摘要為了篩選能夠提高羊免疫應(yīng)答的Toll樣受體激動劑，設(shè)計針對羊TLR1～TLR10基因序列的引物，采用PCR方法檢測羊體內(nèi)Toll樣受體的表達(dá)情況。然后，將人載脂蛋白A1（ApoA1）和HMT13佐劑配伍不同的TLR1～TLR9樣受體激動劑，分組免疫湖羊后采集血樣，并通過瓊脂擴(kuò)散試驗檢測抗體效價。結(jié)果表明：在湖羊的血液中均可檢測到TLR1～TLR10的特異性目的片段。經(jīng)過3、5、7次免疫后，添加TLR3激動劑的組效價最高，說明TLR3激動劑Ploy（I∶C）免疫增強(qiáng)效果最佳，可作為提高羊疫苗免疫的候選激動劑。

關(guān)鍵詞Toll樣受體；激動劑；湖羊；ApoA1；免疫應(yīng)答

中圖分類號S859.79+7"文獻(xiàn)標(biāo)識碼A"文章編號0517-6611（2025）01-0098-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.01.020

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

SelectingToll-likeReceptorAgonistsforthePreparationofSheepAnti-humanApolipoproteinA1Antibody

DENG Bi-hua" "ZHOU Yu-jie ³， YIN Wen-zhu2 et al

（1.ZhenjiangInstituteofAgriculturalSciencesinHillyAreasofJiangsuProvince，Zhenjiang，Jiangsu212400;2.InstituteofVeterinaryImmunologyamp;Engineering，JiangsuAcademyofAgriculturalSciences，Nanjing，Jiangsu210014;3.CollegeofVeterinaryMedicine，NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing，Jiangsu210095）

AbstractInordertoselectToll-likeagoniststhatcanenhancetheimmuneresponseinsheep，PCRmethodwasusedtodesigntheprimersforthegenesequencesof"TLR1-TLR10"forsheep，anddetecttheexpressionofToll-likereceptorsinsheep.Subsequently，humanapolipoproteinA1（ApoA1）andHMT13adjuvantwerecombinedwithvariouscommercializedTLR1-TLR9agonists.PostimmunizationofHuSheepindifferentgroups，bloodsampleswerecollectedandantibodytitersweredetectedbyusingagardiffusiontest.Theresultsindicatedthespecifictargetfragmentsof"TLR1-TLR10"weredetectedinthebloodofHuSheep.After3，5，and7roundsofimmunization，thetiterinTLR3agonistgroupwasthehighest，whichsuggestedthattheTLR3agonistPoly（I∶C）exhibitedthebestimmuno-enhancingeffect，soitcouldbeusedasacandidateagonistforimprovingthevaccineimmunogenicityinsheep.

KeywordsToll-likereceptors;Agonist;HuSheep;ApoA1;Immuneresponse

基金項目江蘇省自主創(chuàng)新項目（SX（22）3041）；鎮(zhèn)江市科技計劃項目（SH2022016）；句容市科技項目（ZA42107）。

作者簡介鄧碧華（1981—），男，江蘇無錫人，副研究員，碩士，從事疫苗佐劑研究。*通信作者，副研究員，從事畜禽高效養(yǎng)殖研究。

動物機(jī)體內(nèi)存在先天性免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答2種免疫應(yīng)答方式。這2種免疫應(yīng)答幫助機(jī)體抵御微生物感染和維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)^［1-2］。先天性免疫系統(tǒng)主要通過模式識別受體感知病原體相關(guān)的分子模式（PAMPs）來識別入侵的病原體，為機(jī)體提供第一道免疫防線^［3］。Toll樣受體（TLRs）識別PAMPs激活下游信號通路，從而誘導(dǎo)趨化因子、細(xì)胞因子和共刺激分子的表達(dá)來參與機(jī)體的免疫反應(yīng)。TLRs信號通路可通過激活多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來激活補(bǔ)體產(chǎn)生免疫^［4-5］，也可激活樹突狀細(xì)胞分泌大量Ⅰ型干擾素^［6］，此外還可激活專職性抗原提呈細(xì)胞（如樹突狀細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞等）呈遞抗原給T細(xì)胞，進(jìn)而激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答^［7］。每種TLR都有自己的特定組織定位和下游基因信號通路，TLR激動劑可以與其他TLRs或替代佐劑組合，產(chǎn)生具有協(xié)同或調(diào)節(jié)作用的組合佐劑。

人載脂蛋白A1（ApoA1）在肝及腸黏膜中合成，主要存在于高密度脂蛋白中。ApoA1是防止動脈硬化的保護(hù)因子，與動脈粥樣硬化性心血管疾病呈負(fù)相關(guān)。ApoA1是反映冠心病危險因素的重要指標(biāo)^［8-9］。羊抗ApoA1抗體是用人ApoA1免疫健康羊獲得免疫血清，經(jīng)過親和純化后獲得抗體。羊抗ApoA1抗體是ApoA1檢測試劑的關(guān)鍵核心原料。免疫過程中選擇合適的免疫增強(qiáng)劑，有助于提高羊抗ApoA1抗體效價，降低抗體的制備成本。TLR激動劑作為免疫增強(qiáng)物質(zhì)，是人和動物免疫研究的熱點(diǎn)。

目前已鑒定的TLRs有10～15種，其中人類有10種，而TLR1～TLR9普遍存在于魚類到人類的各種脊椎動物中^［10］。然而，關(guān)于羊與Toll樣受體關(guān)系的研究較少。筆者檢測羊Toll樣受體在體內(nèi)的表達(dá)，篩選適合羊免疫應(yīng)答的TLR激動劑，以期為提高羊的疫苗免疫和抗體制備提供新的研究思路。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗動物。

湖羊（50只、成年、健康、體重35kg左右），由徐州蘇羊羊業(yè)有限公司提供。

1.1.2主要試劑。

HMT13佐劑，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫工程研究所制備；瓊脂糖，購自南京生興生物技術(shù)有限公司；聚乙二醇（PEG），購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；ApoA1抗體偶聯(lián)親和層析柱，購自美國GE公司；ApoA1蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司；DNA提取試劑盒、核酸染料、2×Taq"PCRMasterMix，購自天根生化科技有限公司；Toll樣受體激動劑1～9，購自Sigma試劑公司。

1.2方法

1.2.1"TLRs基因的擴(kuò)增。

1.2.1.1引物設(shè)計與合成。

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中已有山羊或綿羊TLRs基因序列信息，應(yīng)用SnapGene4.2.4軟件設(shè)計TLR1～TLR10基因特異性擴(kuò)增引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。TLR1～TLR10基因擴(kuò)增引物見表1。

1.2.1.2羊血液總DNA的提取。

在添加200μL抗凝劑的血液中加入20μL蛋白酶K溶液，混勻。按照DNA提取試劑盒說明書操作，將提取的DNA收集到離心管中，于2～8℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.3PCR擴(kuò)增。

以提取的DNA為模版，利用合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系如下：2×Taq"PCRMasterMix12.5μL、上下游引物各1.0μL、DNA1.0μL，補(bǔ)水至25.0μL。使用PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增程序如下：95℃5min；95℃30s，64℃30s，72℃3min，35個循環(huán)；72℃10min。

1.2.2ApoA1的提取與純化。

將聚乙二醇（PEG）法沉淀血漿后得到上清液，用-20℃預(yù)冷乙醇沉淀、離心；沉淀物用磷酸鹽緩沖液復(fù)溶后進(jìn)行多次透析；采用親和層析法，用ApoA1抗體偶聯(lián)親和層析柱，透析后的上清液多次過柱反應(yīng)、洗脫、透析，并用超濾管超濾后得到ApoA1天然抗原。將純化的蛋白樣品加入SDS上樣緩沖液制樣，利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）方法進(jìn)行分離鑒定。

1.2.3羊血清中抗體效價的檢測。

1.2.3.1免疫分組。

將50只成年健康湖羊打上耳標(biāo)標(biāo)記，隨機(jī)分為10組，每組5只。使用不同佐劑制備的疫苗免疫，具體分組見表2。免疫后定期采集湖羊的免后血清。動物試驗在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實驗動物倫理委員會的指導(dǎo)下開展。試驗結(jié)束后，所有試驗動物按照有關(guān)法律法規(guī)進(jìn)行無害化處理。

1.2.3.2瓊脂擴(kuò)散試驗檢測抗體效價。

在100mL8%的氯化鈉溶液中加入1.0g的優(yōu)質(zhì)瓊脂糖，加熱融化后加入終濃度001%的硫柳汞防腐，澆制凝膠板（約3mm厚）。按六角形打孔，孔徑5.0mm、孔距3.0mm。將血清用生理鹽水進(jìn)行2倍系列稀釋，中央孔加入ApoA1抗原，周圍孔依次加入各稀釋度的羊血清。加樣后置于37℃濕盒中孵育，若出現(xiàn)特異條帶則判定為陽性，出現(xiàn)條帶的最大稀釋倍數(shù)即為抗體效價。定期檢測免后羊血清中的抗體效價。

1.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。

采用GraphPadPrism9.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，采用Two-wayANOVA對抗體效價進(jìn)行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1羊血液PCR檢測TLR1～TLR10電泳結(jié)果

以提取的5個羊血液樣本總DNA為模板，用合成的引物進(jìn)行目的基因擴(kuò)增，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳結(jié)果顯示，TLR1～TLR10均出現(xiàn)對應(yīng)大小的特異性條帶，結(jié)果見圖1。

2.2ApoA1抗原的驗證

對該研究提取的ApoA1天然抗原進(jìn)行檢測。SDS-PAGE結(jié)果顯示，提取純化的蛋白條帶單一，大小約28ku，與目標(biāo)蛋白ApoA1大小一致（圖2）。

2.3抗體檢測結(jié)果

給羊分組免疫含不同TLRs激動劑的ApoA1乳劑，分別在免疫3次后10d、免疫5次后10d和免疫7次后10d采血，利用瓊脂擴(kuò)散試劑檢測抗體效價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫7次后10d3組（含TLR3激動劑）的免疫效果最佳，顯著優(yōu)于1組（不含TLRS激動劑）；2組（含TLR1/2激動劑）、6組（含TLR2/6激動劑）、7組（含TLR7激動劑）和9組（含TLR9激動劑）的免疫效果略優(yōu)于1組；5組（含TLR5激動劑）和8組（含TLR8激動劑）的免疫效果與1組差異不顯著；4組（含TLR4激動劑）的免疫效果低于1組，結(jié)果見圖3。

3討論與結(jié)論

以羊抗凝血中提取的DNA為模板，設(shè)計TLR1～TLR10基因的引物，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示均出現(xiàn)特異性目的條帶。PCR方法具有特異性強(qiáng)、靈敏性高等優(yōu)點(diǎn)。該研究通過建立TLR1～TLR10基因PCR方法，檢測血液中TLRs轉(zhuǎn)錄水平，間接比較不同TLRs的表達(dá)量差異，為羊篩選合適的TLRs激動劑提供了方法和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

以ApoA1為模式蛋白加入不同的TLR1～9激動劑，結(jié)合HMT13佐劑制備乳液，免疫健康羊后定期采血進(jìn)行抗體檢測，篩選具有免疫增強(qiáng)效果的TLRs激動劑。抗體效價顯示，含TLR3激動劑Ploy（I∶C）組抗體效價最高，免疫增強(qiáng)效果最明顯。資料顯示，與其他TLRs不同，TLR3是唯一一種MyD88非依賴的TLR，其主要依賴TRIF^［11-12］。TLR3與配體結(jié)合后，通過胞內(nèi)TIR結(jié)構(gòu)域直接結(jié)合TRIF。TRIF活化能激活核因子-κB（NF-κB）和干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3），最終造成IFN誘導(dǎo)基因的表達(dá)和樹突細(xì)胞的成熟^［13］。TLR4激動劑在人和豬上均有很好的免疫增強(qiáng)效果，但4組（含TLR4激動劑）的抗體效價低于1組。這可能是由于 TLR s基因同科不同屬存在差異，甚至同種動物之間都存在一些差異^［14］，而且不同劑量也有可能引起抑制作用。

免疫反應(yīng)類型由特定的TLR及其銜接蛋白激活的信號通路所決定的。一般來說，大多數(shù)TLR途徑會導(dǎo)致Th1免疫反應(yīng)，但TLR2除外。這可能是由于TLR2配體的多樣性，TLR2可以誘導(dǎo)促炎和抗炎途徑，從而導(dǎo)致Th1或Th2免疫反應(yīng)。TLRs作為危險信號傳感器，增加了免疫細(xì)胞向疫苗給藥部位的運(yùn)輸^［15］。TLR參與可增強(qiáng)Ⅰ類和Ⅱ類MHC分子的抗原捕獲、處理和呈遞。TLRs激動劑是一類強(qiáng)有力的免疫佐劑，適宜的TLRs激動劑可以提高體液免疫和細(xì)胞免疫水平，能更有效地預(yù)防疾病。該研究在羊上篩選適合羊的TLRs激動劑，為羊的疫苗免疫和抗體制備提供新的研究思路。

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