摘""要：香草蘭是重要的天然香料經(jīng)濟(jì)作物，由尖孢鐮刀菌引起的土傳病害嚴(yán)重限制了其可持續(xù)發(fā)展，而作物輪作是防控土傳病害的有效途徑。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)合高通量測(cè)序方法，在溫室盆栽條件下，研究輪作胡椒/斑蘭葉/糯米香茶對(duì)香草蘭病原菌及根際土壤微生物群落的影響。結(jié)果表明：與撂荒和連作香草蘭處理相比，輪作斑蘭葉和糯米香茶顯著降低了土壤中尖孢鐮刀菌（Fusarium"oxysporum）的數(shù)量，并顯著提高了根際土壤細(xì)菌群落的豐富度和多樣性。撂荒、連作和輪作顯著誘導(dǎo)形成3種不同的群落結(jié)構(gòu)，但輪作斑蘭葉和糯米香茶結(jié)構(gòu)相似。輪作后門水平上顯著增加了優(yōu)勢(shì)細(xì)菌酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）及Rokubacteria門，以及優(yōu)勢(shì)真菌子囊菌門（Ascomycota）的相對(duì)豐度，且屬水平上增加了優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類諾卡氏屬（Nocardioides）的相對(duì)豐度，即輪作胡椒后該屬的相對(duì)豐度為64.26%，輪作斑蘭葉后相對(duì)豐度達(dá)到98.54%，輪作糯米香茶后則為63.07%。隨機(jī)森林結(jié)果表明，輪作斑蘭葉能特異激發(fā)Terriglobus屬、克雷伯桿菌屬（Kribbella）、粘球菌屬（Myxococcus）細(xì)菌核心類群，以及枝頂孢霉屬（Acremonium）、帚枝霉屬（Sarocladium）真菌核心類群，且輪作斑蘭葉后真菌群落物種間網(wǎng)絡(luò)互作更緊密。輪作后顯著提高土壤pH，而土壤pH、細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)是顯著抑制病原菌的最重要指示因子。綜合表明，在長(zhǎng)期連作的香草蘭土壤中輪作短期且經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的香料作物斑蘭葉，對(duì)緩解香草蘭土傳病害的發(fā)生效果較好。

關(guān)鍵詞：輪作；香草蘭；斑蘭葉；根際微生物；微生物群落中圖分類號(hào)：Q939.96；S573.9""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Crop"Rotation"Effects"on"Pathogen"Dynamics"and"Rhizosphere"Microbial"Assemblages"of"Vanilla

XING"Yizhang1，"HONG"Shan2，3，4*，"YANG"Jinming5，"ZHAO"Qingyun1，"SU"Fan1，"ZHUANG"Huifa1，"WANG"Hui1

1."Spice"and"Beverage"of"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"Key"Laboratory"of"Genetic"Resources"Utilization"of"Spice"and"Beverage"Crops，"Ministry"of"Agriculture"and"Rural"Affairs"/"Hainan"Provincial"Key"Laboratory"of"Genetic"Improvement"and"Quality"Regulation"for"Tropical"Spice"and"Beverage"Crops，"Wanning，"Hainan"571533，"China;"2."Institute"of"Genetics"and"Developmental"Biology，"Chinese"Academy"of"Sciences"/"State"Key"Laboratory"of"Plant"Genomics，"Beijing"100101，"China;"3."Hainan"Seed"Industry"Laboratory，"Sanya，"Hainan"572025，"China;"4."Sanya"Institute，"Hainan"Academy"of"Agricultural"Sciences"/"Institute"of"Vegetables，"Hainan"Academy"of"Agricultural"Sciences，"Sanya，"Hainan"572025，"China;"5."School"of"Tropical"Agriculture"and"Forestry，"Hainan"University，"Haikou，"Hainan"570228，"China

Abstract："Vanilla，"a"vital"spice"crop，"faces"significant"challenges"from"soil-borne"diseases"caused"by"Fusarium"oxysporum，"affecting"its"sustainable"cultivation."This"study"utilized"quantitative"polymerase"chain"reaction"（qPCR）"and"high-throughput"sequencing"to"assess"the"impact"of"rotating"black"pepper，"pandan，"and"sweet"rice"tea"on"pathogen"levels"and"the"rhizosphere"soil"microbial"communities"of"vanilla"plants"cultivated"in"a"pot"environment."Incorporating"pandan"and"sweet"rice"tea"into"the"crop"rotation"significantly"reduced"the"prevalence"of"F."oxysporum"and"enhanced"both"the"abundance"and"diversity"of"the"rhizosphere"soil"bacteria."Three"distinct"microbial"community"structures"associated"with"fallow，"monoculture，"and"crop"rotation"conditions"were"identified."Notably，"the"rotations"involving"pandan"and"sweet"rice"tea"showed"no"significant"differences"in"the"bacterial"and"fungal"community"compositions."Crop"rotation"notably"increased"the"relative"abundance"of"key"phyla"such"as"Acidobacteria，"Chloroflexi，"Rokubacteria"and"Ascomycota."Moreover，"the"relative"abundance"of"the"dominant"bacterial"genus"Nocardioides"increased"at"the"genus"level，"with"a"relative"abundance"of"64.26%"after"pepper"rotation，"98.54%"after"pandan"rotation，"and"63.07%"after"sweet"rice"tea"rotation."The"core"microbiome，"featuring"species"such"as"Terriglobus，"Kribbella，"Myxococcus，"Acremonium"and"Sarocladium，"showed"a"particularly"strong"response"to"the"presence"of"pandan，"suggesting"a"closer"network"interaction"among"fungal"species"post-rotation."Additionally，"crop"rotation"was"found"to"significantly"raise"the"soil"pH，"which，"along"with"the"altered"bacterial"and"fungal"community"structures，"emerged"as"critical"factors"in"disease"suppression."Collectively，"our"results"suggest"that"integrating"the"economically"valuable"spice"crop"pandan"into"the"rotation"schedule"in"vanilla"monoculture"systems"can"significantly"reduce"the"incidence"of"soil-borne"diseases，"offering"a"sustainable"cultivation"strategy"for"vanilla.

Keywords："crop"rotation;"vanilla;"pandan;"rhizosphere"microorganisms;"microbial"community

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.01.020

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香草蘭（Vanilla"planifolia），隸屬于蘭科香草蘭屬，是一種多年生的熱帶藤本攀緣植物。以其獨(dú)特的香氣和風(fēng)味被譽(yù)為“天然食品香料之王”[1]，享有極高的聲譽(yù)。但因其易受土傳病原真菌尖孢鐮刀菌（Fusarium"oxysporum"f."sp."vanilla）侵染而引發(fā)嚴(yán)重的連作障礙，造成產(chǎn)量下降和品質(zhì)降低。前期研究表明，長(zhǎng)期連作后加劇香草蘭枯萎病的發(fā)生可歸因于土壤微生物群落組成和結(jié)構(gòu)的改變，即有益微生物的減少和真菌病原菌的積累[2]。

土壤微生物群落是增強(qiáng)作物抗病和抗逆能力的關(guān)鍵因素[3]。土壤微生物群落的多樣性與作物的健康狀況緊密相關(guān)[4]。研究指出，土壤中功能微生物的多樣性可以提高作物對(duì)病害的抵抗力，并通過(guò)促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)吸收和產(chǎn)生抗菌化合物來(lái)增強(qiáng)作物的抗逆性[5]。土壤微生物尤其是真菌，對(duì)土壤結(jié)構(gòu)的形成和維持起著重要作用[6]。它們通過(guò)分泌膠結(jié)物質(zhì)促使形成土壤微團(tuán)聚體，進(jìn)而影響土壤的水分保持能力和通氣性，從而促進(jìn)作物健康生長(zhǎng)[7]。此外，農(nóng)業(yè)管理措施包括耕作方式和作物輪作，對(duì)土壤微生物群落的組成和功能有顯著的正向調(diào)控作用[8-9]。

作物輪作通過(guò)調(diào)控土壤微生物群落的豐富度和多樣性以保障土壤和作物健康，是環(huán)境友好且經(jīng)濟(jì)可行的防控土傳病害的綠色措施[10]?；诖?，團(tuán)隊(duì)前期開(kāi)發(fā)了胡椒（Piper"nigrum"L.）-香草蘭和咖啡（Coffea"L.）-香草蘭輪作模式，發(fā)現(xiàn)輪作胡椒能顯著增加真菌木霉屬（Trichoderma）和青霉屬（Penicillium）的有益類群。通過(guò)重塑真菌群落結(jié)構(gòu)和組成，從而實(shí)現(xiàn)高效抗病[11]。但胡椒也是多年生香料作物，如何在有限的耕地上結(jié)合時(shí)下農(nóng)業(yè)生產(chǎn)短平快的經(jīng)濟(jì)種植效益需求，開(kāi)發(fā)出更多既能緩解香草蘭連作障礙又能收獲經(jīng)濟(jì)效益高的輪作作物，對(duì)香草蘭產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的作用。

根際核心微生物是一類關(guān)鍵的指示性物種，它們通過(guò)與植物的互動(dòng)或在微生物之間的相互作用，對(duì)微生物群落的結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)控[12]。團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，在香草蘭長(zhǎng)期連作系統(tǒng)中，與抑制香草蘭枯萎病較相關(guān)的是真菌群落的變化，且是以抑病核心微生物被孢霉菌屬（Mortierella）為主[13]。此外，研究團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)了土壤理化性質(zhì)，尤其是pH的變化對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)和根際核心微生物的豐度有顯著影響[14]。鑒于此，將土壤理化特性與微生物群落分析相結(jié)合，對(duì)于深入理解輪作對(duì)香草蘭土傳枯萎病的抑制機(jī)制至關(guān)重要[15]。

以往有關(guān)輪作提高香草蘭抗病機(jī)制的研究大多聚焦于多年生香料作物，且側(cè)重從土壤真菌微生物群落角度解析香草蘭抑病機(jī)制，而缺乏解析土壤細(xì)菌微生物群落及將土壤微生物和土壤理化因子聯(lián)合深度挖掘其相關(guān)機(jī)制的研究。據(jù)此，本研究在團(tuán)隊(duì)前期開(kāi)發(fā)胡椒的基礎(chǔ)上，結(jié)合新形勢(shì)下香草蘭的產(chǎn)業(yè)需求，篩選出熱帶地區(qū)極具特色，生產(chǎn)上種植周期短、經(jīng)濟(jì)效益價(jià)值高的香料作物——斑蘭葉（Pandanus"amaryllifolius）和糯米香茶（Strobilanthes"tonkinensis"Lindau）構(gòu)建胡椒-香草蘭/斑蘭葉-香草蘭/糯米香茶-香草蘭輪作新模式。通過(guò)熒光定量PCR和高通量測(cè)序的方法，評(píng)估這3種輪作模式對(duì)香草蘭病原菌及根際土壤微生物群落的影響，以期為香草蘭土傳病害的防控提供新視角和理論依據(jù)。"""

1""材料與方法

1.1""材料

供試連作香草蘭品種為墨西哥香草蘭（Vanilla"planifolia"Andrews）；輪作作物選取熱帶地區(qū)特色的香料作物——胡椒/斑蘭葉/糯米香茶，均由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所提供。

1.2""方法

1.2.1""試驗(yàn)設(shè)計(jì)""盆栽試驗(yàn)于2022年4月至2023年4月在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所溫室大棚中開(kāi)展。采集香草蘭枯萎病發(fā)病嚴(yán)重且連續(xù)種植10"a以上的香草蘭土壤。以連種香草蘭（X）為連作對(duì)照，同時(shí)設(shè)置撂荒負(fù)對(duì)照（CK），以種植胡椒（H）、斑蘭葉（B）及糯米香茶（C）為輪作模式作物。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)處理設(shè)立3次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)種植6盆，每盆1株。每盆填充15"kg土壤，花盆規(guī)格為32"cm×"25"cm，確保每盆植物之間有足夠的空間，并且相互獨(dú)立，避免潛在的交叉影響。

每個(gè)花盆施加90"g普通有機(jī)肥料，肥料一次性與采集土壤混合，確保肥料在每盆土壤中分布均勻。斑蘭葉作物遵循農(nóng)業(yè)生產(chǎn)操作，于盆栽4個(gè)月時(shí)進(jìn)行1次收割，采收后繼續(xù)留苗種植。化學(xué)肥料施用方案則參照傳統(tǒng)農(nóng)事操作，于盆栽12個(gè)月后采集根際土壤樣品。

1.2.2""根際土壤樣品采集""每個(gè)處理隨機(jī)選取9盆（9個(gè)重復(fù)），將香草蘭/胡椒/斑蘭葉/糯米香茶植株從土壤中輕輕拔出，保存至4"℃冰盒中迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，輕抖植物根系，抖落下的與植物根系緊密結(jié)合的土壤視為根際土壤[16]。

1.2.3""土壤樣品的理化性質(zhì)測(cè)定""土壤理化性質(zhì)測(cè)定參照《土壤農(nóng)化分析》[17]中的相關(guān)方法。使用玻璃電極酸度計(jì)測(cè)定土壤懸濁液pH；采用重鉻酸鉀氧化結(jié)合外加熱方法測(cè)定土壤有機(jī)質(zhì)含量；利用堿解擴(kuò)散法測(cè)定土壤堿解氮含量；采用鉬銻抗比色法分析土壤速效磷含量；利用火焰光度計(jì)測(cè)定土壤速效鉀含量。

1.2.4""樣品總DNA的提取""準(zhǔn)確稱取0.4"g各處理的根際土壤。使用強(qiáng)力土壤DNA提取試劑盒（MoBio"Laboratories，"Carlsbad，"CA，"USA）提取DNA。參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行試驗(yàn)操作。提取后將所得DNA樣本存放于-70"℃冰箱中，備用。

1.2.5""香草蘭根際土壤病原菌總豐度測(cè)定""采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定香草蘭病原菌的總豐度。病原菌特異性擴(kuò)增引物為AFP308R和ITS1F[13]。采用含有尖孢鐮刀菌（Fusarium"oxysporum）ITS區(qū)域序列的質(zhì)粒，通過(guò)10倍稀釋法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，按照PCR模板程序?qū)?biāo)準(zhǔn)曲線和樣本進(jìn)行測(cè)定。PCR擴(kuò)增體系：總體積20"μL，包含10"μL"SYBR?"Premix"Ex"Taq?"（2倍濃度，TaKaRa"Bio"Inc.，"Japan），每種引物0.4"μL（濃度達(dá)到10"μmol/L），0.4"μL"ROX"Reference"Dye"Ⅱ（50倍濃度），2"μL"DNA模板，6.8"μL無(wú)菌水。通過(guò)分析溶解曲線和擴(kuò)增效率來(lái)評(píng)估PCR的擴(kuò)增效果。每個(gè)樣本進(jìn)行3次獨(dú)立測(cè)定，所得數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，以每克干土對(duì)數(shù)拷貝數(shù)呈現(xiàn)結(jié)果。

1.2.6""香草蘭根際土壤樣品擴(kuò)增子建庫(kù)測(cè)序""土壤細(xì)菌的16S"rRNA基因V4區(qū)域的擴(kuò)增采用特異性引物520F和802R[18]。對(duì)于土壤真菌，擴(kuò)增ITS區(qū)域的ITS1片段，使用的引物為ITS5F和ITS1R[19]。擴(kuò)增過(guò)程中樣本會(huì)加上Barcodes/Linkers和Adapters以備測(cè)序。PCR擴(kuò)增體系：25"μL"總混合體系，5倍反應(yīng)緩沖液5"μL，5倍GC緩沖液5"μL，10"μmol/L的引物1"μL，模板DNA"2"μL，100"mmol/L"dNTP"5"μL，以及無(wú)酶水8.75"μL。PCR擴(kuò)增參數(shù)設(shè)置：98"℃預(yù)變性，持續(xù)2"min；98"℃變性，持續(xù)15"s；細(xì)菌擴(kuò)增的退火溫度為55"℃，持續(xù)30"s；真菌擴(kuò)增的退火溫度為50"℃，同樣持續(xù)30"s；72"℃延伸，30"s；28～30個(gè)循環(huán)。

PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物通過(guò)QIAquick"PCR"Purification"Kit（德國(guó)QIAGEN公司）進(jìn)行純化處理。純化后的DNA樣本利用Qubit?2.0"Fluorometer（美國(guó)Invitrogen公司）測(cè)定其濃度。隨后，采用NEB"Next?"UltraTM"DNA"Library"Prep"Kit"for"Illumina（英國(guó)New"England"Biolabs公司）對(duì)等濃度混合的測(cè)序樣本構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。

構(gòu)建的文庫(kù)質(zhì)量通過(guò)Agilent"2100"Bioanalyzer"Instruments（美國(guó)Agilent"Technologies"Co."Ltd）和KAPA"Library"Quantification"Kits（美國(guó)Kapa"Biosystems公司）進(jìn)行檢測(cè)和驗(yàn)證。從文庫(kù)構(gòu)建到測(cè)序均由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。

1.2.7""香草蘭根際土壤樣品數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析""原始測(cè)序數(shù)據(jù)首先通過(guò)Trimmomatic軟件[20]（v0.33）進(jìn)行質(zhì)量篩選，去除低質(zhì)量的序列；利用Cutadapt[21]（v1.9.1）識(shí)別并剪除引物序列；利用USEARCH[22]（v10）對(duì)成對(duì)的序列進(jìn)行合并，并使用UCHIME[23]（v8.1）去除嵌合體，獲得純凈的高質(zhì)量序列。

使用QIIME2[24]（v2020.6）中的DADA2[25]算法對(duì)經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制的數(shù)據(jù)進(jìn)行去噪處理。以測(cè)序所得序列總數(shù)的0.005%作為閾值，用于篩選和過(guò)濾掉異常序列變體。使用RDP"classifier工具對(duì)擴(kuò)增的序列變體（ASV）進(jìn)行序列比對(duì)分析，細(xì)菌的序列與RDP"Bacterial"16S"rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)[26]進(jìn)行匹配，真菌的序列與UNITE"Fungal"ITS數(shù)據(jù)庫(kù)[27]進(jìn)行比對(duì)，確保準(zhǔn)確識(shí)別其分類。"

在完成測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制后，共鑒定出327"794個(gè)細(xì)菌的序列變體（ASVs）和12"633個(gè)真菌的ASVs。Chao1和ACE指數(shù)用于評(píng)估微生物群落的物種豐富度，而Shannon和Invsimpson指數(shù)則用于衡量群落的多樣性。采用基于Bray-Curtis距離矩陣的主坐標(biāo)分析（PCoA）和層次聚類分析測(cè)定微生物群落的Beta多樣性，并通過(guò)多元置換方差分析（PERMANOVA）來(lái)檢驗(yàn)不同群落間的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每個(gè)ASV的相對(duì)豐度以其在樣本中序列數(shù)占總序列數(shù)的百分比來(lái)表示。

利用randomForest包分析輪作作物間差異特異富集的核心微生物。網(wǎng)絡(luò)分析部分使用ggCluster Net包制圖，篩選出相關(guān)系數(shù)（r）gt;0.8且Plt;0.05

的數(shù)據(jù)點(diǎn)構(gòu)建微生物間的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖。以上分析均在R軟件中完成。

1.3""數(shù)據(jù)處理

采用Duncan’s新復(fù)極差法統(tǒng)計(jì)分析不同處理間的病原菌豐度、微生物多樣性指數(shù)、微生物門和屬水平的組成，以及土壤理化因子之間的差異顯著性；利用R語(yǔ)言中的vegan包進(jìn)行線性擬合，探究病原菌與微生物多樣性、群落結(jié)構(gòu)及組成之間的關(guān)系；采用一般線性模型（逐步回歸分析）的方法評(píng)估細(xì)菌和真菌群落及其多樣性和核心物種在抑制病原菌方面的潛力。

2""結(jié)果與分析

2.1""輪作對(duì)香草蘭枯萎病病原菌數(shù)量的影響

ITS測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與撂荒（CK）和香草蘭連作（X）處理相比，輪作胡椒（H）、斑蘭葉（B）和糯米香茶（C）后根際土壤中的鐮刀菌屬（Fusarium）相對(duì)豐度均無(wú)顯著差異，但輪作斑蘭葉后呈降低趨勢(shì)，且輪作斑蘭葉顯著低于輪作糯米香茶處理（Plt;0.05，圖1A）。qPCR熒光定量結(jié)果則表明，與撂荒和香草蘭連作處理相比，輪作斑蘭葉和糯米香茶后則能顯著降低土壤中病原菌尖孢鐮刀菌（F."oxysporum）的拷貝數(shù)（Plt;0.05，圖1B）。以上結(jié)果表明，輪作斑蘭葉能有效降低土壤中病原菌的數(shù)量。

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2.2""輪作對(duì)根際土壤細(xì)菌和真菌群落多樣性的影響

由表1可知，與香草蘭連作處理相比，輪作斑蘭葉和糯米香茶均能顯著提高土壤細(xì)菌群落的豐富度和多樣性（Plt;0.05），但二者之間無(wú)顯著差異；輪作胡椒能顯著提高土壤細(xì)菌群落的豐富度。對(duì)真菌群落而言，與撂荒和香草蘭連作處理相比，輪作斑蘭葉能顯著降低根際土壤微生物細(xì)菌群落的豐富度和多樣性（Plt;0.05）；而與香草蘭連作處理相比，輪作胡椒顯著降低土壤真菌群落的豐富度。

2.3""輪作對(duì)根際土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)和組成的影響

土壤細(xì)菌方面，通過(guò)PCoA分析發(fā)現(xiàn)，根際土壤細(xì)菌群落變異形成了撂荒、香草蘭連作及輪

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作（胡椒/斑蘭葉/糯米香茶）3種不同典型栽培模式的結(jié)構(gòu)（圖2A）。而基于置換多元方差分析（PERMANOVA）表明，撂荒、連作和輪作分組間的群落結(jié)構(gòu)呈顯著差異（R2=0.34，"Plt;0.01）。進(jìn)一步層次聚類分析也表明，撂荒處理和連作香草蘭處理樣本間重復(fù)性良好，均能獨(dú)立聚為一簇，胡椒輪作也能聚為一簇，但輪作斑蘭葉和輪作糯米香茶群落結(jié)構(gòu)極為相似，無(wú)明顯分區(qū)（圖2B）。細(xì)菌高通量測(cè)序結(jié)果表明，與連作香草蘭相比，輪作在優(yōu)勢(shì)門水平上顯著增加酸酐菌門（Acidoba cteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）及Rokubacteria門類群的相對(duì)豐度（Plt;0.05，圖3A）。屬水平分析則發(fā)現(xiàn)，與連作香草蘭相比，輪作胡椒/斑蘭葉/糯米香茶處理則不同程度上顯著增加類諾卡氏屬（No cardioides）微生物，其增幅分別達(dá)到64.26%、98.54%和63.07%（圖2B）。

土壤真菌方面，通過(guò)PCoA分析表明，根際真菌土壤微生物群落也形成了撂荒、香草蘭連作及輪作（胡椒/斑蘭葉/糯米香茶）3種不同的結(jié)構(gòu)（圖2C）。且經(jīng)過(guò)置換多元方差檢驗(yàn)也證實(shí)3種不同的群落結(jié)構(gòu)呈顯著差異（R2=0.32，"Plt;0.01）。層次聚類結(jié)果表明，撂荒處理和香草蘭連作處理單獨(dú)聚為一類，輪作胡椒/斑蘭葉/糯米香茶的群落結(jié)構(gòu)相似，錯(cuò)綜交叉聚集，無(wú)明顯區(qū)分（圖2D）。基于ITS高通量測(cè)序則發(fā)現(xiàn)，與連作香草蘭相比，輪作在優(yōu)勢(shì)門水平上顯著增加子囊菌門（Ascomycota）類群的相對(duì)豐度（Plt;0.05，圖3B）。屬水平分析則發(fā)現(xiàn)，與連作香草蘭相比，輪作處理能特異顯著增加Ascobolus屬微生物的相對(duì)豐度，輪作胡椒、斑蘭葉和糯米香茶處理的Ascobolus屬相對(duì)豐度分別為4.69%、4.85%、1.75%，而連作香草蘭處理的相對(duì)豐度僅為0.01%（圖2D）。

2.4""微生物群落多樣性、結(jié)構(gòu)及組成與香草蘭枯萎病病原菌的線性關(guān)系

線性回歸分析結(jié)果表明，土壤細(xì)菌微生物群落豐富度（Chao指數(shù)）、多樣性（Shannon指數(shù)）及群落結(jié)構(gòu)（PCoA1）均與香草蘭枯萎病病原菌F."oxysporum拷貝數(shù)存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（Plt;"0.05，圖4A～圖4C）；而土壤細(xì)菌中僅有門水平上的放線菌門（Actinobacteria）和綠彎菌門（Chloroflex）類群的相對(duì)豐度與病原菌F."oxysporum拷貝數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.05，圖4D～圖4K）；土壤真菌方面，真菌群落結(jié)構(gòu)（PCoA1）、群落豐富度（Chao指數(shù)）及真菌組成子囊菌門（Ascomycota）類群相對(duì)豐度均與病原菌F."oxysporum拷貝數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.05，圖4L～圖4O）。

2.5""輪作對(duì)根際土壤核心微生物特異富集的影響

為了識(shí)別撂荒、連作和輪作樣本間的差異關(guān)鍵核心物種，采用隨機(jī)森林分析并根據(jù)物種的貢獻(xiàn)度權(quán)重高低進(jìn)行排序，排名前10的ASV物種如圖5所示。在細(xì)菌中，與連作香草蘭處理相比，輪作斑蘭葉和糯米香茶能特異富集ASV122517、ASV8386及ASV275757物種（Plt;0.05），且均與病原菌F."oxysporum呈顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.05，圖5A～圖5B）。而在真菌中，與連作香草蘭相比，輪作斑蘭葉能特異顯著富集ASV5998及ASV7292物種（Plt;0.05），且與病原菌F."oxysporum呈顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.05）；而輪作糯米香茶后則能顯著富集ASV5434（Plt;"0.05），與病原菌F."oxysporum同樣呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（Plt;0.05，圖5C～圖5D）。

2.6""輪作不同香料作物后根際土壤微生物網(wǎng)絡(luò)比較

撂荒、連作及輪作處理的根際細(xì)菌和真菌相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)具有明顯差異（圖6）。每個(gè)圓點(diǎn)代表1個(gè)ASV物種，并被注釋到門水平；橘黃色代表物種間呈正相關(guān)，藍(lán)色代表物種間呈負(fù)相關(guān)。每個(gè)處理的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)湫再|(zhì)如表2所示。結(jié)果表明，在細(xì)菌中，與連作香草蘭負(fù)相關(guān)連接數(shù)（43.55%）相比，輪作胡椒處理節(jié)點(diǎn)的負(fù)相關(guān)連接為38.89%，而輪作斑蘭葉和糯米香茶的則分別為45.45%和50.00%。連作與輪作之間的節(jié)點(diǎn)平均度差異不顯著，但輪作斑蘭葉和糯米香茶處理的平均聚類系數(shù)高于連作處理，特別是輪作斑蘭葉后平均聚類系數(shù)達(dá)0.50，而連作香草蘭的僅為0.19（圖6A）。

在真菌中（表2），與連作香草蘭相比，輪作胡椒/斑蘭葉/糯米香茶均不同程度地減少了節(jié)點(diǎn)負(fù)相關(guān)的連接數(shù)，增加了平均度和平均聚類系數(shù)。與連作香草蘭負(fù)相關(guān)連接數(shù)（9.89%）相比，輪作胡椒處理的負(fù)相關(guān)連接數(shù)為2.68%，輪作斑蘭葉的僅為1.23%，而輪作糯米香茶的為3.47%，表明輪作后根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。與連作香草蘭節(jié)點(diǎn)平均度相比，輪作胡椒/斑蘭葉/糯米香茶的節(jié)點(diǎn)平均度均不同程度的增加，特別是輪作斑蘭葉后的真菌網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)平均度達(dá)到5.74，增加了2倍，菌群連接更緊密。此外，真菌類群在微生物網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)平均度普遍高于細(xì)菌類群，特別是子囊菌門（Ascomycota）類群（圖6B），表明子囊菌門在微生物互作中具有更重要的生態(tài)位。

綜合分析表明，在長(zhǎng)期連作的香草蘭土壤上輪作胡椒/斑蘭葉/糯米香茶均會(huì)不同程度地增加細(xì)菌和真菌群落物種間互惠共生的正向作用，且輪作斑蘭葉效果更好。"

2.7""抑制香草蘭病原菌數(shù)量降低的土壤理化因子和微生物指示因子預(yù)測(cè)

通過(guò)測(cè)定輪作不同香料作物后的土壤理化性質(zhì)，結(jié)果表明，與連作香草蘭處理相比，輪作胡椒/斑蘭葉/糯米香茶均能顯著提高土壤pH，以及土壤有機(jī)質(zhì)、堿解氮、速效磷和速效鉀的含量（Plt;0.05），但輪作斑蘭葉和糯米香茶后的pH和速效鉀含量無(wú)顯著差異（表3）。

將有效的土壤理化因子與尖孢鐮刀菌構(gòu)建一般線性模型，用于評(píng)估土壤理化因子抑制病原菌增殖的可能性大小及預(yù)測(cè)其相對(duì)重要性。結(jié)果表明，5個(gè)土壤理化因子解釋了總模型變量的87.33%，其中，pH是影響病原菌濃度的一個(gè)顯著且關(guān)鍵的微生物生態(tài)指標(biāo)（Plt;0.05），它對(duì)模型總變量的解釋度達(dá)到26.72%（表4）。

將對(duì)病原菌具有顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系的微生物指"

示因子與病原菌再次構(gòu)建線性模型，用于預(yù)測(cè)微生物因子抑制病原菌濃度的相對(duì)重要性。結(jié)果表明，細(xì)菌群落、真菌群落及子囊菌門（Ascomycota）類群相對(duì)豐度是抑制病原菌的顯著指示因子（Plt;0.05），分別解釋了17.01%、8.05%和11.22%的模型總變量（表4）。

3""討論

連作障礙是指在同一片土地上連續(xù)種植相同作物，導(dǎo)致土壤養(yǎng)分失衡、病原菌累積和微生物群落失衡，進(jìn)而限制作物生長(zhǎng)，降低產(chǎn)量和品質(zhì)的現(xiàn)象。香草蘭是一種熱帶多年生藤本植物，尤其容易受到連作障礙的影響。本團(tuán)隊(duì)前期研究表明，通過(guò)輪作種植多年生作物胡椒可以有效改善土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及其組成，增強(qiáng)香草蘭的抗病性[11]。進(jìn)一步篩選出熱帶特色、種植周期短且經(jīng)濟(jì)效益高的香料作物斑蘭葉和糯米香茶進(jìn)行輪作盆栽試驗(yàn)，結(jié)果顯示，輪作斑蘭葉能顯著降低土壤中鐮刀菌屬的相對(duì)豐度，特別是減少了尖孢鐮刀菌的數(shù)量。這一發(fā)現(xiàn)與先前的輪作研究相符，證實(shí)了輪作可以有效控制病原菌的增長(zhǎng)[11]。此外，類似的通過(guò)輪作減少作物土傳病害的研究亦廣泛開(kāi)展。如辣椒-香蕉輪作[12]、茄子-香蕉輪作[28]和菠蘿-香蕉輪作[29]模式均能有效降低根際土壤中尖孢鐮刀菌的數(shù)量，增強(qiáng)香蕉的抗病性。輪作改變了植物宿主，打斷了病原菌的營(yíng)養(yǎng)循環(huán)[3]，這可能是提升香草蘭抗病能力的關(guān)鍵因素。

土壤微生物的多樣性和豐富度在植物應(yīng)對(duì)環(huán)境壓力時(shí)發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它們協(xié)助植物抵御外來(lái)侵害并促進(jìn)植物恢復(fù)[3]。本研究發(fā)現(xiàn)，輪作周期短且經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的斑蘭葉和糯米香茶顯著提高了土壤細(xì)菌群落的豐富度和多樣性，而降低了土壤真菌群落的豐富度和多樣性。前期研究也發(fā)現(xiàn)，輪作多年生胡椒和咖啡能提高土壤真菌群落的豐富度和多樣性[11]。表明不同作物的輪作模式對(duì)細(xì)菌和真菌群落的豐富度和多樣性的影響有差異。特定的輪作作物通過(guò)激發(fā)特定的有益微生物類群的繁殖和生長(zhǎng)，進(jìn)而影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。而這些微生物與病原菌爭(zhēng)奪植物根部的生態(tài)位資源，限制了病原菌的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，從而能有效控制其增長(zhǎng)[30]。

已有研究表明，長(zhǎng)期作物輪作后微生物群落結(jié)構(gòu)和組成與連作栽培模式間有顯著差異[10]。本研究中，無(wú)論細(xì)菌還是真菌群落結(jié)構(gòu)，撂荒、連作和輪作均能顯著區(qū)分，形成3種完全不同的群落結(jié)構(gòu)，但輪作胡椒/斑蘭葉/糯米香茶之間的群落結(jié)構(gòu)很相似，無(wú)法區(qū)分。這一發(fā)現(xiàn)與前期的輪作研究結(jié)果[11]一致。推測(cè)可能是輪作的時(shí)長(zhǎng)不夠，還不足以富集到更多特異的微生物。由于輪作效應(yīng)，微生物群落的變化將影響特定微生物的響應(yīng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，輪作能顯著富集細(xì)菌門水平上的酸桿菌門（Acidobacteria）和綠彎菌門（Chloroflexi）微生物，屬水平則顯著富集類諾卡氏屬（Nocar dioides）微生物，且與病原菌呈顯著負(fù)相關(guān)；而真菌則顯著富集門水平上的子囊菌門（Ascomy cota）和屬水平上的Ascobolus屬微生物。雖然目前尚無(wú)足夠的證據(jù)表明這些微生物具有直接的抗病功能。但值得注意的是，這些微生物都是土壤中的優(yōu)勢(shì)菌門，可能是通過(guò)間接影響其他微生物的定殖而發(fā)揮抗病功能[31]。

為鑒定識(shí)別出各輪作作物特異富集且對(duì)病原菌有潛在拮抗功能的核心微生物，采用專業(yè)尋找生物標(biāo)志物的隨機(jī)森林分析，研究發(fā)現(xiàn)，輪作斑蘭葉后能特異富集Terriglobus屬、克雷伯桿菌屬（Kribbella）和粘球菌屬（Myxococcus）核心細(xì)菌類群，以及枝頂孢霉屬（Acremonium）和帚枝霉屬（Sarocladium）真菌核心類群，且均與病原菌呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。值得注意的是，前期的胡椒輪作能顯著富集有益的拮抗真菌類群木霉屬（Trichoderma）和青霉屬（Penicillium），表明不同的輪作作物根系代謝物有差異，富集的特定有益微生物類群也有差異[32]。已有研究表明，克雷伯桿菌屬和粘球菌屬的微生物在土壤中廣泛分布，而枝頂孢霉屬及帚枝霉屬均屬于叢梗孢科（Hypomycetes）真菌微生物，均能產(chǎn)生多樣的次級(jí)代謝產(chǎn)物，而這些產(chǎn)物具有抗菌、抗生素和其他活性物質(zhì)，是生物防治方面重要的微生物資源[33-35]。因此推測(cè)：這些具備生物防治特性的微生物種群豐度的變化可能影響了輪作過(guò)程中的病原菌數(shù)量，進(jìn)而增強(qiáng)了香草蘭對(duì)病害的抵抗力。

基于數(shù)學(xué)算法構(gòu)建的微生物共發(fā)生關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，可用于研究微生物群落的多樣性、復(fù)雜性及穩(wěn)定性，近年來(lái)已被廣泛應(yīng)用[36-38]?；诖耍瑢?duì)撂荒、連作、輪作胡椒、輪作斑蘭葉及輪作糯米香茶5個(gè)處理的根際土壤細(xì)菌和真菌分別構(gòu)建了微生物網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)綜合考量網(wǎng)絡(luò)特征系數(shù)，如正相關(guān)連接邊數(shù)、平均度、平均聚類系數(shù)等，發(fā)現(xiàn)輪作斑蘭葉后的細(xì)菌和真菌物種間互惠共生的正相關(guān)作用更強(qiáng)，可能通過(guò)ASV物種間更緊密的互作關(guān)系提高了根際微生物多樣性[39]，從而提升了菌群協(xié)同抵抗病原菌入侵根際的能力。

前期研究得出，在高發(fā)枯萎病的香蕉園輪作辣椒后，通過(guò)提高土壤pH可重塑微生物組成，富集有益的假單胞菌屬（Pseudomonas）微生物，增強(qiáng)了香蕉的抗病性[14]。本研究也發(fā)現(xiàn)，輪作斑蘭葉和糯米香茶能顯著提升根際土壤pH，而土壤pH是限制病原菌的最顯著因子，可解釋模型變量的26.72%。進(jìn)一步利用一般線性模型分析揭示了細(xì)菌群落、真菌群落以及子囊菌門的相對(duì)豐度在抑制病原菌方面起著顯著的作用。這與TAO等[40]的研究結(jié)果相符合，即根際細(xì)菌群落的變化對(duì)于抑制香蕉土傳枯萎病至關(guān)重要。

4""結(jié)論

在土傳病害頻發(fā)的香草蘭園輪作斑蘭葉可顯著降低鐮刀菌屬的相對(duì)豐度和尖孢鐮刀菌的拷貝數(shù)，增加細(xì)菌群落的豐富度和多樣性。通過(guò)特異富集細(xì)菌Terriglobus屬、克雷伯桿菌屬（Krib bella）和粘球菌屬（Myxococcus）核心類群，以及真菌枝頂孢霉屬（Acremonium）及帚枝霉屬（Sarocladium）核心類群可重塑微生物群落組成。輪作斑蘭葉作物后可顯著提高土壤pH，土壤pH提升的同時(shí)影響了細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)，從而抑制了病原菌的定殖，推測(cè)這些變化是輪作提高香草蘭抗病能力的重要原因。

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