摘要目的：探討五味子甲素（DSD）對心肌缺血再灌注損傷（MIRI）大鼠的保護(hù)作用及其對核因子κB（NF-κB）/絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路的作用機(jī)制。方法：將無特定病原體（SPF）組雄性SD大鼠分為假手術(shù)組（僅穿線不結(jié)扎，生理鹽水灌胃）和造模大鼠（MIRI模型）。將造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組（生理鹽水灌胃）、陽性藥物組（復(fù)方丹參滴丸8.5 mg/kg灌胃）、DSD低劑量組（DSD 20 mg/kg灌胃）、DSD中劑量組（DSD 40 mg/kg灌胃）、DSD高劑量組（DSD 80 mg/kg灌胃），每組20只。采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌紅蛋白（Mb）和心肌肌鈣蛋白I（cTnI）；氯化三苯基四氮唑（TTC）測量心肌梗死面積；蘇木精-伊紅（HE）染色觀察心肌組織病理變化；檢測心肌組織丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）水平；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測大鼠血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）；蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測大鼠心肌組織NF-κB/MAPK通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組MIRI大鼠心肌組織肌纖維彎曲，肌細(xì)胞減少，腫脹明顯，細(xì)胞核嚴(yán)重固縮，血清CK-MB、Mb、cTnI水平、心肌梗死面積、心肌細(xì)胞凋亡率、MDA、TNF-α、IL-6含量及p-NF-κB p65、磷酸化NF-κB抑制蛋白（p-IκBα）、磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（p-ERK1/2）、p-p38蛋白水平均升高，SOD活性降低（P＜0.05）。與模型組比較，陽性藥物組和DSD各劑量組大鼠心肌組織損傷減輕，肌纖維形態(tài)完整，肌細(xì)胞增加，無明顯腫脹，細(xì)胞核固縮減輕，血清CK-MB、Mb、cTnI水平、心肌梗死面積、心肌細(xì)胞凋亡率、MDA、TNF-α、IL-6含量及p-NF-κB p65、p-IκBα、p-ERK1/2、p-p38蛋白水平均降低，SOD活性升高（P＜0.05）。結(jié)論：DSD通過抑制NF-κB/MAPK通路，對MIRI大鼠發(fā)揮保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞心肌缺血再灌注；五味子甲素；核因子κB/絲裂原活化蛋白激酶通路；分子機(jī)制；大鼠；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.18.006

Protective Effect of Deoxyschizandrin on Myocardial Ischemia-reperfusion Injury in Rats Based on NF-κB/MAPK Pathway

ZHAO Zhicheng， LIU Guijun

Fourth Affiliated Hospital， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Harbin 150000， Heilongjiang， China

Corresponding AuthorLIU Guijun， E-mail： ccxcrang99@163.com

AbstractObjective：To observe the protective effect of deoxyschizandrin（DSD） on myocardial ischemia-reperfusion injury（MIRI） of rats and its mechanism on nuclear factor κB（NF-κB）/mitogen-activated protein kinase pathway（MAPK） pathway.Methods：Specific pathogen free（SPF） male SD rats were divided into sham group（only threading without ligation，normal saline gavaged） and modeling groups（MIRI model）.The rats with successful modeling were randomly divided into model group（normal saline gavaged），positive drug group（compound Dantiorrhiza dripping pills 8.5 mg/kg gavaged），DSD low-dose group（DSD 20 mg/kg gavaged），DSD medium-dose group（DSD 40 mg/kg gavaged） and DSD high-dose group（DSD 80 mg/kg gavaged），with 20 rats in each group.Serum creatine kinase isoenzyme（CK-MB），myoglobin（Mb） and cardiac troponin I（cTnI） were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.Triphenyltetrazolium chloride（TTC） was used to detect myocardial infarction area.The pathological changes of myocardial tissue were detected by hematoxylin-eosin（HE） staining.The levels of malondialdehyde（MDA） and superoxide dismutase（SOD） in myocardial tissue were detected.Serum tumor necrosis factor-α（TNF-α） and interleukin-6（IL-6） were detected by ELISA.The expression of NF-κB/MAPK pathway-related proteins in rat myocardial tissue was detected by Western Blot.Results：Compared with the sham group，the myocardium of MIRI rats in the model group showed muscle fiber curvature，muscle cell reduction，with obvious swelling，and severe nuclear contraction.Serum CK-MB，Mb，cTnI levels，myocardial infarction area，myocardial cell apoptosis rate，MDA，TNF-α，IL-6 content and p-NF-κB p65，phosphorylated NF-κB inhibitory protein（p-IκBα），phosphorylated extracellular regulatory protein kinase 1/2（p-ERK1/2） and p-p38 were higher，and the SOD activity was lower（P＜0.05）.Compared with the model group，the myocardial tissue damage of rats in the positive drug group and DSD dose groups was less，the muscle fiber shape was intact，the muscle cells were more without obvious swelling，and the nuclear shrinkage decreased.Serum CK-MB，Mb，cTnI levels，myocardial infarction area，myocardial apoptosis rate，MDA，TNF-α，IL-6 contents and p-NF-κB p65，p-IκBα，p-ERK1/2 and p-p38 protein levels were lower，while SOD activity increased（P＜0.05）.Conclusion：DSD played some protective role in MIRI rats by inhibiting NF-κB/MAPK pathway.

Keywordsmyocardial ischemia-reperfusion; deoxyschizandrin; nuclear factor κB/mitogen-activated protein kinase pathway; molecular mechanism; rats; experimental study

心肌缺血是由于流向心臟的血流受阻或減少，造成心臟組織的氧氣和營養(yǎng)供應(yīng)不足，進(jìn)而導(dǎo)致心臟功能障礙，是心血管疾病常見的表現(xiàn)形式，也是發(fā)病率和死亡率較高的原因之一［1］。及時再灌注對挽救缺血心肌至關(guān)重要，然而，再灌注可能對心肌造成不可逆損傷，增加病人死亡率，這種現(xiàn)象稱為心肌缺血/再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）［2］。因此，預(yù)防和減輕MIRI對改善心肌損傷病人預(yù)后非常重要。五味子甲素（deoxyschizandrin，DSD）是從木蘭科植物五味子的干燥成熟果實中提取的木脂素類化合物，是五味子的有效成分之一，具有血管舒張、免疫抑制、抗炎、抗氧化及抗腫瘤等多種藥用價值［3］。有研究顯示，DSD通過抑制Toll樣受體4（TLR4）/核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號通路抑制機(jī)體炎癥、降低氧化應(yīng)激，從而減輕潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的癥狀［4］。關(guān)于DSD對MIRI的作用研究較少。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，引起促炎基因的異常表達(dá)，在炎癥調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族包括細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular-signal-regulated kinase，ERK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和p38，可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡、炎癥和先天免疫等多種細(xì)胞活動［5-6］。有研究顯示，激活NF-κB和MAPK導(dǎo)致心肌缺血，抑制miR-217使NF-κB和MAPK信號通路失活，從而防止MIRI［7］。本研究旨在探討DSD是否通過調(diào)節(jié)NF-κB/MAPK信號通路對MIRI大鼠發(fā)揮保護(hù)作用。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物

無特定病原體（SPF）級雄性SD大鼠120只，6周齡，體質(zhì)量160～200g，購自常州卡文斯實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（蘇）2021-0013。

1.1.2實驗試劑

DSD（貨號：PB1217，北京普非生物科技有限公司）；復(fù)方丹參滴丸（天士力醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z10950111）；肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌紅蛋白（Mb）ELISA試劑盒（貨號：CSB-E14403r、CSB-E08049r，武漢華美生物工程有限公司）；心肌肌鈣蛋白I（cTnI）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒（HAS-49029，深圳海思安生物技術(shù)有限公司）；氯化三苯基四氮唑（TTC）染色液（貨號：PR1611，北京普非生物科技有限公司）；一步法脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（貨號：E-CK-A320，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（貨號：EY-elisa5989、EY-elisa5966，上海一研生物科技有限公司）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）ELISA試劑盒（貨號：EK-R38696、EK-R36902，上海酶研生物科技有限公司）；NF-κB p65、p-NF-κB p65、NF-κB抑制蛋白（IκBα）、磷酸化IκBα（p-IκBα）、ERK1/2、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）、p38、磷酸化p38（p-p38）一抗（貨號：ab16502、ab76302、ab32518、ab133462、ab184699、ab201015、ab170099、ab178867，英國Abcam公司）。

1.2方法

1.2.1MIRI大鼠模型建立

參照文獻(xiàn)［8］制備MIRI大鼠模型。首先對大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）誘導(dǎo)麻醉，之后將大鼠氣管連接到呼吸機(jī)后在肋間隙處打開胸腔，暴露心臟，用4-0絲線結(jié)扎左冠狀動脈前降支，使其缺血30 min，30 min后松開結(jié)扎線，再灌注2 h。觀察Ⅱ?qū)?lián)心電圖，ST段抬高表明成功進(jìn)行了局部缺血。抬高的ST段下降1/2及以上，T波恢復(fù)表明再灌注成功。假手術(shù)組大鼠僅在左冠狀動脈前降支處穿線但不結(jié)扎。

1.2.2動物分組與給藥

將造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組、陽性藥物組（復(fù)方丹參滴丸）、DSD低劑量組、DSD中劑量組、DSD高劑量組，每組20只。假手術(shù)組和模型組均灌胃等量的生理鹽水，陽性藥物組灌胃8.5 mg/kg的復(fù)方丹參滴丸溶液［9］，DSD低劑量組、DSD中劑量組、DSD高劑量組分別灌胃20、40、80 mg/kg的DSD［10］。每日1次，持續(xù)10 d，末次給藥結(jié)束1 h后進(jìn)行造模。

1.2.3檢測大鼠血清CK-MB、Mb和cTnI活性

將大鼠麻醉后通過腹主動脈采血至離心管中，以3 000 r/min離心10 min后取上清，凍存至－20 ℃。采用ELISA試劑盒檢測大鼠血清LDH、CK-MB和cTnI活性。

1.2.4TTC測定大鼠心肌梗死面積

將所有大鼠麻醉后處死，解剖取心臟用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗干凈，凍存至－80 ℃。每組隨機(jī)選取5個心肌組織在液氮中冷凍20 s并切成約2 mm的薄片，置于2%的TTC溶液中，37 ℃孵育30 min。將組織切片用4%多聚甲醛溶液固定24 h。最后采集圖像并通過Image-Pro Plus軟件分別測量切片組織的梗死面積。

1.2.5蘇木精-伊紅（HE）染色觀察大鼠心肌組織病理變化

從凍存的心肌組織中每組隨機(jī)選取5個，置于4%多聚甲醛中固定過夜并進(jìn)行石蠟包埋和切片。之后將切片脫蠟水化后，分別用蘇木素和伊紅溶液染色，PBS清洗后晾干并封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織的病理形態(tài)改變。

1.2.6TUNEL染色觀察大鼠心肌細(xì)胞凋亡率

從凍存的心肌組織中每組隨機(jī)選取5個，PBS清洗3次后加入蛋白酶K孵育30 min，再加入配制好的TUNEL工作液，在37 ℃條件下避光1 h，DAPI染液復(fù)染10 min，PBS脫色3次，晾干后封片，使用熒光顯微鏡觀察拍照，并計算細(xì)胞凋亡率。

1.2.7測定大鼠心肌組織MDA和SOD水平

從凍存的心肌組織中每組隨機(jī)選取5個，加入預(yù)冷的PBS研磨，4 ℃條件下，以8 000 r/min離心10 min，收集上清。根據(jù)試劑盒操作步驟檢測心肌組織MDA和SOD水平。

1.2.8ELISA測定大鼠血清TNF-α、IL-6含量

取凍存的血清置于冰上溶解，根據(jù)ELISA試劑盒的操作步驟制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用酶標(biāo)儀檢測血清在450 nm處的吸光度，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血清TNF-α、IL-6含量。

1.2.9蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測大鼠心肌組織NF-κB/MAPK信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

將剩余凍存的心肌組織取出，加入蛋白裂解液進(jìn)行勻漿，10 000 r/min離心10 min收集上清，二喹啉甲酸（BCA）測定蛋白濃度。每孔加入20 mg蛋白樣品，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離目的蛋白并轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。將PVDF置于5%脫脂牛奶中4 ℃過夜，用一抗稀釋液（NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα、p-IκBα、ERK1/2、p-ERK1/2、p38、p-p38抗體稀釋倍數(shù)1∶1 000）室溫孵育2 h，再用羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗稀釋液（稀釋倍數(shù)1∶1 000）室溫振蕩孵育2 h，最后用顯影劑顯影，在凝膠成像儀中觀察蛋白條帶。以β-actin為內(nèi)參蛋白，采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

采用Graphpad prism 8.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1DSD對MIRI大鼠血清CK-MB、Mb和cTnI活性的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清CK-MB、Mb和cTnI活性升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性藥物組和DSD低劑量組、DSD中劑量組、DSD高劑量組大鼠血清CK-MB、Mb和cTnI活性降低（P＜0.05）；與陽性藥物組比較，DSD低劑量組、DSD中劑量組大鼠血清CK-MB、Mb和cTnI活性升高（P＜0.05）。詳見表1。

2.2DSD對MIRI大鼠心肌梗死面積的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌梗死面積增大（P＜0.05）；與模型組比較，陽性藥物組和DSD低劑量組、DSD中劑量組、DSD高劑量組大鼠心肌梗死面積減?。≒＜0.05）；與陽性藥物組比較，DSD低劑量組、DSD中劑量組大鼠心肌梗死面積增大（P＜0.05）。詳見圖1和表2。 圖1各組大鼠心肌梗死TTC染色圖

2.3DSD對MIRI大鼠心肌組織病理形態(tài)的影響

HE染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組心肌組織肌纖維彎曲，肌細(xì)胞減少，且腫脹明顯，細(xì)胞核嚴(yán)重固縮；與模型組比較，陽性藥物組和DSD低劑量組、DSD中劑量組、DSD高劑量組心肌組織損傷減輕，肌纖維形態(tài)完整，肌細(xì)胞增加，無明顯腫脹，且細(xì)胞核固縮減輕。詳見圖2。

2.4DSD對MIRI大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性藥物組和DSD低劑量組、DSD中劑量組、DSD高劑量組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）；與陽性藥物組比較，DSD低劑量組、DSD中劑量組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）。詳見圖3和表3。

2.5DSD對MIRI大鼠心肌組織MDA和SOD水平的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織MDA水平升高，SOD水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽性藥物組和DSD低劑量組、DSD中劑量組、DSD高劑量組大鼠心肌組織MDA水平降低，SOD水平升高（P＜0.05）；與陽性藥物組比較，DSD低劑量組、DSD中劑量組大鼠心肌組織MDA水平升高，SOD水平降低（P＜0.05）。詳見表4。

2.6DSD對MIRI大鼠血清TNF-α、IL-6含量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6含量升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性藥物組和DSD低劑量組、DSD中劑量組、DSD高劑量組大鼠血清TNF-α、IL-6含量降低（P＜0.05）；與陽性藥物組比較，DSD低劑量組、DSD中劑量組大鼠血清TNF-α、IL-6含量升高（P＜0.05）。詳見表5。

2.7DSD對MIRI大鼠心肌組織NF-κB/MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織p-IκBα、p-NF-κB p65、p-ERK1/2、p-p38蛋白水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性藥物組和DSD低劑量組、DSD中劑量組、DSD高劑量組p-IκBα、p-NF-κB p65、p-ERK1/2、p-p38蛋白水平降低（P＜0.05）；與陽性藥物組比較，DSD低劑量組、DSD中劑量組p-IκBα、p-NF-κB p65、p-ERK1/2、p-p38蛋白水平升高（P＜0.05）。詳見表6和圖4。

3討論

MIRI是一種在缺血性心臟病中冠狀動脈血流恢復(fù)后引起心肌功能障礙和結(jié)構(gòu)障礙的疾病，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡和壞死，進(jìn)而增加多種疾病的發(fā)病率和死亡率，包括缺血性腦卒中、心肌梗死和急性腎損傷［11-12］。因此，研究MIRI的治療方案對多種心血管疾病均有重要的臨床意義。CK-MB、Mb和cTnI是診斷心肌功能障礙的3項重要指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清CK-MB、Mb和cTnI水平升高，心肌梗死面積增大，心肌組織損傷嚴(yán)重，且細(xì)胞凋亡率升高；陽性藥物組和DSD低劑量組、DSD中劑量組、DSD高劑量組血清CK-MB、Mb和cTnI水平降低，心肌梗死面積減小，心肌組織損傷減輕，且細(xì)胞凋亡率降低。提示DSD可減輕MIRI大鼠心肌功能障礙、心肌梗死程度，抑制心肌細(xì)胞凋亡，從而減輕心肌組織的病理性損傷。

有研究顯示，MIRI與活性氧（ROS）的產(chǎn)生密切相關(guān)，ROS的過度積累導(dǎo)致氧化應(yīng)激，減少ROS可改善缺血再灌注（I/R）引起的心肌損傷［13］。抗氧化因子SOD可清除過氧化物的產(chǎn)生，MDA是膜脂過氧化重要的產(chǎn)物之一，兩者均可作為氧化應(yīng)激的重要指標(biāo)［14］。相關(guān)研究顯示，炎癥在MIRI中發(fā)揮作用，即I/R增加了炎癥小體的表達(dá)，之后導(dǎo)致IL-1β的裂解，引起炎癥細(xì)胞浸潤并增加心臟TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子的表達(dá)［15］。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌組織MDA水平及血清TNF-α、IL-6水平均升高，SOD水平降低；陽性藥物組和DSD低劑量組、DSD中劑量組、DSD高劑量組MDA水平及TNF-α、IL-6水平均降低，SOD水平升高。提示DSD可抑制MIRI大鼠的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，減輕I/R引起的心肌損傷。但具體的作用機(jī)制尚未明確。

有研究表明，NF-κB和MAPK信號通路參與炎癥和免疫調(diào)節(jié)，NF-κB是一種轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)炎癥信號傳導(dǎo)，可被ROS激活，是氧化應(yīng)激的傳感器［16］。NF-κB的激活導(dǎo)致IκB磷酸化，之后通過泛素化降解，釋放NF-κB p65并將其易位到細(xì)胞核，在細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄［17］。MAPK參與了各種細(xì)胞活動，該通路的激活涉及JNK、ERK1/2和p38的磷酸化，進(jìn)而調(diào)節(jié)炎癥基因的表達(dá)［18］。相關(guān)研究顯示，NF-κB和MAPK通路參與調(diào)節(jié)高血壓、心力衰竭和心肌肥大等多種生理功能，抑制MAPK/NF-κB通路可減輕大鼠MIRI，抑制TLR4/NF-κB/MAPK信號通路可改善腦I/R損傷［19-20］。本研究結(jié)果顯示，模型組心肌組織p-IκBα、p-NF-κB p65、p-ERK1/2、p-p38水平均升高；陽性藥物組和DSD低劑量組、DSD中劑量組、DSD高劑量組心肌組織p-IκBα、p-NF-κB p65、p-ERK1/2、p-p38水平降低。提示DSD可阻斷NF-κB p65的核轉(zhuǎn)錄，抑制NF-κB和MAPK通路被激活，從而抑制氧化應(yīng)激和炎性因子的表達(dá)，減輕大鼠心肌損傷。因此，本研究推測DSD可能是通過抑制NF-κB/MAPK信號通路、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，對MIRI大鼠發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，DSD通過抑制NF-κB/MAPK信號通路對MIRI大鼠發(fā)揮保護(hù)作用，DSD可能是治療MIRI的潛在藥物。但本研究未使用通路激活劑進(jìn)行回補(bǔ)實驗，因此DSD對NF-κB/MAPK信號通路及其下游因子的具體作用仍需進(jìn)一步研究驗證。

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（收稿日期：2023-04-14）

（本文編輯薛妮）