摘要為了篩選能夠提高羊免疫應(yīng)答的Toll樣受體激動劑,設(shè)計針對羊TLR1~TLR10基因序列的引物,采用PCR方法檢測羊體內(nèi)Toll樣受體的表達(dá)情況。然后,將人載脂蛋白A1(ApoA1)和HMT13佐劑配伍不同的TLR1~TLR9樣受體激動劑,分組免疫湖羊后采集血樣,并通過瓊脂擴(kuò)散試驗檢測抗體效價。結(jié)果表明:在湖羊的血液中均可檢測到TLR1~TLR10的特異性目的片段。經(jīng)過3、5、7次免疫后,添加TLR3激動劑的組效價最高,說明TLR3激動劑Ploy(I∶C)免疫增強(qiáng)效果最佳,可作為提高羊疫苗免疫的候選激動劑。
關(guān)鍵詞Toll樣受體;激動劑;湖羊;ApoA1;免疫應(yīng)答
中圖分類號S859.79+7"文獻(xiàn)標(biāo)識碼A"文章編號0517-6611(2025)01-0098-04
doi:10.3969/j.issn.0517-6611.2025.01.020
開放科學(xué)(資源服務(wù))標(biāo)識碼(OSID):
SelectingToll-likeReceptorAgonistsforthePreparationofSheepAnti-humanApolipoproteinA1Antibody
DENG Bi-hua" "ZHOU Yu-jie 3, YIN Wen-zhu2 et al
(1.ZhenjiangInstituteofAgriculturalSciencesinHillyAreasofJiangsuProvince,Zhenjiang,Jiangsu212400;2.InstituteofVeterinaryImmunologyamp;Engineering,JiangsuAcademyofAgriculturalSciences,Nanjing,Jiangsu210014;3.CollegeofVeterinaryMedicine,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing,Jiangsu210095)
AbstractInordertoselectToll-likeagoniststhatcanenhancetheimmuneresponseinsheep,PCRmethodwasusedtodesigntheprimersforthegenesequencesof"TLR1-TLR10"forsheep,anddetecttheexpressionofToll-likereceptorsinsheep.Subsequently,humanapolipoproteinA1(ApoA1)andHMT13adjuvantwerecombinedwithvariouscommercializedTLR1-TLR9agonists.PostimmunizationofHuSheepindifferentgroups,bloodsampleswerecollectedandantibodytitersweredetectedbyusingagardiffusiontest.Theresultsindicatedthespecifictargetfragmentsof"TLR1-TLR10"weredetectedinthebloodofHuSheep.After3,5,and7roundsofimmunization,thetiterinTLR3agonistgroupwasthehighest,whichsuggestedthattheTLR3agonistPoly(I∶C)exhibitedthebestimmuno-enhancingeffect,soitcouldbeusedasacandidateagonistforimprovingthevaccineimmunogenicityinsheep.
KeywordsToll-likereceptors;Agonist;HuSheep;ApoA1;Immuneresponse
基金項目江蘇省自主創(chuàng)新項目(SX(22)3041);鎮(zhèn)江市科技計劃項目(SH2022016);句容市科技項目(ZA42107)。
作者簡介鄧碧華(1981—),男,江蘇無錫人,副研究員,碩士,從事疫苗佐劑研究。*通信作者,副研究員,從事畜禽高效養(yǎng)殖研究。
動物機(jī)體內(nèi)存在先天性免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答2種免疫應(yīng)答方式。這2種免疫應(yīng)答幫助機(jī)體抵御微生物感染和維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)[1-2]。先天性免疫系統(tǒng)主要通過模式識別受體感知病原體相關(guān)的分子模式(PAMPs)來識別入侵的病原體,為機(jī)體提供第一道免疫防線[3]。Toll樣受體(TLRs)識別PAMPs激活下游信號通路,從而誘導(dǎo)趨化因子、細(xì)胞因子和共刺激分子的表達(dá)來參與機(jī)體的免疫反應(yīng)。TLRs信號通路可通過激活多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來激活補(bǔ)體產(chǎn)生免疫[4-5],也可激活樹突狀細(xì)胞分泌大量Ⅰ型干擾素[6],此外還可激活專職性抗原提呈細(xì)胞(如樹突狀細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞等)呈遞抗原給T細(xì)胞,進(jìn)而激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答[7]。每種TLR都有自己的特定組織定位和下游基因信號通路,TLR激動劑可以與其他TLRs或替代佐劑組合,產(chǎn)生具有協(xié)同或調(diào)節(jié)作用的組合佐劑。
人載脂蛋白A1(ApoA1)在肝及腸黏膜中合成,主要存在于高密度脂蛋白中。ApoA1是防止動脈硬化的保護(hù)因子,與動脈粥樣硬化性心血管疾病呈負(fù)相關(guān)。ApoA1是反映冠心病危險因素的重要指標(biāo)[8-9]。羊抗ApoA1抗體是用人ApoA1免疫健康羊獲得免疫血清,經(jīng)過親和純化后獲得抗體。羊抗ApoA1抗體是ApoA1檢測試劑的關(guān)鍵核心原料。免疫過程中選擇合適的免疫增強(qiáng)劑,有助于提高羊抗ApoA1抗體效價,降低抗體的制備成本。TLR激動劑作為免疫增強(qiáng)物質(zhì),是人和動物免疫研究的熱點(diǎn)。
目前已鑒定的TLRs有10~15種,其中人類有10種,而TLR1~TLR9普遍存在于魚類到人類的各種脊椎動物中[10]。然而,關(guān)于羊與Toll樣受體關(guān)系的研究較少。筆者檢測羊Toll樣受體在體內(nèi)的表達(dá),篩選適合羊免疫應(yīng)答的TLR激動劑,以期為提高羊的疫苗免疫和抗體制備提供新的研究思路。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1試驗動物。
湖羊(50只、成年、健康、體重35kg左右),由徐州蘇羊羊業(yè)有限公司提供。
1.1.2主要試劑。
HMT13佐劑,由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫工程研究所制備;瓊脂糖,購自南京生興生物技術(shù)有限公司;聚乙二醇(PEG),購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;ApoA1抗體偶聯(lián)親和層析柱,購自美國GE公司;ApoA1蛋白標(biāo)準(zhǔn)品,購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司;DNA提取試劑盒、核酸染料、2×Taq"PCRMasterMix,購自天根生化科技有限公司;Toll樣受體激動劑1~9,購自Sigma試劑公司。
1.2方法
1.2.1"TLRs基因的擴(kuò)增。
1.2.1.1引物設(shè)計與合成。
根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中已有山羊或綿羊TLRs基因序列信息,應(yīng)用SnapGene4.2.4軟件設(shè)計TLR1~TLR10基因特異性擴(kuò)增引物,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。TLR1~TLR10基因擴(kuò)增引物見表1。
1.2.1.2羊血液總DNA的提取。
在添加200μL抗凝劑的血液中加入20μL蛋白酶K溶液,混勻。按照DNA提取試劑盒說明書操作,將提取的DNA收集到離心管中,于2~8℃下保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.1.3PCR擴(kuò)增。
以提取的DNA為模版,利用合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系如下:2×Taq"PCRMasterMix12.5μL、上下游引物各1.0μL、DNA1.0μL,補(bǔ)水至25.0μL。使用PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增程序如下:95℃5min;95℃30s,64℃30s,72℃3min,35個循環(huán);72℃10min。
1.2.2ApoA1的提取與純化。
將聚乙二醇(PEG)法沉淀血漿后得到上清液,用-20℃預(yù)冷乙醇沉淀、離心;沉淀物用磷酸鹽緩沖液復(fù)溶后進(jìn)行多次透析;采用親和層析法,用ApoA1抗體偶聯(lián)親和層析柱,透析后的上清液多次過柱反應(yīng)、洗脫、透析,并用超濾管超濾后得到ApoA1天然抗原。將純化的蛋白樣品加入SDS上樣緩沖液制樣,利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)方法進(jìn)行分離鑒定。
1.2.3羊血清中抗體效價的檢測。
1.2.3.1免疫分組。
將50只成年健康湖羊打上耳標(biāo)標(biāo)記,隨機(jī)分為10組,每組5只。使用不同佐劑制備的疫苗免疫,具體分組見表2。免疫后定期采集湖羊的免后血清。動物試驗在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實驗動物倫理委員會的指導(dǎo)下開展。試驗結(jié)束后,所有試驗動物按照有關(guān)法律法規(guī)進(jìn)行無害化處理。
1.2.3.2瓊脂擴(kuò)散試驗檢測抗體效價。
在100mL8%的氯化鈉溶液中加入1.0g的優(yōu)質(zhì)瓊脂糖,加熱融化后加入終濃度001%的硫柳汞防腐,澆制凝膠板(約3mm厚)。按六角形打孔,孔徑5.0mm、孔距3.0mm。將血清用生理鹽水進(jìn)行2倍系列稀釋,中央孔加入ApoA1抗原,周圍孔依次加入各稀釋度的羊血清。加樣后置于37℃濕盒中孵育,若出現(xiàn)特異條帶則判定為陽性,出現(xiàn)條帶的最大稀釋倍數(shù)即為抗體效價。定期檢測免后羊血清中的抗體效價。
1.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。
采用GraphPadPrism9.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行整理,采用Two-wayANOVA對抗體效價進(jìn)行差異顯著性分析。
2結(jié)果與分析
2.1羊血液PCR檢測TLR1~TLR10電泳結(jié)果
以提取的5個羊血液樣本總DNA為模板,用合成的引物進(jìn)行目的基因擴(kuò)增,對PCR產(chǎn)物進(jìn)行10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳結(jié)果顯示,TLR1~TLR10均出現(xiàn)對應(yīng)大小的特異性條帶,結(jié)果見圖1。
2.2ApoA1抗原的驗證
對該研究提取的ApoA1天然抗原進(jìn)行檢測。SDS-PAGE結(jié)果顯示,提取純化的蛋白條帶單一,大小約28ku,與目標(biāo)蛋白ApoA1大小一致(圖2)。
2.3抗體檢測結(jié)果
給羊分組免疫含不同TLRs激動劑的ApoA1乳劑,分別在免疫3次后10d、免疫5次后10d和免疫7次后10d采血,利用瓊脂擴(kuò)散試劑檢測抗體效價,結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫7次后10d3組(含TLR3激動劑)的免疫效果最佳,顯著優(yōu)于1組(不含TLRS激動劑);2組(含TLR1/2激動劑)、6組(含TLR2/6激動劑)、7組(含TLR7激動劑)和9組(含TLR9激動劑)的免疫效果略優(yōu)于1組;5組(含TLR5激動劑)和8組(含TLR8激動劑)的免疫效果與1組差異不顯著;4組(含TLR4激動劑)的免疫效果低于1組,結(jié)果見圖3。
3討論與結(jié)論
以羊抗凝血中提取的DNA為模板,設(shè)計TLR1~TLR10基因的引物,并進(jìn)行PCR擴(kuò)增,電泳結(jié)果顯示均出現(xiàn)特異性目的條帶。PCR方法具有特異性強(qiáng)、靈敏性高等優(yōu)點(diǎn)。該研究通過建立TLR1~TLR10基因PCR方法,檢測血液中TLRs轉(zhuǎn)錄水平,間接比較不同TLRs的表達(dá)量差異,為羊篩選合適的TLRs激動劑提供了方法和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
以ApoA1為模式蛋白加入不同的TLR1~9激動劑,結(jié)合HMT13佐劑制備乳液,免疫健康羊后定期采血進(jìn)行抗體檢測,篩選具有免疫增強(qiáng)效果的TLRs激動劑。抗體效價顯示,含TLR3激動劑Ploy(I∶C)組抗體效價最高,免疫增強(qiáng)效果最明顯。資料顯示,與其他TLRs不同,TLR3是唯一一種MyD88非依賴的TLR,其主要依賴TRIF[11-12]。TLR3與配體結(jié)合后,通過胞內(nèi)TIR結(jié)構(gòu)域直接結(jié)合TRIF。TRIF活化能激活核因子-κB(NF-κB)和干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3),最終造成IFN誘導(dǎo)基因的表達(dá)和樹突細(xì)胞的成熟[13]。TLR4激動劑在人和豬上均有很好的免疫增強(qiáng)效果,但4組(含TLR4激動劑)的抗體效價低于1組。這可能是由于 TLR s基因同科不同屬存在差異,甚至同種動物之間都存在一些差異[14],而且不同劑量也有可能引起抑制作用。
免疫反應(yīng)類型由特定的TLR及其銜接蛋白激活的信號通路所決定的。一般來說,大多數(shù)TLR途徑會導(dǎo)致Th1免疫反應(yīng),但TLR2除外。這可能是由于TLR2配體的多樣性,TLR2可以誘導(dǎo)促炎和抗炎途徑,從而導(dǎo)致Th1或Th2免疫反應(yīng)。TLRs作為危險信號傳感器,增加了免疫細(xì)胞向疫苗給藥部位的運(yùn)輸[15]。TLR參與可增強(qiáng)Ⅰ類和Ⅱ類MHC分子的抗原捕獲、處理和呈遞。TLRs激動劑是一類強(qiáng)有力的免疫佐劑,適宜的TLRs激動劑可以提高體液免疫和細(xì)胞免疫水平,能更有效地預(yù)防疾病。該研究在羊上篩選適合羊的TLRs激動劑,為羊的疫苗免疫和抗體制備提供新的研究思路。
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