關鍵詞平火茶標準湯劑；含量測定；指紋圖譜；量值傳遞；質量控制；高效液相色譜法

“上火”的概念源于中醫(yī)學對人體和疾病的認識，其基本病機為陰陽失衡，火熱上炎于頭面；其臨床表現主要以口舌生瘡、口腔潰瘍、牙齦及咽喉腫痛、眼睛紅腫等頭面部癥狀為主?！吧匣稹钡臐撛跈C制比較復雜，與人們飲食習慣、作息時間、不良情緒等多種因素有關。研究發(fā)現，假如“上火”的癥狀一直存在，就有可能引發(fā)心血管疾病[1]、膽管疾病[2]、抑郁癥[3]。

平火茶標準湯劑為國醫(yī)大師張磊應用多年的臨床驗方，由梔子、菊花、白茅根、山楂、甘草5味中藥組成。方中梔子為君藥，清上中下三焦之火，具有涼血、清熱、生津、利尿通淋的功效[4]；菊花和白茅根相須為用，共為臣藥，其中菊花清上焦之火，具有清肝明目、清熱解毒、消腫的功效[5]，白茅根清下焦之火，具有瀉火除煩、清熱解毒、利尿、涼血的功效[6]；山楂為佐藥，清中焦之火，具有消食健胃、消導下行、行氣散瘀的功效[7]；甘草為使藥，可以調和諸藥[8]。諸藥合用，可以清上中下三焦之火，用于治療頭昏、心煩、睡眠欠佳和小便黃赤等癥。中藥復方的質量控制是保證患者用藥安全、有效的基礎[9]，但目前尚未見關于平火茶標準湯劑整體質量控制的研究?；诖?，本研究通過制備15批平火茶標準湯劑并建立其指紋圖譜，對其進行相似度評價、化學模式識別、峰歸屬分析、出膏率測定、飲片-標準湯劑的量值傳遞等質量控制研究，以期為其臨床合理使用和后續(xù)平火茶的制劑研究提供理論參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器包括2695-2998型高效液相色譜（HPLC）儀（美國Waters公司），ME204E型萬分之一分析天平、AB135-S型十萬分之一分析天平（瑞士MettlerToledo公司），KQ-700DB型數控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司），HH-S6型電子恒溫水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責任公司），ST-10N-60A型冷凍干燥機（山東三體儀器有限公司）。

1.2 主要試劑

梔子苷對照品（批號220916，質量分數≥98%）購自成都植標化純生物技術有限公司；綠原酸（批號MUST-18030620，質量分數≥99.39%）、新綠原酸（批號AFBH2301，質量分數≥98%）、異綠原酸A（批號AFCE0656，質量分數≥98%）、木犀草素（批號AFCE0510，質量分數≥98%）、甘草苷（批號AFBI0102，質量分數≥98%）、甘草酸（批號AFCB0903，質量分數≥98%）、木犀草苷（批號AFBI0506，質量分數≥98%）、山柰酚（批號MUST-18091810，質量分數≥99.3%）對照品均購自曼斯特（成都）生物科技有限公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）均購自美國Tedia公司；磷酸（色譜純）購自天津市科密歐化學試劑有限公司；水為娃哈哈純凈水。

1.3 藥材

平火茶中梔子、菊花、白茅根、山楂、甘草5味飲片均購自安徽三義堂中藥飲片有限公司，經河南中醫(yī)藥大學中藥資源與鑒定教研中心陳隨清教授鑒定均為真品。飲片具體信息見表1。

2 方法與結果

2.1 平火茶標準湯劑的制備

使用隨機數字表法對表1中不同產地的組方飲片進行組合，樣品組合信息見表2。參照《醫(yī)療機構中藥煎藥室管理規(guī)范》[10]，取菊花10g、梔子15g、白茅根30g、山楂15g、甘草6g，一煎加7倍量水，浸泡30min，煎30min，趁熱以150目濾布濾過；二煎加6倍量水，煎20min，趁熱過濾；合并2次濾液，濃縮至500mL，真空冷凍干燥，即得15批平火茶標準湯劑凍干粉。同時，按上述工藝分別制備缺梔子、缺菊花、缺白茅根、缺甘草、缺山楂的陰性凍干粉和各單味飲片凍干粉。

2.2 平火茶標準湯劑HPLC指紋圖譜的建立

2.2.1 供試品溶液的制備

取平火茶標準湯劑凍干粉約0.25g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，稱定質量；超聲處理（功率300W，頻率40kHz）40min，放冷，再稱定質量；用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液過0.22μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.2.2 混合對照品溶液的制備

精密稱取綠原酸、新綠原酸、異綠原酸A、梔子苷、木犀草素、甘草苷、甘草酸、木犀草苷、山柰酚對照品各適量，加70%甲醇制成質量濃度分別為0.4453、0.5292、0.6076、0.2450、0.4214、0.1078、0.1862、0.08085、0.3476mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 單味飲片及陰性樣品溶液的制備

分別取梔子、菊花、白茅根、山楂和甘草飲片凍干粉約0.25g，按照“2.2.1”項下方法制備各單味飲片供試品溶液；同法制備各飲片的陰性樣品溶液。

2.2.4 色譜條件

色譜柱為VenusilC18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～16min，5%A→9%A；16～32min，9%A→18%A；32～63min，18%A；63～68min，18%A→28%A；68～84min，28%A→36%A；84～98min，36%A→51%A；98～102min，51%A→36%A）；柱溫為30℃；檢測波長為238nm（0～37min、85～102min）、330nm（37～85min）；流速為1.0mL/min；進樣量為10μL。

2.2.5 精密度試驗

取平火茶標準湯劑凍干粉（S1），按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.4”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。以梔子苷色譜峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，所得RSD均小于4.36%，表明該方法精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗

取平火茶標準湯劑凍干粉（S1），按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.4”項下色譜條件分別在室溫下放置0、2、4、6、8、12、24h時進樣測定，記錄峰面積。以梔子苷色譜峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，所得RSD均小于4.47%，表明供試品溶液在室溫下放置24h內穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復性試驗

取平火茶標準湯劑凍干粉（S1），按“2.2.1”項下方法平行制備6份供試品溶液，分別按“2.2.4”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以梔子苷色譜峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，所得RSD均小于4.67%，表明該方法重復性良好。

2.2.8 指紋圖譜的建立及相似度評價

按照“2.2.1”項下方法平行制備15批平火茶標準湯劑的供試品溶液，分別按“2.2.4”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。將15批平火茶標準湯劑的HPLC圖導入2012版《中藥色譜指紋圖譜評價軟件》，以S1的指紋圖譜為參照圖譜，設時間窗寬度為0.1min，采用中位數法，經多點校正和Mark峰匹配生成15批平火茶標準湯劑的指紋圖譜和對照指紋圖譜R（圖1），并標定出24個共有峰；經與混合對照品的HPLC圖（圖2）比對，其中3、6、9、10、11、14、21、23、24號峰對應成分分別為新綠原酸、綠原酸、梔子苷、甘草苷、木犀草苷、異綠原酸A、木犀草素、山柰酚、甘草酸。15批平火茶標準湯劑（S1～S15）的相似度分別為0.986、0.990、0.988、0.968、0.993、0.977、0.979、0.997、0.983、0.979、0.996、0.972、0.988、0.981、0.977，均不小于0.968，表明不同批次平火茶標準湯劑所含化學成分的種類基本一致。

2.2.9 平火茶標準湯劑共有峰的歸屬研究

通過對平火茶標準湯劑、單味飲片、各飲片陰性樣品的HPLC圖譜進行分析，發(fā)現其單味飲片的特征峰均可傳遞到標準湯劑的指紋圖譜中，詳見圖3。圖3中1號峰屬于甘草、梔子，2、18號峰屬于菊花、梔子，3號峰（新綠原酸）屬于菊花、梔子、白茅根，4、9（梔子苷）、19號峰為梔子專屬峰，5號峰屬于梔子、白茅根，6號峰（綠原酸）屬于菊花、梔子、白茅根、山楂，7、13號峰屬于菊花、梔子，8號峰屬于菊花、梔子、白茅根、山楂，10（甘草苷）、24（甘草酸）號峰為甘草專屬峰，11（木犀草苷）、12、14（異綠原酸A）、15、16、17、20、21（木犀草素）、22、23（山柰酚）號峰為菊花專屬峰。這表明平火茶標準湯劑制備工藝穩(wěn)定，其特征峰與主要成分在飲片和標準湯劑間的傳遞也穩(wěn)定，且歸屬關系較為清晰。

2.3 15批平火茶標準湯劑的化學計量學分析

2.3.1 聚類分析

以15批平火茶標準湯劑的24個共有峰的峰面積為原始數據，使用SPSS22.0軟件進行系統(tǒng)聚類分析，結果見圖4。由圖4可知，當組間距離為20時，可聚為3類，其中S5、S6、S8、S11、S15聚為一類，S7、S9、S10聚為一類，S1、S2、S3、S4、S12、S13、S14聚為一類，這表明不同批次樣品中各成分含量存在差異。

2.3.2 主成分分析

以15批平火茶標準湯劑的24個共有峰的峰面積為原始數據，運用SIMCA14.1軟件進行主成分分析。結果顯示，該數據矩陣的解釋率參數R2X為0.973，模型預測能力參數Q2為0.648，均大于0.5，表明該模型有較好的預測能力[11]。15批平火茶標準湯劑的主成分得分圖見圖5。由圖5可知，主成分分析與聚類分析的結果基本一致，其中S5、S6、S8、S11、S15為一類，S7、S9、S10為一類，S1、S2、S3、S4、S12、S13、S14為一類，表明15批平火茶標準湯劑中成分特征存在差異。

2.3.3 正交偏最小二乘判別分析

將15批平火茶標準湯劑的24個共有峰的峰面積數據導入SIMCA14.1軟件，進行正交偏最小二乘判別分析。結果顯示，該數據矩陣的解釋率參數R2X為0.844，模型區(qū)分參數R2Y為0.784，模型預測能力參數Q2為0.690，均大于0.5，表明模型擬合度較好，具有較高的穩(wěn)定性與預測能力[12]。15批平火茶標準湯劑的正交偏最小二乘判別分析得分圖見圖6。由圖6可知，15批平火茶標準湯劑被分為3類：S5、S6、S8、S11、S15為一類，S7、S9、S10為一類，S1、S2、S3、S4、S12、S13、S14為一類，該結果與聚類分析、主成分分析結果一致。

將15批平火茶標準湯劑的24個共有峰的峰面積數據導入SIMCA14.1軟件，以變量重要性投影值（variableimportanceintheprojection，VIP）＞1篩選差異性成分[13]，結果見圖7。由圖7可知，共篩選出7個VIP＞1的成分，分別是3（新綠原酸）、6（綠原酸）、9（梔子苷）、12、13、14（異綠原酸A）、18號峰對應的成分，表明這7個共有峰可能對樣品分類具有顯著影響，是引起15批平火茶標準湯劑質量差異的主要標志性色譜峰，這也與肖復耀等[14]的研究結論一致。

2.4 平火茶標準湯劑中指標性成分含量測定及量值傳遞研究

2.4.1 色譜條件

色譜條件同“2.2.4”項下。

2.4.2 供試品溶液的制備

按“2.2.1”項下方法分別制備15批平火茶標準湯劑的供試品溶液。

2.4.3 混合對照品溶液的制備

精密稱取異綠原酸A、梔子苷、甘草苷、甘草酸、木犀草苷對照品各適量，置于同一5mL容量瓶中，加70%甲醇制成質量濃度分別為0.6076、0.4116、0.0717、0.4322、0.0809mg/mL的單一對照品溶液。分別取上述各單一對照品溶液1mL，置于5mL容量瓶中，加70%甲醇制成質量濃度分別為0.1215、0.0823、0.0143、0.0864、0.0162mg/mL的混合對照品溶液。

2.4.4 系統(tǒng)適用性試驗

取“2.4.3”項下混合對照品溶液、“2.4.2”項下供試品溶液以及空白溶液（70%甲醇），按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖（圖8）。結果顯示，各待測色譜峰與其相鄰色譜峰間的分離度均大于1.5，理論板數均不低于10000；供試品溶液色譜圖中，在與混合對照品溶液色譜圖相對應的位置上均有相同保留時間的色譜峰，且空白溶液對測定無干擾。

2.4.5 線性關系考察

取“2.4.3”項下單一對照品溶液適量，逐級稀釋配制6個系列濃度的單一對照品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以各對照品的質量濃度（X，mg/mL）為橫坐標、峰面積積分值（Y）為縱坐標，進行線性回歸，得梔子苷、木犀草苷、異綠原酸A、甘草苷、甘草酸的線性回歸方程分別為Y＝13760767.8004X－28090.1196（R2＝1.0000）、Y＝74115257.9937X－6297.1224（R2＝1.0000）、Y＝33796166.4037X－265897.3293（R2＝0.9996）、Y＝15522544.2912X+41548.9439（R2＝0.9990）、Y＝4920602.0551X－28239.8061（R2＝0.9995）。結果表明，梔子苷、木犀草苷、異綠原酸A、甘草苷、甘草酸的質量濃度分別在0.020580～0.411600、0.001617～0.080850、0.006076～0.607600、0.005125～0.071740、0.017288～0.432200mg/mL范圍內與各自峰面積積分值線性關系良好。

2.4.6 精密度試驗

取平火茶標準湯劑凍干粉（S1），按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結果顯示，梔子苷、木犀草苷、異綠原酸A、甘草苷、甘草酸峰面積的RSD分別為1.71%、2.41%、3.14%、1.72%、2.37%（n均為6），表明該方法精密度良好。

2.4.7 重復性試驗

取平火茶標準湯劑凍干粉（S1）6份，分別按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以標準曲線法計算樣品含量。結果顯示，供試品溶液中梔子苷、木犀草苷、異綠原酸A、甘草苷、甘草酸的平均含量分別為6.6618、0.5047、4.1501、1.3184、2.6847mg/g，RSD分別為1.40%、3.95%、2.56%、3.53%、1.82%（n均為6），表示該方法重復性良好。

2.4.8 穩(wěn)定性試驗

取平火茶標準湯劑凍干粉（S1），按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，分別于制備后室溫下放置0、2、4、8、12、24h時按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，梔子苷、木犀草苷、異綠原酸A、甘草苷、甘草酸峰面積的RSD分別為2.95%、3.47%、3.01%、1.78%、1.76%（n均為6），表示平火茶標準湯劑供試品溶液在室溫下放置24h內穩(wěn)定性良好。

2.4.9 加樣回收率試驗

取已知含量的平火茶標準湯劑凍干粉（S1）6份，分別按樣品中梔子苷、木犀草苷、異綠原酸A、甘草苷、甘草酸含量的100%加入對照品，按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率與RSD。結果顯示，梔子苷、木犀草苷、甘草苷、甘草酸、異綠原酸A的平均加樣回收率分別為98.94%、98.61%、98.43%、99.72%、98.93%，RSD分別為1.13%、1.03%、1.29%、0.78%、1.79%（n均為6），RSD均小于3%，表明該方法準確度良好。

2.4.10 樣品含量及轉移率測定

取15批平火茶標準湯劑凍干粉，分別按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，以標準曲線法計算樣品中梔子苷、甘草苷、異綠原酸A、木犀草苷、甘草酸的含量，平行測定3次，并按下式計算含量的轉移率：含量的轉移率（%）＝（標準湯劑中指標性成分的含量×凍干粉的質量/稀釋倍數）/（對應批次飲片中指標性成分的含量×飲片質量）×100%（式中，各對應批次飲片中指標性成分的含量測定方法參照2020年版《中國藥典》（一部）進行操作[15]），結果見表3。最后將含量測定范圍按均值±30%計算[16]，用于擬定平火茶標準湯劑中各指標性成分的含量和轉移率的范圍。

2.5 出膏率的測定

取按“2.1”項下方法制備的平火茶標準湯劑和各單味飲片標準湯劑，各精密吸取10mL置于恒重蒸發(fā)皿中，蒸干，于105℃干燥至恒重，放干燥器冷卻后稱定質量[17]，然后按下式計算15批平火茶標準湯劑及各單味飲片標準湯劑的出膏率[18]：出膏率（%）＝mv/MV（式中，m表示干膏的質量，v表示取樣體積，M表示飲片的質量，V表示水煎液的體積）。

平火茶標準湯劑的組方為：菊花10g、梔子15g、白茅根30g、山楂15g、甘草6g，全方共76g。按各單味藥折算，全方理論出膏率（%）＝10/76×對應批次菊花飲片的出膏率+15/76×對應批次梔子飲片的出膏率+30/76×對應批次白茅根飲片的出膏率+15/76×對應批次山楂飲片的出膏率+6/76×對應批次甘草飲片的出膏率。出膏率的轉移率（%）＝全方實際出膏率/全方理論出膏率×100%；變化幅度（%）＝（全方理論出膏率－全方實際出膏率）/全方理論出膏率×100%。結果見表4。

由表4可知，15批平火茶標準湯劑的理論出膏率均值為29.24%，范圍為27.03%～33.10%，均在其均值±30%的范圍內（20.47%～38.01%）；實際出膏率均值為20.84%，范圍為17.59%～25.54%，均在其均值±30%的范圍內（14.59%～27.09%）；出膏率的變化幅度范圍為15.32%～38.85%，未出現離散數據。以上表明平火茶標準湯劑的制備工藝較為合理，穩(wěn)定可行，未造成明顯的批間差異。

3 討論

本研究前期對平火茶標準湯劑的HPLC指紋圖譜色譜條件進行了考察——對流動相考察了甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液，對柱溫考察了25、30、35℃，對進樣量考察了5、10、15μL，對流速考察了0.8、1.0mL/min，對檢測波長考察了230、238、330、348nm。結果表明，以乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動相（梯度洗脫）、柱溫為30℃、進樣量為10μL、流速為1.0mL/min時，色譜峰的分離度和峰形均較好，且基線較平穩(wěn)；檢測波長在0～37min和85～102min時設為238nm、37～85min時設為330nm的色譜峰數量較多，同時梔子苷、甘草苷、甘草酸在238nm波長處的響應值最高且峰形和分離度較好，木犀草苷、異綠原酸A在330nm波長處的響應值較高且峰形和分離度較好，故選擇以上色譜條件作為平火茶標準湯劑的HPLC指紋圖譜條件。

本研究結果顯示，15批平火茶標準湯劑HPLC指紋圖譜的相似度均不小于0.968，表明不同批次樣品所含化學成分基本一致。正交偏最小二乘判別分析結果與聚類分析及主成分分析結果一致，均可將15批樣品分為3類，表明不同批次樣品的化學成分含量存在差異，這可能與飲片來自不同產地、取樣不均一等因素有關。本研究還通過VIP＞1篩選出對樣品質量影響較大的成分，分別為峰3（新綠原酸）、峰6（綠原酸）、峰9（梔子苷）、峰12、峰13、峰14（異綠原酸A）、峰18所對應的成分。

中藥復方化學成分復雜，含量測定所選擇的化學成分不僅需要符合2020年版《中國藥典》的要求，還要確保在相應的飲片-物質基準-復方中能夠實現穩(wěn)定的質量控制。本研究所選擇的平火茶標準湯劑指標性成分梔子苷、木犀草苷、異綠原酸A、甘草苷、甘草酸均為2020年版《中國藥典》中梔子、菊花、甘草藥材的含量測定成分，也是各藥材的專屬性成分。梔子苷是君藥梔子的主要有效成分，具有解熱、抗炎、保肝等功效[19]。木犀草苷和異綠原酸A是臣藥菊花的主要藥效成分，均具有抗炎、抗病毒、抗菌、熄內熱、平肝火等功效[20]。甘草苷和甘草酸為甘草中的主要藥效成分，具有抗菌、抗炎等多種作用[21]。由于綠原酸在幾種藥材中都有，成分專屬性不強，因此沒有將其作為指標性成分進行測定。本研究結果顯示，平火茶標準湯劑中梔子苷、木犀草苷、異綠原酸A、甘草苷、甘草酸的含量范圍分別為3.2279～10.0022、0.2974～0.5546、3.3501～6.1596、0.7206～1.0733、2.0031～3.0301mg/g，飲片-標準湯劑的含量轉移率范圍分別為19.7628%～35.8405%、12.1233%～21.2540%、46.0972%～82.8694%、58.7088%～91.6296%、39.1143%～63.7106%；15批平火茶標準湯劑中梔子苷、木犀草苷、異綠原酸A、甘草苷、甘草酸含量的轉移率均在均值±30%范圍內，部分批次指標性成分含量的轉移率差別較大可能與飲片產地不同有關[22]。另外，本研究還發(fā)現，產地為江西宜春的梔子中梔子苷的含量及其轉移率較產地為湖北江陵、河南唐河的更高，產地為內蒙古鄂爾多斯的甘草中甘草苷、甘草酸的含量及其轉移率較產地為甘肅隴西、新疆阿勒泰的更高，產地為安徽滁州的菊花中木犀草苷、異綠原酸A的含量及其轉移率較產地為浙江桐鄉(xiāng)、河南焦作的更高。另外，15批樣品的實際出膏率均小于理論出膏率；出膏率的轉移率范圍為61.15%～84.68%，均在其均值±30%范圍內（49.89%～92.65%），表明平火茶標準湯劑煎煮工藝穩(wěn)定。本研究以實際出膏率范圍（17.59%～25.54%）作為上下限，建議平火茶標準湯劑的出膏率范圍為17%～25%。

綜上所述，本研究所建立的平火茶標準湯劑的HPLC指紋圖譜和含量測定方法簡單且準確度高，可為該制劑的量值傳遞研究、質量控制、臨床應用及后續(xù)制劑的開發(fā)提供參考。