2種甲殼動物血細胞區(qū)分成4種類型，具有較高的重復(fù)性，為甲殼動物血細胞的分類分離拓展了較為先進的技術(shù)方法，同時也豐富了該方法在甲殼動物血細胞研究中的應(yīng)用。

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