摘 要：文章旨在辨析雙縮脲法和福林酚法的術語概念，研究改進二者測量血清總蛋白的操作方法，探討這兩種方法檢測血清總蛋白含量在教學中的適用性，為臨床上對血清總蛋白的檢測提供改良思路。通過改進雙縮脲法和福林酚法分別對40個健康體檢人員的血清進行總蛋白含量測定，并考察標準曲線的精密度、重復性以及加樣回收率。結果發(fā)現(xiàn)：兩種方法檢測待測血清樣品中總蛋白含量與醫(yī)院檢測結果基本一致。可見，兩種方法均適用于血清總蛋白含量的測定。由于雙縮脲法檢測時間短、操作簡單，比福林酚法更適用于實驗教學，值得進一步推廣。

關鍵詞：雙縮脲法；福林酚法；血清總蛋白測定

中圖分類號：H083；R4" DOI：10.12339/j.issn.1673-8578.2025.01.021

Application Evaluation of Improved Biuret Method and Folin-Phenol Reagent Method for Determination of Serum Total Protein Content//ZHANG Qian， LIN Yanyan， CAI Binxiang

Abstract：Objective： The purpose of this paper is to differentiate and analyze the term concepts of biuret method and Folin-Phenol method， improve the operation method of measuring serum total protein by the two methods， and to discuss the applicability of these two methods to detect serum total protein content in teaching， and to provide improved ideas for clinical detection of serum total protein. Methods： The improved biuret method and Folin-Phenol method were used to determine the total protein content in the serum of 40 healthy people， and the precision， repeatability and the sample recovery rate of the standard curve were investigated. Results： The total protein content in the serum samples detected by the two methods was basically consistent with the hospital test results. Conclusion： Both methods are suitable for the determination of serum total protein content. Due to the short detection time and simple operation， the biuret method is more suitable for experimental teaching than the Folin-Phenol method， which is worthy of further promotion.

Keywords： biuret method; Folin-Phenol method; determination of serum total protein

收稿日期：2024-08-30" 修回日期：2024-10-28

基金項目：2023年度福建省中青年教師科研項目（科技類）（JZ230086）；2023漳州市自然科學基金（ZZ2023J25）

作者簡介：章倩（1986—），漳州衛(wèi)生職業(yè)學院主管護師，研究方向為海洋天然產物活性研究、生物化學與生物化學檢驗、綜合實訓管理研究，通信方式：303916828@qq.com。*通訊作者：蔡彬祥（1992—），博士，漳州衛(wèi)生職業(yè)學院講師，研究方向為生物化學與分子生物學研究。通信方式：2267217008@qq.com。

1 血清總蛋白測定方法：雙縮脲法與福林酚法

血清總蛋白（total protein，TP）是血清中所含各種蛋白質的總稱^[1]，對于維持機體滲透壓及保持水分平衡極為重要，可維持血液的酸堿度，在機體中發(fā)揮重要的生理功能。臨床上對血清總蛋白含量的測量是生化檢驗的重要項目之一，可協(xié)助肝臟功能、腎臟疾病或營養(yǎng)狀況等疾病的診斷^[2-3]，因此，掌握測定血清總蛋白的原理和方法是醫(yī)護人員必備的生化檢驗技能之一。

雙縮脲試劑是一種堿性的含銅溶液，在臨床上常用于測定血清總蛋白的含量。蛋白質是由氨基酸通過肽鍵 （—CO—NH—）相互結合而成的，其在雙縮脲試劑中能與2價銅離子作用生成穩(wěn)定的紫紅色絡合物。這種紫紅色絡合物在540nm波長處有最大光吸收值，其吸光值在一定范圍內與蛋白質含量呈正比關系， 據此可通過分光光度法測定蛋白質濃度。雙縮脲法可較準確地測定血清總蛋白，具有操作簡便快捷，既適合手工操作又適合自動化分析，重復性、線性關系好等優(yōu)點，但其靈敏度相對較低，通常用于需要快速但并不十分精確的蛋白質測定。

福林酚法測定血清總蛋白是雙縮脲法的發(fā)展。在堿性條件下，蛋白質中的肽鍵與銅結合生成紫色絡合物；該絡合物及蛋白質中的酪氨酸、色氨酸等殘基可將福林酚試劑中的磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽還原，產生磷鉬藍和磷鎢藍的藍色混合物。該混合物在560nm波長處有最大光吸收值。這個方法操作簡便、靈敏度高，檢測的最低蛋白質量可達5μg，比雙縮脲法靈敏得多。但福林酚試劑顯色反應是由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸等引起，因此樣品中若含有酚類、檸檬酸和巰基化合物，均有干擾作用；且其操作時間相對較長，需要精確控制。

在當前測定血清總蛋白的教學中，為了更好地模擬臨床上對血清總蛋白含量的測定，教學使用的待測血清樣品通常從醫(yī)院臨床樣品中獲得，來源單一且所得量較少。然而，目前常用測定血清總蛋白的方法所需待測血清樣品和相關檢測試劑的量均較多，增加了教學成本，其按部就班的操作流程降低了學生的動手能力，極大影響了學生的積極性和獨立思考的能力。且利用紫外分光光度儀檢測比色皿中溶液的吸光值存在靈敏度較差和精度不高的問題，也會降低學生的成就感。因此，本文通過改進雙縮脲法和福林酚法測定臨床樣品中血清總蛋白的含量，按比例降低待測血清樣品和檢測試劑的使用量，結合精度較高的酶標儀進行檢測，通過標準曲線的繪制、精密度、重復性、加樣回收率以及對樣品總蛋白的測定，評價它們在實驗教學中的適用性。具體方案如下。

2 實驗儀器與試劑

2.1 儀器

Thermo酶標儀；高精度微量電子天平；HVM1型漩渦振蕩器。

2.2 標本

隨機選擇2023年9月19日—2024年6月30日于漳州市醫(yī)院進行健康體檢的40例檢測者，男女各20例，年齡20～60歲，利用肝素鈉抗凝真空采血管采集患者靜脈血3mL。充分混勻后以4000rpm離心旋轉5min，及時分離血漿。所有標本均無溶血、黃疸和脂濁，其檢測結果均在線性范圍內。

2.3 試劑

牛血清白蛋白標準品溶液1mL/支，濃度為70.4mg/mL；雙縮脲試劑盒；福林酚試劑盒。NaOH、Na2CO3、酒石酸鉀及CuSO4·5H2O均為分析純；實驗用水為ddH2O（雙蒸水）。

2.4 數(shù)據處理

所得的各組數(shù)據至少重復3次，均取平均值；所有數(shù)據運用EXCEL軟件分析和繪制圖片^[4]。

3 方法與結果

3.1 雙縮脲法

3.1.1 制備標準溶液

標準溶液為牛血清白蛋白溶液，濃度為70.4mg/mL。用ddH2O精密地對牛血清白蛋白標準溶液進行梯度稀釋，將其稀釋成如下溶度：0， 4.4， 8.8， 17.6， 35.2， 52.8， 70.4 mg/mL。

3.1.2 標準曲線制作

用移液槍精密測量上述濃度標準溶液，加到96孔板中，每孔各5μL。接著，移取200μL雙縮脲試劑溶液到每孔當中，并混勻。置于黑暗環(huán)境下，37℃孵育反應10min，再放入酶標儀中，振蕩5秒后測定相應吸光值，該波長為550nm。以吸光度為縱坐標，各個濃度標準溶液為橫坐標制作標準曲線，如圖2.1所示，其回歸方程為Y=0.0038X+0.0824，R²為0.9988，表明該方法中吸光值與各個濃度標準品溶液具有良好的線性關系，可應用于測定血清總蛋白的含量，蛋白質線性濃度范圍為0～72.77mg/mL。

3.1.3 精密度

精密量取濃度為17.6， 35.2， 52.8mg/mL的牛血清白蛋白標準品溶液各5μL，分別加入到96孔板中，每個濃度各做6份平行樣。按上述進行吸光值的測定，并計算RSD（相對標準偏差）。由表1可知，3個不同濃度樣品的RSD均小于1%，說明本測定方法的精密度較好。

3.1.4 重復性實驗結果

隨機選擇一名就醫(yī)者的血清樣品，精密量取該血清樣品6份，按照上述方法測定吸光值，根據線性回歸方程計算血清總蛋白的含量，并計算RSD，檢驗該方法的重復性。由表2可知，測定含量平均值為74.5mg/mL，RSD為1.39%，說明本測定方法的重復性良好。

3.1.5 加樣回收率

隨機選取血清樣品8號作為樣品，經漳州市醫(yī)院測定，該血清總蛋白的含量為64.8 mg/mL。精密量取35mg/mL的標準品溶液與該血清樣品各30μL置于同一試管，混勻后取5μL加入96孔板中， 做6個復孔，按照上述方法進行含量測定，并計算平均回收率。由表3可知，平均回收率為106.6%，RSD為1.85%。

3.1.6 樣品測定

取40個臨床血清樣品各5μL，分別加入到96孔板中，均做3復孔；按照上述方法進行血清總蛋白含量測定。40個血清樣品含量測定結果見表4。

3.2 福林酚法

3.2.1 制備標準溶液

標準溶液為牛血清白蛋白溶液，其濃度為70.4mg/mL。用ddH2O精密地對牛血清白蛋白標準溶液進行梯度稀釋，將其稀釋成如下溶度：0，0.55，1.1，2.2，4.4，8.8，13.2，17.6mg/mL。

3.2.2 福林酚試劑制備

甲試劑：按照福林酚試劑盒提供的說明書進行配備，現(xiàn)用現(xiàn)配。

乙試劑：濃度為1mol/L，此為福林酚試劑應用液。密封于4℃冰箱中避光保存。

3.2.3 標準曲線的制作

用移液槍精密量取上述各個濃度標準品溶液各5μL，分別加入到96孔板中。接著，往每孔中加入200μL甲試劑溶液，混勻，于25℃的室溫中避光靜置10min。反應結束后，再往各孔加入20μL的乙試劑混勻，置于黑暗環(huán)境下，在25℃的室溫下反應靜置30min。最后，利用酶標儀測定相應的吸光值，該波長為500nm，以吸光值為縱坐標，各濃度標準溶液為橫坐標制作標準曲線，如圖2所示，其回歸方程為Y=0.0299X+0.0664，R²為0.9983，表明該方法中吸光值與各個濃度標準品溶液具有良好的線性關系，可應用于測定血清總蛋白的含量，蛋白質線性濃度范圍為0～17.69mg/mL。

3.2.4 精密度實驗結果

精密量取濃度為2.2， 4.4，8.8mg/mL的牛血清白蛋白標準品溶液各5μL，分別加入到96孔板中，每個濃度各做6份平行樣。按上述進行吸光值的測定，并計算RSD。由表5可知，3個不同濃度的樣品的RSD均小于1%，說明本測定方法的精密度較好。

3.2.5 重復性實驗結果

隨機選擇一名就醫(yī)者的血清樣品，將其稀釋10倍后，精密量取該血清樣品6份，按照上述方法測定吸光值，根據線性回歸方程計算血清總蛋白的含量，并計算RSD，檢驗該方法的重復性。由表6可知，測定含量平均值為74.5mg/mL，RSD為1.52%，說明本測定方法的重復性良好。

3.2.6 血清總蛋白加樣回收率

隨機選取血清樣品8號作為樣品，經漳州市醫(yī)院測定，該血清總蛋白的含量為64.8 mg/mL。精密量取8.8mg/mL的標準品溶液與經稀釋10倍的該血清樣品各30μL置于同一試管，混勻后取5μL加入96孔板中，做6個復孔，按照上述方法進行含量測定，并計算平均回收率。由表7可知，平均回收率為111.1%，RSD為1.72%。

3.2.7 樣品測定

將40個血清樣品稀釋10倍，從稀釋血清樣品中各取5μL，分別加入到96孔透明板中，各做3個復孔。按照上述方法進行血清總蛋白含量測定。40個血清樣品含量測定結果見表8。

4 討論

4.1 雙縮脲法

目前臨床及教學多采用雙縮脲法測定血清總蛋白含量^[5]，然而在教學上運用該方法所使用的檢測試劑及待測血清樣品用量都較多，且所利用的紫外分光光度儀檢測吸光值存在靈敏度較差、精度不高的問題，增加了教學難度。因此，本實驗將常規(guī)所需的雙縮脲試劑用量從1mL減少至200μL，血清樣本量從15μL減少至5μL，37℃溫浴10分鐘后置于精度高的酶標儀進行檢測，實驗結果顯示，待測血清樣品中總蛋白含量與醫(yī)院檢測結果基本一致。從檢測的精密度、重復性以及臨床結果對照的一致性可看出該改良方案可適用于血清總蛋白含量的測定。因其檢測時間短、可操作性強、教學成本低、檢測的靈敏度和精確度高，可推廣運用于對醫(yī)護學生學習蛋白質檢測的實驗教學，加強學生對該檢驗技術原理的理解，提升學生的動手操作能力，同時也可為臨床血清總蛋白含量檢測提供相應的改良思路。

4.2 福林酚法

福林酚法測定血清總蛋白是雙縮脲法的發(fā)展，是最靈敏的蛋白質測定方法之一^[6]。實驗表明改良福林酚法測定血清總蛋白的結果與醫(yī)院雙縮脲法測定的血清總蛋白含量基本一致，可應用于血清總蛋白含量的測定。但是，因其靈敏度過高，對于操作者的熟練程度要求較高，不適用于對新生的實驗教學。同時，本檢測方法耗時較多，因教學課時的限制，不適用于傳統(tǒng)生化及生化檢驗實驗教學。然而，本文通過稀釋血清樣品，減少了血清樣本用量，可大幅減少血清樣品的用量，降低檢驗成本，或許可將改良的福林酚法推廣運用于臨床檢測。

5 結語

雙縮脲法是基于雙縮脲反應來進行血清總蛋白的測定，具有操作簡便、快速且適用于多種樣品類型的特點，但其靈敏度相對較低。福林酚法測定血清總蛋白是雙縮脲法的發(fā)展，具有較高的靈敏度，能夠檢測到較低濃度的蛋白質，但是該方法需要精確控制操作時間，對操作者要求較高，且顯色反應可能受到樣品中酚類、檸檬酸和巰基化合物等的干擾，影響測定結果的準確性。

綜上所述，改進的雙縮脲法比福林酚法更適用于實驗教學，而改良的福林酚法通過稀釋血清樣品，減少了血清樣本用量，可大幅減少血清樣品的用量，降低檢驗成本，或許可將其推廣運用于臨床檢測。在實驗教學中，教師可以根據不同層次的學生結合課堂效率、學生的操作熟練度等選擇適合的檢測方法進行教學。同時，通過常規(guī)檢測方法和改進檢測方法的教學比較，不僅可以鍛煉學生的科學思維能力，也更進一步培養(yǎng)了學生進行實驗設計與數(shù)據處理的科學探究能力。

參考文獻

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