摘""要：毛葉芋蘭（Nervilia"plicata）是一種珍稀南藥，目前對(duì)其有效成分及其分子調(diào)控機(jī)理鮮有報(bào)道。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time"quantitative"PCR，"qRT-PCR）在植物基因表達(dá)分析中得到了廣泛應(yīng)用，但在毛葉芋蘭中缺少研究，限制了相關(guān)工作的開(kāi)展。在前期工作基礎(chǔ)上，本研究從毛葉芋蘭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出Actin、GAPDH、TUA、UBC、UBQ、EF-1α、EF-1β、CYP、RPL"共9個(gè)常見(jiàn)管家基因，以毛葉芋蘭葉片、葉柄和球莖3個(gè)組織部位為材料，開(kāi)展qRT-PCR內(nèi)參基因的篩選工作。經(jīng)過(guò)9個(gè)基因在不同組織的表達(dá)水平、穩(wěn)定性和綜合分析，篩選出最適合的內(nèi)參基因，并選擇毛葉芋蘭花青素合成途徑關(guān)鍵基因NpDFR、Np3GT進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：EF-1α和CYP的表達(dá)穩(wěn)定性相近，整體穩(wěn)定性最好。2個(gè)內(nèi)參基因單獨(dú)或共同使用時(shí)，NpDFR、Np3GT在不同組織的表達(dá)情況與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果基本一致，表明其均可用作qRT-PCR的內(nèi)參基因。本研究結(jié)果為進(jìn)一步開(kāi)展毛葉芋蘭藥效相關(guān)基因的分子作用機(jī)理研究提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：毛葉芋蘭；內(nèi)參基因；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；表達(dá)穩(wěn)定性中圖分類號(hào)：S567.2""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Selection"and"Validation"of"qRT-PCR"Reference"Genes"in"Different"Tissues"of"Nervilia"plicata

CHI"Jiayi，"LIU"Shuxuan，"XIANG"Sishi，"ZHAN"Ruoting，"HE"Rui*

Research"Center"of"Chinese"Herbal"Resource"Science"and"Engineering，"Guangzhou"University"of"Chinese"Medicine"/"Key"Laboratory"of"Chinese"Medicinalnbsp;Resource"from"Lingnan，"Ministry"of"Education，"Guangzhou"University"of"Chinese"Medicine"/"School"of"Pharmaceutical"Sciences，"Guangzhou"University"of"Chinese"Medicine，"Guangzhou，"Guangdong"510006，"China

Abstract："Nervilia"plicata"is"a"rare"southern"Chinese"herb."The"study"on"the"plant"at"molecular"level"is"hardly"seen."Real-time"quantitative"PCR"（qRT-PCR）"has"been"widely"used"innbsp;plant"gene"expression"analysis，"but"there"is"a"lack"of"research"on"it"in"N."plicata，"which"limits"the"progress"of"related"work."Based"on"the"previous"researches，"nine"candidate"reference"genes，"including"Actin，"GAPDH，"TUA，"UBC，"UBQ，"EF-1α，"EF-1β，"CYP"and"RPL，"were"screened"out"from"the"transcriptomic"sequencing"data."In"order"to"select"suitable"reference"gene"in"N."plicata，"qRT-PCR"technique"was"employed"to"detect"the"expression"levels"of"the"candidate"reference"genes"in"leaf，"petiole"and"corm"tissues"of"the"plant."After"analyzing"the"expression"levels，"the"stability"and"comprehensive"analysis"of"nine"genes"in"different"tissues，"the"most"suitable"reference"gene"was"obtained."Finally，"the"most"suitable"reference"gene"was"validated"using"NpDFR，"Np3GT"that"related"to"anthocyanin"synthesis."Results"showed"that"the"expression"stability"of"EF-1"α"and"CYP"was"similar，"with"the"best"overall"stability."When"using"either"EF-1α"or"CYP，"or"the"combination"of"them，"as"reference，"the"expression"patterns"of"NpDFR"and"Np3GT"in"different"tissues"were"consistent"with"the"transcriptome"sequencing"results."This"indicates"that"both"EF-1"α"and"CYP"can"be"used"as"reference"genes"in"N."plicata"for"qRT-PCR."This"study"would"provide"a"basis"for"further"research"on"the"molecular"mechanism"of"genes"related"to"the"pharmacological"effects"of"N."plicata.

Keywords："Nervilia"plicata;"reference"gene;"qRT-PCR;"expression"stability

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.01.004

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time"quantitative"PCR，"qRT-PCR）是將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和熒光染料相結(jié)合的檢測(cè)技術(shù)，能以較高的靈敏度和特異度實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)模板擴(kuò)增的反應(yīng)進(jìn)程[1]，是定量分析樣品中核酸分子的最常用的分子生物學(xué)技術(shù)之一[2]。因其快速簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確性高，qRT-PCR技術(shù)被普遍應(yīng)用于生命科學(xué)及其相關(guān)領(lǐng)域，具有廣泛應(yīng)用價(jià)值。常用于基因表達(dá)分析、突變檢測(cè)、物種鑒定等[3]。

qRT-PCR結(jié)果的準(zhǔn)確可靠性可能受到如RNA質(zhì)量、逆轉(zhuǎn)錄、引物的特異性和實(shí)驗(yàn)者操作精準(zhǔn)性等的影響[4]。為了避免這些因素的影響，準(zhǔn)確反映目的基因的表達(dá)水平，在qRT-PCR過(guò)程中使用一個(gè)或多個(gè)合適的基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化至關(guān)重要[5]。這種能用于標(biāo)準(zhǔn)化qRT-PCR數(shù)據(jù)的基因即為內(nèi)參基因（reference"gene），一般為管家基因。管家基因如GAPDH、Actin、18S"rRNA、tubulin、EF-1α、ubiquitin等在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)都相對(duì)穩(wěn)定，可用作基因相對(duì)表達(dá)分析檢測(cè)的參考。然而，內(nèi)參基因的表達(dá)水平也會(huì)因物種差異、生物生長(zhǎng)發(fā)育階段的變化或?qū)嶒?yàn)條件的不同而發(fā)生變化，因此在特定條件下，必須對(duì)所選取的內(nèi)參基因進(jìn)行表達(dá)穩(wěn)定性的驗(yàn)證[6]。geNorm、NormFinder和Bestkeeper為目前評(píng)估內(nèi)參基因穩(wěn)定性的3種主流軟件[7-8]。

毛葉芋蘭[Nervilia"plicata"（Andr.）"Schitr.]是蘭科芋蘭屬珍稀藥用植物?！吨袊?guó)植物志》[9-10]中記載該植物具利肺止咳、益腎、解毒止痛之功效，其主要藥效化學(xué)成分為黃酮類物質(zhì)[10]。目前針對(duì)毛葉芋蘭的研究非常少，基本只有關(guān)于其物種鑒定和化學(xué)成分研究的報(bào)道，缺少對(duì)其有效成分及其分子調(diào)控機(jī)理的研究。qRT-PCR技術(shù)在植物基因表達(dá)分析中被廣泛應(yīng)用，但在毛葉芋蘭中也缺乏相關(guān)研究，尚未見(jiàn)其內(nèi)參基因篩選的報(bào)道，這限制了相關(guān)工作的進(jìn)一步開(kāi)展。

本研究以毛葉芋蘭的葉、葉柄、球莖3個(gè)部位為材料，從前期獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中選取9個(gè)常見(jiàn)管家基因（Actin、GAPDH、TUA、UBC、UBQ、EF-1α、EF-1β、CYP、RPL）作為候選內(nèi)參基因，利用qRT-PCR檢測(cè)它們?cè)?個(gè)不同部位的表達(dá)情況，結(jié)合?Ct法分析，采用geNorm、NormFinder和Bestkeeper軟件以及RefFinder程序分析并篩選出毛葉芋蘭不同組織部位表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，為進(jìn)一步采用分子生物學(xué)技術(shù)研究毛葉芋蘭及其他蘭科植物奠定基礎(chǔ)。

1""材料與方法

1.1""材料

本研究所用植物材料種植于廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院資源中心植物培養(yǎng)室，經(jīng)相關(guān)參考文獻(xiàn)并結(jié)合《中國(guó)植物志》[9-11]中形態(tài)描述及其來(lái)源地等鑒定為毛葉芋蘭（Nervilia"plicata）。選擇葉片完全伸展的3株毛葉芋蘭植株，于2023年8月采集葉片、葉柄和球莖，用DEPC水將采摘的樣本清洗干凈，立即液氮速凍，轉(zhuǎn)移并保存于–80"℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2""方法

1.2.1""RNA提取以及cDNA合成""使用RNA提取試劑盒（CW2598S，CWBIO）按說(shuō)明書(shū)提取毛葉芋蘭的RNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所獲RNA的完整性；使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（R223，Vazyme）將檢驗(yàn)合格的RNA樣品反轉(zhuǎn)錄成"cDNA，儲(chǔ)存于–20"℃冰箱備用。

1.2.2""內(nèi)參基因的篩選及其引物設(shè)計(jì)""參考已發(fā)表的近緣物種內(nèi)參基因序列，對(duì)已完成測(cè)序的毛葉芋蘭不同組織部位的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（未發(fā)表）進(jìn)行本地蛋白序列blast，結(jié)合從數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出的注釋為9個(gè)基因的所有轉(zhuǎn)錄本，進(jìn)一步以每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)映射讀取的碎片（FPKM值）gt;100且變異系數(shù)（coefficient"of"variation，"CV）最小為篩選標(biāo)準(zhǔn)，獲得9個(gè)候選內(nèi)參基因，根據(jù)其各自核苷酸序列采用Primer"Premier"5.0軟件設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)引物（表1）。

1.2.3""引物特異性檢測(cè)""以反轉(zhuǎn)錄后得到的總cDNA原液為模板，使用Premix"Taq"（TaKaRa"Taq?"version"2.0"plus"dye）（RR902Q）進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：Premix"Taq"（TaKaRa"Taq?"version"2.0"plus"dye）"12.5"μL，上游引物"0.5"μL，下游引物"0.5"μL，添加ddH2O至25"μL，PCR反應(yīng)程序參照試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)置。所設(shè)計(jì)的引物其特異性通過(guò)3.0"%瓊脂糖凝膠電泳初步檢測(cè)，并在qRT-PCR后觀察熔解曲線進(jìn)一步確認(rèn)。

1.2.4""qRT-PCR以及引物擴(kuò)增效率檢測(cè)""使用伯樂(lè)CFX96"real-time"PCR"定量分析儀和Biosharp"universal"SYBR"qPCR"Master"Mix"（BL697A）試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。參照說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系：cDNA模板1"μL（以cDNA原液5倍稀釋液為模板），上游引物"0.4"μL，下游引物0.4"μL，2×universal"SYBR"green"master"mix"10"μL，ddH2O"8.2"μL。參照說(shuō)明書(shū)設(shè)置2步法qRT-PCR"反應(yīng)程序。

將毛葉芋蘭的葉、葉柄、球莖的cDNA等量混勻成1份總cDNA模板，依次稀釋50、51、52、53、54倍共5個(gè)濃度梯度，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。使用Excel軟件，以5個(gè)稀釋倍數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)、其對(duì)應(yīng)的Ct值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線及其斜率（K），利用公式E=（10–1/K–1）×100%計(jì)算[12]，得到各內(nèi)參引物的擴(kuò)增效率（E）。

1.2.5""內(nèi)參基因的qRT-PCR及其數(shù)據(jù)分析""以毛葉芋蘭各樣品cDNA的5倍稀釋液為模板，對(duì)各候選內(nèi)參基因進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系和程序同1.2.4，每個(gè)樣品進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。

首先對(duì)各候選內(nèi)參基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析，將每組qRT-PCR獲得的各部位所有Ct值繪制成箱線圖。穩(wěn)定性分析是使用?Ct法對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，同時(shí)將原始數(shù)據(jù)輸入到BestKeeper軟件進(jìn)行分析。各內(nèi)參基因的相對(duì)表達(dá)量通過(guò)2–ΔΔCt法計(jì)算獲得，將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化后，再分別輸入到geNorm和NormFinder軟件進(jìn)行分析，最后使用RefFinder在線程序?qū)λ薪Y(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)估，篩選出在毛葉芋蘭不同組織中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

1.2.6""內(nèi)參基因穩(wěn)定性驗(yàn)證""通過(guò)綜合評(píng)估篩選的最優(yōu)的2個(gè)基因被選作為內(nèi)參基因。利用qRT-PCR檢測(cè)毛葉芋蘭葉片與球莖中（轉(zhuǎn)錄組未測(cè)葉柄）花青素代謝途徑關(guān)鍵酶基因NpDFR、Np3GT的表達(dá)情況，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，驗(yàn)證這2個(gè)最優(yōu)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性。

2""結(jié)果與分析

2.1""RNA質(zhì)量檢測(cè)

使用超微量分光光度計(jì)（型號(hào)：Nanodrop"Lite）檢測(cè)提取獲得的RNA的濃度和純度，各樣品濃度為69.0～133.7"ng/μL，A260/A280值均在"2.0～2.2范圍，說(shuō)明其純度較好，電泳檢測(cè)均具有"28S"RNA、18S"RNA"2個(gè)條帶，且未出現(xiàn)彌散現(xiàn)象，滿足后續(xù)試驗(yàn)的要求。

2.2""內(nèi)參基因引物特異性檢測(cè)及擴(kuò)增效率分析

按照1.2.2方法，從毛葉芋蘭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出9個(gè)候選內(nèi)參基因Actin、GAPDH、TUA、UBC、UBQ、EF-1α、EF-1β、CYP、RPL，其普通PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示清晰單一的條帶，各內(nèi)參基因擴(kuò)增出"116～291"bp符合預(yù)期大小的特異性片段（圖1），表明設(shè)計(jì)的引物可用于后續(xù)"qRT-PCR"分析。

進(jìn)一步驗(yàn)證所設(shè)計(jì)引物的特異性并分析其擴(kuò)增效率，9個(gè)候選內(nèi)參基因的熔解曲線均呈現(xiàn)出清晰的單一峰值特征，說(shuō)明無(wú)引物二聚體形成或非特異性擴(kuò)增，熔解曲線的Tm值均在80～85"℃之間（圖2）；按1.2.4方法在Excel中計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（R2）介于0.9906～0.9969之間，線性關(guān)系良好，擴(kuò)增效率（E）介于91.21%～120.60%之間（表2），9個(gè)內(nèi)參基因的引物均符合后續(xù)分析要求。

2.3""內(nèi)參基因的表達(dá)水平分析

Ct值代表內(nèi)參基因的表達(dá)水平，基因的Ct值若較低，則通常指示其具有較高的表達(dá)水平，反之則表達(dá)水平較低。毛葉芋蘭的3個(gè)組織部位中9個(gè)候選內(nèi)參基因的Ct值范圍為20.686～"26.470，其中平均Ct值最大與最小的基因分別是RPL（25.631）和EF-1α（22.342），說(shuō)明RPL表達(dá)豐度最低，EF-1α最高。9個(gè)候選內(nèi)參基因在表達(dá)豐度上的排序?yàn)椋篍F-1αgt;GAPDHgt;UBCgt;CYPgt;UBQgt;"EF-1βgt;TUAgt;Actin＞RPL。

Ct值的波動(dòng)反映穩(wěn)定性，波動(dòng)越小表示基因表達(dá)越穩(wěn)定。將Ct值繪制成箱線圖，以初步評(píng)估各候選內(nèi)參基因表達(dá)水平的離散程度。其中GAPDH的箱線最長(zhǎng)，說(shuō)明其表達(dá)豐度變異性最大，穩(wěn)定性最差，而EF-1β箱線最短，其Ct值為23.072～23.710，波動(dòng)?。▓D3）。從表達(dá)豐度來(lái)看EF-1β基因可能是毛葉芋蘭不同組織中較為穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

箱體中的橫線表示中位數(shù)，箱體的上、下邊線分別表示第三四分位數(shù)、第一四分位數(shù)，箱體上、下方橫線分別表示上限、下限。

2.4""內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

2.4.1""?Ct法分析""將候選內(nèi)參基因兩兩配對(duì)，計(jì)算對(duì)應(yīng)的各樣本中配對(duì)的2個(gè)內(nèi)參基因的?Ct值（圖4），再算出配對(duì)的2個(gè)內(nèi)參基因于所有樣本間?Ct值的標(biāo)準(zhǔn)偏差（standard"deviation，"SD），最后分別得到9個(gè)候選內(nèi)參基因?Ct值的平均標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD"mean）。

將TUA和CYP分別與其他8個(gè)基因進(jìn)行比較

時(shí)，它們與較小偏離量相關(guān)（SD"mean分別為0.359和0.363），因此這2個(gè)基因的變異性較小。但將GAPDH和EF-1β分別與其他8個(gè)基因進(jìn)行比較時(shí)，偏差（SD"mean分別為0.725和0.744）明顯增加，表明其變異大。EF-1α、Actin、UBQ、UBC和RPL都顯示出中等水平的偏差（SD"mean分別為0.371、0.372、0.419、0.564和0.593）。SD"mean越小預(yù)示著基因越穩(wěn)定，由此可見(jiàn)最穩(wěn)定的基因?yàn)門(mén)UA，最不穩(wěn)定的基因?yàn)镋F-1β。

2.4.2""geNorm分析""結(jié)果顯示9個(gè)候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定M值均在1.5以下，說(shuō)明它們的穩(wěn)定性均較好，9個(gè)候選基因都可以用作毛葉芋蘭的內(nèi)參基因（圖5）。9個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性由geNorm軟件分析排序依次為EF-1α=CYP（0.092）gt;TUA（0.120）gt;Actin（0.141）gt;UBQ（0.189）gt;UBC（0.279）gt;RPL（0.360）gt;GAPDH（0.432）gt;EF-1β（0.501）。

geNorm軟件對(duì)輸入的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次自動(dòng)分析，分析內(nèi)參基因平均穩(wěn)定性的變化水平，通過(guò)計(jì)算配對(duì)變異值（Vn/Vn+1）來(lái)預(yù)測(cè)最佳內(nèi)參基因的個(gè)數(shù)。在本研究中，配對(duì)變異分析結(jié)果顯示（圖6），所有配對(duì)變異值均小于0.15，即從圖中最穩(wěn)定的2個(gè)基因（最左邊）開(kāi)始，V2/V3lt;0.15，表明在毛葉芋蘭各組織樣品中使用2個(gè)內(nèi)參基因可以達(dá)到理想的校正效果，綜合第一次分析結(jié)果，geNorm軟件的結(jié)論是可選擇EF-1α和CYP"2個(gè)基因作為毛葉芋蘭的內(nèi)參基因。

2.4.3""NormFinder分析""NormFinder軟件的分析與geNorm相似，其分析所得結(jié)果穩(wěn)定值（stability"value，"SV）越低的候選基因，則表示擁有更高的內(nèi)參基因穩(wěn)定性。

在該軟件分析中，候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性依次為T(mén)UA（0.181）gt;CYP（0.208）gt;EF-1α（0.220）gt;"UBQ（0.255）gt;UBC（0.278）gt;Actin（0.285）gt;GAPDH（0.762）gt;RPL（0.786）gt;EF-1β（1.999），與geNorm"軟件分析的結(jié)果排名趨勢(shì)相似（圖5）。其中TUA、CYP、EF-1α的SV最小，說(shuō)明這3個(gè)基因穩(wěn)定性最高，TUA被NormFinder軟件選為最優(yōu)內(nèi)參基因。

2.4.4""Bestkeeper分析""BestKeeper通過(guò)計(jì)算CV與SD，來(lái)反映內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。當(dāng)CV與SD的值都較低時(shí)，則說(shuō)明該基因具有更高的穩(wěn)定性。其中SD的默認(rèn)閾值為1.0，當(dāng)SD低于1.0時(shí)則認(rèn)為該基因表達(dá)穩(wěn)定。分析結(jié)果顯示，在毛葉芋蘭不同組織中，GAPDH的SD（1.14）高于默認(rèn)閾值，提示不宜作為此物種的內(nèi)參基因，其余8個(gè)基因的SD均小于默認(rèn)閾值，說(shuō)明它們的表達(dá)也均較為穩(wěn)定；其中EF-1β的CV與SD都最低，穩(wěn)定性最好（圖7）。

2.4.5""RefFinder分析""使用RefFinder在線分析網(wǎng)站進(jìn)行綜合評(píng)估。結(jié)果顯示（圖8），各內(nèi)參基因在不同組織中的表達(dá)穩(wěn)定性綜合排序由高到低依次為EF-1α、CYP、TUA、UBQ、UBC、Actin、EF-1β、RPL、GAPDH。其中EF-1α和"CYP"的表達(dá)穩(wěn)定性相近，整體穩(wěn)定性最好，適合作為毛葉芋蘭的內(nèi)參基因；而穩(wěn)定性最差的是"GAPDH，提示該基因不適合作為毛葉芋蘭熒光定量PCR的內(nèi)參基因。

2.5""內(nèi)參基因穩(wěn)定性驗(yàn)證單獨(dú)使用和組合使用綜合排名最靠前的2個(gè)內(nèi)參基因EF-1α和CYP，對(duì)毛葉芋蘭的葉片和球莖2個(gè)組織部位中花青素代謝途徑關(guān)鍵基因NpDFR、Np3GT的表達(dá)差異進(jìn)行分析，并與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，驗(yàn)證所選的這2個(gè)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，單獨(dú)或者組合使用EF-1α和CYP作為內(nèi)參基因時(shí)，同一目的基因在不同器官中的表達(dá)情況相同，即2個(gè)目的基因在毛葉芋蘭葉片中的相對(duì)表達(dá)均高于在球莖中的表達(dá)，這與轉(zhuǎn)錄組所測(cè)得的這2個(gè)目的基因在2個(gè)器官中FPKM值的大小是一致的（圖9）。說(shuō)明單獨(dú)或者組合使用EF-1α和CYP作為qRT-PCR的內(nèi)參基因都能夠較準(zhǔn)確得出毛葉芋蘭各部位中各基因的相對(duì)表達(dá)量。

3""討論

合適的內(nèi)參基因?qū)τ诜治瞿繕?biāo)基因表達(dá)情況的準(zhǔn)確性和可靠性非常重要。β-tubulin可作為毛唇芋蘭（Nervilia"plicata）qRT-PCR的校正內(nèi)參基因[13]。適于鐵皮石斛（Dendrobium"officinale）不同組織的內(nèi)參基因?yàn)镋F-1α或18S"rRNA[14]，其中前者在鐵皮石斛葉色突變體中被驗(yàn)證為穩(wěn)定且可靠[15]；而在其原球莖時(shí)期的所有樣本中，傳統(tǒng)的管家基因表達(dá)穩(wěn)定性均較差，研究篩選得到的內(nèi)參基因組合不是常用的管家基因，而是ASS+APH1L[15-16]；蕙蘭（Cymbidium"faberi）中可以選用ACT、UBQ3或GAPDH作為其所有時(shí)期所有器官的內(nèi)參基因使用，但單獨(dú)分析某器官或者某生長(zhǎng)期的目標(biāo)基因表達(dá)情況時(shí)，采用其中2個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行歸一化處理能得到更為準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)[17]；蝴蝶蘭（Phalaenopsis"spp.）的整個(gè)發(fā)育階段各組織的最適內(nèi)參基因是ACT[18]，而低溫脅迫條件下，PhPP2Aa基因最適合作為目的基因轉(zhuǎn)錄水平研究的內(nèi)參基因[19]。內(nèi)參基因的穩(wěn)定性因物種及其組織部位、生長(zhǎng)發(fā)育階段和脅迫條件的不同而有所變化，因此應(yīng)該為研究的特定的物種或新的試驗(yàn)條件選擇最穩(wěn)定的參考基因[20]。

球莖是毛葉芋蘭的繁殖器官，其主要為圓球或橢圓形，球莖上長(zhǎng)有細(xì)弱的匍匐莖或根狀莖，每個(gè)球莖上每年只長(zhǎng)1～2片葉，極少見(jiàn)開(kāi)花。且芋蘭屬植物即便開(kāi)花也多為先開(kāi)花，花落后才長(zhǎng)"出葉子，僅有個(gè)別物種可以同時(shí)見(jiàn)到花和葉子[21]。本研究所種植的毛葉芋蘭均未能觀察到開(kāi)花者，且植物材料個(gè)體少而小、根和根莖細(xì)小，也無(wú)法獲得足夠質(zhì)量的根和根莖，故選取葉片、葉柄和球莖作為研究材料。前期研究發(fā)現(xiàn)β-tubulin（TUB）可用作近源物種毛唇芋蘭的qRT-PCR研究中的內(nèi)參基因[13]，但本研究前期發(fā)現(xiàn)該基因在毛葉芋蘭中表達(dá)水平較低（以51倍總cDNA稀釋液作為模板時(shí)Ct值最小值為27.820），制作標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗(yàn)中以53倍總cDNA稀釋液作為模板時(shí)已無(wú)法檢測(cè)到相應(yīng)Ct值，因此未選擇該內(nèi)參基因進(jìn)行后續(xù)分析。

經(jīng)穩(wěn)定性分析，發(fā)現(xiàn)Bestkeeper篩選出排行第一位的基因?yàn)镋F-1β，而使用其他3種方法所得結(jié)果中EF-1β排在最后一位，Bestkeeper與其他分析方法所得結(jié)果不一樣的情況在其他植物的內(nèi)參基因篩選研究中也報(bào)道過(guò)[22-23]。不同軟件的統(tǒng)計(jì)學(xué)算法不同，結(jié)果亦不同：Bestkeeper是將測(cè)得的所有Ct值直接輸入軟件中，計(jì)算目的基因的組內(nèi)差異，比較不同基因的CV與SD并進(jìn)行穩(wěn)定性排序，穩(wěn)定性與其在各樣品中Ct值的離散程度密切相關(guān)，Ct值的變化范圍越小，則基因的穩(wěn)定性通常越高。?Ct法也是對(duì)原始數(shù)據(jù)直接計(jì)算，比較每個(gè)樣本中“成對(duì)基因”的相對(duì)表達(dá)量，若ΔCt有波動(dòng)，說(shuō)明其中1個(gè)或2個(gè)基因都是可變的，可引入更多的基因繼續(xù)比較，綜合比較哪個(gè)基因的變異性更小[24]。從圖4可見(jiàn)若引入EF-1β，其他與之匹配的組合?Ct值的波動(dòng)幅度增大。geNorm和NormFinder與前2個(gè)方法不同的是，首先都要將Ct值轉(zhuǎn)化成相對(duì)定量數(shù)據(jù)，再輸入到各軟件自動(dòng)尋找各候選基因在不同樣本中的最高Ct值，再將所有測(cè)得的各基因的Ct值減去所找到的最高Ct值，最后計(jì)算表達(dá)水平比率，結(jié)合組內(nèi)和組間的差異進(jìn)行分析?？梢?jiàn)對(duì)所有軟件得出的結(jié)果需要進(jìn)行綜合評(píng)估，結(jié)合并驗(yàn)證，才能篩選到最適合的內(nèi)參基因。

4""結(jié)論

本研究利用qRT-PCR技術(shù)，使用?Ct法初步分析，并結(jié)合3種常用軟件geNorm、NormFinder、Bestkeeper與RefFinder程序，綜合評(píng)估能用于標(biāo)準(zhǔn)化qRT-PCR數(shù)據(jù)的9個(gè)候選內(nèi)參基因（Actin、GAPDH、TUA、UBC、UBQ、EF-1α、EF-1β、CYP、RPL）在毛葉芋蘭不同組織部位的穩(wěn)定性，結(jié)果表明9個(gè)內(nèi)參基因綜合排序?yàn)镋F-1αgt;CYPgt;"TUAgt;UBQgt;UBCgt;Actingt;EF-1βgt;RPLgt;GAPDH。其中單獨(dú)或聯(lián)合使用EF-1α和CYP作為內(nèi)參基因，NpDFR與Np3GT在不同組織的表達(dá)情況與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果基本一致。EF-1α和CYP皆可作為毛葉芋蘭qRT-PCR的內(nèi)參基因，用于不同組織間基因表達(dá)的差異性分析試驗(yàn)。

參考文獻(xiàn)

[1]"CHEN"Z，"HALFORD"N"G，"LIU"C."Real-time"quantitative"PCR："primer"design，"reference"gene"selection，"calculations"and"statistics[J]."Metabolites，"2023，"13（7）："806.

[2]"TAYLOR"S"C，"NADEAU"K，"ABBASI"M，"LACHANCE"C，"NGUYEN"M，"FENRICH"J."The"ultimate"qPCR"experiment："producing"publication"quality，"reproducible"data"the"first"time[J]."Trends"in"Biotechnology，"2019，"37（7）："761-774.

[3]"ARTIKA"I"M，"DEWI"Y"P，"NAINGGOLAN"I"M，"SIREGAR"J"E，"ANTONJAYA"U."Real-time"polymerase"chain"reaction："current"techniques，"applications，"and"role"in"COVID-19"diagnosis[J]."Genes，"2022，"13（12）："2387.

[4]"ZHANG"P"L，"CHEN"S"Y，"CHEN"S"Y，"ZHU"Y"M，"LIN"Y"Q，"XU"X"Y，"LIU"Z"J，"ZOU"S"Q."Selection"and"validation"of"qRT-PCR"internal"reference"genes"to"study"flower"color"formation"in"Camellia"impressinervis[J]."International"Journal"of"Molcular"Sciences，"2024，"25（5）："3029.

[5]"KOZERA"B，"RAPACZ"M."Reference"genes"in"real-time"PCR[J]."Journal"of"Applied"Genetics，"2013，"54（4）："391-406.

[6]"CHEN"C"B，"WU"J"Y，"HUA"Q"Z，"TEL-ZUR"N，"XIE"F"F，"ZHANG"Z"K，"CHEN"J"Y，"ZHANG"R，"HU"G"B，"ZHAO"J"T，"QIN"Y"H."Identification"of"reliable"reference"genes"for"quantitative"real-time"PCR"normalization"in"pitaya[J]."Plant"Methods，"2019，"15："1-12.

[7]"HELLEMANS"J，"VANDESOMPELE"J."Selection"of"reliable"reference"genes"for"RT-qPCR"analysis[J]."Methods"and"Protocols，"2014，"1160："19-26.

[8]"DE"SPIEGELAERE"W，"DERN-WIELOCH"J，"WEIGEL"R，"SCHUMACHER"V，"SCHORLE"H，"NETTERSHEIM"D，"BERGMANN"M，"BREHM"R，"KLIESCH"S，"VANDEKERCKHOVE"L，"FINK"C."Reference"gene"validation"for"RT-qPCR，"a"note"on"different"available"software"packages[J]."PLoS"One，"2015，"10（3）："e0122515.

[9]"中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì)."中國(guó)植物志："第十八卷，"被子植物門(mén)"單子葉植物綱蘭科2[M]."北京："科學(xué)出版社，"1999："27-28."""""""""""Editorial"Committee"of"Flora"of"China，"Chinese"Academy"of"Sciences."Flora"of"China："Volume"18，"Orchidae"2"in"the"class"monocotyledons"of"the"phylum"angiosperms[M]."Beijing："Science"Press，"1999："27-28."（in"Chinese）

[10]"劉主潔，"程銀平，"林朝展，"祝晨蔯."青天葵及其近緣種毛葉青天葵的HPLC指紋圖譜鑒別研究[J]."中藥材，"2015，"38（12）："2514-2517.LIU"Z"J，"CHENG"Y"P，"LIN"Z"Z，"ZHU"C"C."HPLC"fingerprints"of"Nerviliae"fordii"and"Nervilia"plicata[J]."Journal"of"Chinese"Medicinal"Materials，"2015，"38（12）："2514-2517."（in"Chinese）

[11]"文和群，"許兆然，"VILLA-LOBOS"J，"SKOG"L"E."中國(guó)南部石灰?guī)r稀有瀕危植物名錄[J]."廣西植物，"1993，"13（2）："110-127.WEN"H"Q，"XU"Z"R，"VILLA-LOBOS"J，"SKOG"L"E."A"list"of"threatened"limestone"plants"in"south"China[J]."Guihaia，"1993，"13（2）："110-127."（in"Chinese）

[12]"王浩，"蔡啟忠，"劉露，"楊全，"周良云."何首烏實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參基因篩選[J]."中國(guó)中藥雜志，"2021，"46（1）："80-85.WANG"H，"CAI"Q"Z，"LIU"L，"YANG"Q，"ZHOU"L"Y."Reference"gene"screening"for"real-time"quantitative"PCR"in"Polygonum"multiflorum[J]."China"Journal"of"Chinese"Materia"Medica，"2021，"46（1）："80-85."（in"Chinese）

[13]"黃瓊林，"梁凌玲，"何瑞，"詹若挺，"陳蔚文."青天葵實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參基因的選擇[J]."中草藥，"2013，"44（14）："1979-1983.HUANG"Q"L，"LIANG"L"L，"HE"R，"ZHAN"R"T，"CHEN"W"W."Selection"of"reference"genes"for"real-time"fluorescence"quantitative"PCR"in"Nervilia"Fordii"Folium[J]."Chinese"Traditional"and"Herbal"Drugs，"2013，"44（14）："1979-1983."（in"Chinese）

[14]"張崗，"趙明明，"張大為，"郭順星."鐵皮石斛實(shí)時(shí)定量PCR"內(nèi)參基因的篩選[J]."中國(guó)藥學(xué)雜志，"2013，"48（19）："1664-1668.ZHANG"G，"ZHAO"M"M，"ZHANG"D"W，"GUO"S"X."Reference"gene"selection"for"real-time"quantitative"PCR"analysis"of"Dendrobium"officinale[J]."Chinese"Pharmaceutical"Journal，"2013，"48（19）："1664-1668."（in"Chinese）

[15]"CAO"H，"LI"H，"LU"L，"JI"Y"L，"MA"L"L，"LI"S"C."Screening"and"validation"of"internal"reference"genes"for"quantitative"real-time"PCR"analysis"of"leaf"color"mutants"in"Dendrobium"officinale[J]."Genes，"2023，"14（5）："1112.

[16]"AN"H"Q，"ZHU"Q"K，"PEI"W，"FAN"W，"LIANG"L，"CUI"Y"H，"LYU"N，"WANG"W"J."Whole-transcriptome"selection"and"evaluation"of"internal"reference"genes"for"expression"analysis"in"protocorm"development"of"Dendrobium"officinale"Kimura"et"Migo[J]."PLoS"One，"2016，"11（11）："e0163478.

[17]"田云芳."蕙蘭內(nèi)參基因的篩選與A類花發(fā)育基因的表達(dá)特性研究[D]."鄭州："河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，"2013.TIAN"Y"F."Study"on"selection"of"reference"genes"and"A-class"floral"development"gene"expression"pattern"from"Cymbidium"faberi[D]."Zhengzhou："Henan"Agricultural"University，"2013."（in"Chinese）

[18]"YUAN"X"Y，"JIANG"S"H，"WANG"M"F，"MA"J，"ZHANG"X"Y，"CUI"B."Evaluation"of"internal"control"for"gene"expression"in"Phalaenopsis"by"quantitative"real-time"PCR[J]."Applied"Biochemistry"and"Biotechnology，"2014，"173（6）："1431-1445.

[19]"梁芳，"許申平，"張燕，"王默霏，"崔波."蝴蝶蘭PhPP2Aa基因作為低溫脅迫內(nèi)參基因的研究[J]."熱帶作物學(xué)報(bào)，"2022，"43（7）："1338-1346.LIANG"F，"XU"S"P，"ZHANG"Y，"WANG"M"F，"CUI"B."Phpp2Aa"as"reference"gene"in"Phalaenopsis"under"low-temperature"stress[J]."Chinese"Journal"of"Tropical"Crops，"2022，"43（7）："1338-1346."（in"Chinese）

[20]"MAROUFI"A，"VAN"BOCKSTAELE"E，"DE"LOOSE"M."Validation"of"reference"genes"for"gene"ex-pression"analysis"in"chicory"（Cichorium"intybus）"using"quantitative"real-time"PCR[J]."BMC"Molecular"Biology，"2010，"11："1-12.

[21]"GALE"S"W，"LI"J"H，"KINOSHITA"A，"YUKAWA"T."Stuides"in"Asian"Nervilia"（Orchidaceae）"V："Nervilia"futago，"a"cryptic"new"species"from"southwest"Japan"confirmed"by"morphological，"cytological，"and"molecular"analyses[J]."Systematic"Botany，"2015，"40（2）："413-425.

[22]"章楊婷，"張燕萍，"黃靜妍，"王文君，"童妍，"趙凱，"周育真."一心維納斯蝴蝶蘭花香物質(zhì)合成相關(guān)基因RT-qPCR內(nèi)參基因篩選[J]."熱帶作物學(xué)報(bào)，"2023，"44（11）："2188-2195.ZHANG"Y"T，"ZHANG"Y"P，"HUANG"J"Y，"WANG"W"J，"TONG"Y，"ZHAO"K，"ZHOU"Y"Z."Selection"of"suitable"RT-qPCR"reference"genes"for"floral"scent"biosynthesis"in"Phalaenopsis"I-Hsin"Venus[J]."Chinese"Journal"of"Tropical"Crops，"2023，"44（11）："2188-2195."（in"Chinese）

[23]"曹映輝，"鄭燕，"張燕萍，"胡美娟，"童妍，"朱尾銀，"徐建球，"趙凱，"彭東輝，"周育真."建蘭花香物質(zhì)合成相關(guān)基因"RT-qPCR內(nèi)參基因篩選[J]."分子植物育種，"2023，"21（10）："3282-3289."CAO"Y"H，"ZHENG"Y，"ZHANG"Y"P，"HU"M"J，"TONG"Y，"ZHU"W"Y，"XU"J"Q，"ZHAO"K，"PENG"D"H，"ZHOU"Y"Z."Selection"of"suitable"RT-qPCR"reference"genes"for"floral"scent"biosynthesis"in"Cymbidium"ensifolium[J]."Molecular"Plant"Breeding，"2023，"21（10）："3282-3289."（in"Chinese）

[24]"SILVER"N，"BEST"S，"JIANG"J，"THEIN"S"L."Selection"of"housekeeping"genes"for"gene"expression"studies"in"human"reticulocytes"using"real-time"PCR[J]."BMC"Molecular"Biology，"2006，"7："1-9.