關(guān)鍵詞：劍麻斑馬紋??；煙草疫霉；銅綠假單胞菌；生物防治

中圖分類(lèi)號(hào)：S435.63；S476.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

劍麻為龍舌蘭科龍舌蘭屬的一種熱帶麻類(lèi)經(jīng)濟(jì)作物，是世界最常用的一類(lèi)硬質(zhì)纖維植物。原產(chǎn)于墨西哥，現(xiàn)廣泛分布于多個(gè)熱帶國(guó)家和地區(qū)[1]。我國(guó)從20 世紀(jì)50 年代初期的小規(guī)模種植到60 年代引種劍麻H.11648 雜交品種，后逐步發(fā)展到當(dāng)代的劍麻主產(chǎn)地之一，廣泛分布在我國(guó)華南一帶[2]。劍麻葉片纖維豐富，纖維細(xì)胞長(zhǎng)，細(xì)胞壁厚，質(zhì)地堅(jiān)韌，因此劍麻有耐磨、耐鹽堿、不易腐蝕等特性[3]。其纖維合成的聚合物復(fù)合材料具有隔熱、輕便且有韌性等優(yōu)點(diǎn)[4]。因此劍麻纖維廣泛用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、漁業(yè)及國(guó)防等領(lǐng)域[5-6]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，劍麻中分離的皂苷元、多糖類(lèi)等化學(xué)成分可用于醫(yī)療行業(yè)，為臨床提供用藥依據(jù)[7-8]。此外，劍麻麻渣還可制造飼料和有機(jī)肥[9]、提取皂素等[10-12]，大大提高了劍麻的綜合利用程度[13]。

劍麻斑馬紋病首次發(fā)現(xiàn)于1961年，主要的致病菌為煙草疫霉菌[14-17]，劍麻煙草疫霉可侵染整株，大多為先感染葉片，之后向莖、軸延伸，分別引起葉斑、莖腐和軸腐等癥狀，嚴(yán)重時(shí)整株劍麻死亡[18]。劍麻斑馬紋病的侵入方式主要是傷口侵入，在田間最主要的侵染方式主要是通過(guò)土壤地面徑流和雨水傳播[19]。目前生產(chǎn)上對(duì)斑馬紋病的防治還是以預(yù)防為主，優(yōu)先采取農(nóng)業(yè)技術(shù)措施防治，化學(xué)防治為輔，并結(jié)合抗病育種等綜合防治措施[20]。但長(zhǎng)期使用化學(xué)藥劑防治不但污染環(huán)境、造成農(nóng)藥殘留，而且植物自身可能會(huì)產(chǎn)生抗藥性。因此利用拮抗微生物通過(guò)其競(jìng)爭(zhēng)、抗生、溶菌和誘導(dǎo)等各種作用機(jī)制來(lái)防治土傳病害，從而減緩或預(yù)防病原菌侵害的程度，是減輕環(huán)境污染、維護(hù)生態(tài)平衡的一種有效且綠色環(huán)保的防治途徑[21-22]。

1 材料與方法

1.1 材料

供試生防菌：菌株P(guān)aHNHK01 分離自海南省?？谑械暮分仓晟希４嬗谥袊?guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所。

供試病原菌： 煙草疫霉菌（ Phytophthoranicotianae）保存于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所熱帶糧食與特色作物病害研究組；抑菌譜病原菌參照侯會(huì)霞等[23]的病原菌，略有改動(dòng)，供試病原菌見(jiàn)表1。

1.2 方法

1.2.1 生防菌株的篩選 用五點(diǎn)對(duì)峙法[24]篩選生防菌，在PDA 固體平板中心接入5 mm 煙草疫霉菌餅，以菌餅為中心，在其上下左右20 mm 處接入生防菌，以只在中心接入病原菌為對(duì)照，每個(gè)3 次重復(fù)，于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)5～8 d，待對(duì)照菌落長(zhǎng)至平板2/3 時(shí)，測(cè)量病原菌菌落直徑（cm），計(jì)算抑菌率[25]。

1.2.2 生防菌株的鑒定 （1）形態(tài)學(xué)觀(guān)察。將生防菌接入LB 培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)后按梯度稀釋并涂布于LB 平板上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，觀(guān)察單菌落特征。采用革蘭氏染色法[26]測(cè)定生防菌株的種類(lèi)。

（2）生理生化指標(biāo)測(cè)定。參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[27]的方法，對(duì)生防菌株P(guān)aHNHK01的部分生理生化特性進(jìn)行測(cè)定，各個(gè)指標(biāo)測(cè)定參照侯會(huì)霞等[23]的方法。

（3）分子生物學(xué)鑒定。將生防細(xì)菌單菌落接種于LB 液體培養(yǎng)基中28 ℃、180 r/min 過(guò)夜培養(yǎng)，離心收集菌體，用OMEGA 細(xì)菌DNA 提取試劑盒進(jìn)行生防細(xì)菌DNA 的提取。所用引物為細(xì)菌鑒定通用引物16S rDNA 和管家基因引物atpD、gapA 和rpoA，參照侯會(huì)霞等[23]和魏靖宇等[28]的引物序列和反應(yīng)程序。

將PCR 反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，選取成像清晰且符合預(yù)期條帶大小的PCR產(chǎn)物送深圳華大基因股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。隨后利用NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cg）的GenBank 進(jìn)行BLAST 分析，并進(jìn)行同源序列比對(duì)。然后使用MEGA 11 軟件對(duì)序列進(jìn)行分析，對(duì)參考序列進(jìn)行串聯(lián)拼接，利用鄰接法（neighbor-joining， NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，最終確定菌株的分類(lèi)地位。

1.2.3 生防菌抑菌譜測(cè)定 參照1.2.1 中的方法測(cè)定生防菌株P(guān)aHNHK01 對(duì)12 種供試病原菌的抑制效果，觀(guān)察并計(jì)算其抑菌率[29]。

1.2.4 生防菌促生功能測(cè)定 采用 Salkowski 比色法測(cè)定菌株P(guān)aHNHK01 的產(chǎn)IAA 能力[30]，以IAA 標(biāo)準(zhǔn)液50 μg/mL 處理的LB 培養(yǎng)基為陽(yáng)性對(duì)照（CK⁺），未接菌的LB 培養(yǎng)基為陰性對(duì)照（CK^?）；參照郭海等[31]的方法測(cè)定菌株P(guān)aHNHK01 的溶磷能力；采用點(diǎn)接法測(cè)定解鉀能力[32]；用固氮培養(yǎng)基測(cè)定固氮能力；采用CAS 培養(yǎng)基測(cè)定嗜鐵素。

1.2.5 生防菌對(duì)劍麻葉片的離體防效 選取健康、長(zhǎng)勢(shì)一致的劍麻葉片同時(shí)接入煙草疫霉菌和生防菌PaHNHK01。分別在葉片上、中、下3 個(gè)部位用滅菌后的昆蟲(chóng)針刺傷，參照邱睿等[33]的方法，在刺傷部位菌絲面朝下接種直徑為10 mm 的煙草疫霉菌餅， 并噴施1 mL 濃度為1×10⁸CFU/mL 的PaHNHK01 菌懸液；以只接煙草疫霉菌餅為陽(yáng)性對(duì)照（CK⁺）；以只噴施NA 液體培養(yǎng)基（CK₁^?）和空白V8 菌餅（CK₂^?）為陰性對(duì)照，接種后用無(wú)菌脫脂棉和無(wú)菌水保濕，觀(guān)察發(fā)病情況并計(jì)算防效。

1.2.6 生防菌次生代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌的影響 （1）銅綠假單胞菌發(fā)酵濾液的制備。取28 ℃振蕩培養(yǎng)48 h 的PaHNHK01 發(fā)酵液，10 000 r/min、4 ℃離心10 min，棄沉淀，用0.22 μL 細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾上清液，重復(fù)2 次，得無(wú)菌發(fā)酵液[34]。

（2）無(wú)菌發(fā)酵液抑菌活性的測(cè)定。采用含藥平板法，將無(wú)菌發(fā)酵液按不同梯度加入已融好且冷卻到55 ℃左右的V8 培養(yǎng)基中，充分混勻后倒入培養(yǎng)皿制成固體平板培養(yǎng)基。凝固后將5 mm劍麻斑馬紋病菌菌餅接種到平板中央，以不加PaHNHK01 發(fā)酵濾液的平板為對(duì)照，于28 ℃恒溫培養(yǎng)[34]，觀(guān)察病原菌菌絲生長(zhǎng)情況并按照1.2.1的方法計(jì)算抑菌率。

（3）PaHNHK01 粗提物提取及其抑菌活性的測(cè)定。制備PaHNHK01 發(fā)酵液4 L，10 000 r/min、4 ℃離心10 min，保留上清液，用等體積的乙酸乙酯萃取PaHNHK01 有機(jī)相，將萃取的有機(jī)相合并， 于42 ℃ 條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)， 留下物質(zhì)即PaHNHK01 粗提物。參照1.2.6-（2）的方法測(cè)定抑菌活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2019 和IBM SPSS Statistics 26 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，采用Duncan’s 新復(fù)極差法進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異顯著性檢驗(yàn)；分子生物學(xué)鑒定使用DNAman 軟件進(jìn)行序列拼接，用MEGA11 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌株的活化與篩選

通過(guò)活化篩選獲得生防菌株P(guān)aHNHK01，菌株P(guān)aHNHK01 對(duì)病原菌絲生長(zhǎng)抑制率為89.79%，PaHNHK01 對(duì)煙草疫霉菌菌絲有明顯的抑制效果（圖1）。通過(guò)光學(xué)顯微鏡對(duì)煙草疫霉菌菌絲進(jìn)行觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)對(duì)照正常菌絲表面光滑、粗細(xì)均勻、生長(zhǎng)正常（圖2A），而PaHNHK01 對(duì)峙的煙草疫霉菌出現(xiàn)菌絲體畸形（圖2B）、膨大增粗（圖2C）、分支（圖2D）等現(xiàn)象。

2.2 生防菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)特征 菌株P(guān)aHNHK01 的菌落在LB 平板上呈現(xiàn)出不透明的橘黃色菌體，其邊緣整齊，表面較光滑（圖3A）。經(jīng)革蘭氏染色后在顯微鏡下觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，PaHNHK01 菌體細(xì)胞為桿狀，革蘭氏染色后呈紅色（圖3B），因此PaHNHK01為革蘭氏陰性細(xì)菌。

2.2.2 生理生化鑒定 生理生化測(cè)試結(jié)果顯示，菌株P(guān)aHNHK01 在氧化酶、接觸酶、硝酸鹽還原和明膠液化測(cè)試中呈陽(yáng)性反應(yīng)，在乙酰甲基甲醇、甲基紅和淀粉水解測(cè)定中呈陰性反應(yīng)。此外，該菌株能利用葡萄糖、果糖和甘露醇產(chǎn)酸，但不能利用山梨醇和蔗糖產(chǎn)酸。在NaCl 濃度為2%～10%時(shí)，該菌株均可生長(zhǎng)，但不能利用葡萄糖、蔗糖、山梨醇、果糖和甘露醇產(chǎn)氣（表2）。

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定 測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)DNAman軟件拼接處理后，菌株P(guān)aHNHK01 的16S rDNA有效序列長(zhǎng)度為1397 bp，atpD、gapA 和rpoA 有效序列長(zhǎng)度分別為964、931、931 bp。在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST 序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，菌株P(guān)aHNHK01與銅綠假單胞菌的同源性極高。利用MEGA 11軟件，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示菌株P(guān)aHNHK01 的16S rDNA、atpD、gapA、rpoA序列與銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）聚為一支（圖4、圖5）。綜合考慮生防菌的形態(tài)特征、生理生化特征以及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析結(jié)果，確認(rèn)菌株P(guān)aHNHK01 為銅綠假單胞菌。

2.3 生防菌抑菌譜測(cè)定

生防菌PaHNHK01 對(duì)12 種供試病原菌均有不同程度的拮抗效果（圖6，表3），對(duì)4 種卵菌類(lèi)病原菌菌絲的抑菌率均在75%以上，其中PaHNHK01對(duì)大豆疫霉菌（P. sojae）的抑制效果最好，抑菌率為93.33%，對(duì)辣椒疫霉菌（P. capsica）、棕櫚疫霉菌（P. palmivora）、瓜疫霉菌（P. melonis）的抑菌率分別為80.45%、76.67%、75.22%。對(duì)8 種病原真菌的菌絲抑制率均在55.33% 以上， 其中PaHNHK01 對(duì)暹羅刺盤(pán)孢菌（C. siamense）的抑制效果較強(qiáng)，抑制率為81.33%，對(duì)尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）抑制效果較弱，抑菌率為55.33%。

2.4 生防菌促生特性分析

生防菌促生特性結(jié)果表明，菌株P(guān)aHNHK01不具有產(chǎn)植物激素IAA 能力（圖7A）；在有機(jī)磷培養(yǎng)基和無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基上，菌株P(guān)aHNHK01 的菌落周?chē)霈F(xiàn)透明暈圈（圖7B，圖7C）；但在鉀培養(yǎng)基上并未觀(guān)察到菌落周?chē)a(chǎn)生透明油滴狀暈圈（圖7D）；在阿須貝無(wú)氮固體培養(yǎng)基上，菌株生長(zhǎng)狀況良好（圖7E）；在CAS 固體培養(yǎng)基上PaHNHK01 的菌落周?chē)鷦t呈現(xiàn)橘黃色暈圈（圖7F）。結(jié)果表明，菌株P(guān)aHNHK01 具備解有機(jī)磷、解無(wú)機(jī)磷、固氮和產(chǎn)鐵的能力，卻不具備解鉀的能力。

2.5 生防菌對(duì)劍麻葉片的離體防效

生防菌PaHNHK01 對(duì)劍麻離體葉片斑馬紋病有較好防效，只接種煙草疫霉菌的劍麻葉片發(fā)病嚴(yán)重，同時(shí)接種PaHNHK01 和煙草疫霉菌的葉片發(fā)病率明顯降低， 防治效果明顯（ 圖8 ），PaHNHK01 對(duì)劍麻斑馬紋病的防效為88.62%，防治效果較理想。

2.6 生防菌次生代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌的影響

2.6.1 無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)劍麻煙草疫霉菌的影響 PaHNHK01 無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)劍麻斑馬紋病菌有明顯的抑制效果（圖9）。室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果表明，PaHNHK01 無(wú)菌發(fā)酵液濃度為15 μL/mL 時(shí)，抑菌率為39.61%；無(wú)菌發(fā)酵液濃度為60 μL/mL 時(shí)，抑菌率達(dá)74.89%。PaHNHK01 無(wú)菌發(fā)酵液的EC50值為20.3679 μL/mL（表4）。

2.6.2 PaHNHK01 粗提物對(duì)劍麻煙草疫霉菌的影響 PaHNHK01 粗提物對(duì)劍麻斑馬紋病菌有明顯的抑制效果（圖10）。室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果表明，PaHNHK01 粗提物濃度為在20 μg/mL 時(shí)，抑菌率為56.07%；粗提物濃度為80 μg/mL 時(shí)，抑菌率達(dá)89.36% 。PaHNHK01 粗提物的EC₅₀ 值為11.9456 μg/mL（表5）。

3 討論

H.11648 是我國(guó)目前劍麻主要栽培品種，該品種高產(chǎn)但極易受煙草疫霉的侵害[35-36]，目前生產(chǎn)上以預(yù)防為主，農(nóng)業(yè)技術(shù)措施、化學(xué)藥劑防治與抗病育種等相結(jié)合的綜合防治措施[20， 37-38]。生產(chǎn)上常用的化學(xué)藥劑有敵克松、甲基托布津等[39-40]?？共∮N難度大、周期緩慢，裴超群等[41]選育的龍舌蘭雜種76416 抗病但出麻率低，目前尚無(wú)明確的高產(chǎn)和抗病品種來(lái)代替H.11648[42]。而農(nóng)業(yè)防治費(fèi)時(shí)費(fèi)力，化學(xué)防治會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生負(fù)面影響，還有農(nóng)藥殘留等問(wèn)題[43]，因此，生物防治可以有效緩解目前面臨的這些問(wèn)題。本研究成功分離出1 株對(duì)劍麻斑馬紋病病原菌有抑制作用的細(xì)菌，抑制率為89.79%，通過(guò)對(duì)該菌的形態(tài)學(xué)觀(guān)察、生理生化檢測(cè)以及分子鑒定，確定菌株P(guān)aHNHK01為銅綠假單胞菌（P. aeruginosa）。

目前常見(jiàn)的生防細(xì)菌有芽孢桿菌屬的枯草芽孢桿菌[44]、解淀粉芽孢桿菌[45]、多粘類(lèi)芽孢桿菌[23]等；假單胞菌屬的銅綠假單胞菌[46]、惡臭假單胞菌[47]等。生防真菌有深綠木霉[48]、哈茨木霉[49]等。生防放線(xiàn)菌主要有鏈霉菌[50]等。銅綠假單胞菌次生代謝產(chǎn)物非常豐富，已被鑒定的有24 種[51]，且對(duì)多數(shù)植物病原菌有抑制效果。比利時(shí)的ISWANDI 等[52]在1987 年首次從大麥根部分離到1 株銅綠假單胞菌7NSK2，利用其菌懸液處理種子和土壤，對(duì)植物有促生效果，還可以使植物根際微生物的種群得到改善。研究表明，銅綠假單胞菌對(duì)立枯絲核菌、齊整小核菌、腐皮鐮孢、柑橘黃單胞菌和胡蘿卜軟腐歐文氏菌等均有抑制作用[53]。譙天敏等[54]利用抗生素標(biāo)記法發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌ZB27 可以定殖在植株上，對(duì)雜交竹梢枯病有較好的防控效果。任小平等[55]研究表明銅綠假單胞菌可作為一種有較好應(yīng)用前景的新型生物農(nóng)藥。還有研究發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌的抑菌機(jī)理是產(chǎn)生一系列化合物，如吩嗪-1-羧酸、藤黃綠膿菌素、3，4-二羥基-N-甲基-4-苯并二氫吡喃酮-丁酰胺等，這些產(chǎn)物對(duì)病原菌生長(zhǎng)均有較強(qiáng)的抑制效果[56-57]，如銅綠假單胞菌產(chǎn)生的吩嗪-1-羧酸對(duì)小麥全蝕病菌、辣椒疫霉、黃瓜炭疽病菌、甜瓜蔓枯病菌和水稻紋枯病菌等病原菌均有較強(qiáng)的抑制作用[58]。本研究中的銅綠假單胞菌PaHNHK01 具有良好的生防潛力，對(duì)煙草疫霉、大豆疫霉、棕櫚疫霉等12 種植物病原，均有良好的抑制效果，表明PaHNHK01 具有廣譜抑菌性。而且PaHNHK01 具有較強(qiáng)的溶磷、固氮等促生功能。但對(duì)銅綠假單胞菌的研究大多報(bào)道的是臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，與臨床分離的菌株相比，從根際分離的銅綠假單胞菌毒性較低，但仍有一定毒性[59]，因此運(yùn)用生防菌的代謝產(chǎn)物來(lái)抑制病原菌非常必要。菌株P(guān)aHNHK01 的無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)劍麻斑馬紋病病原菌的抑菌效果顯著，其EC₅₀ 值為20.3679 μL/mL，其粗提物對(duì)病原菌的抑制效果更為明顯，EC50 值為11.9456 μg/mL。表明劍麻斑馬紋病病原菌的生長(zhǎng)受生防菌PaHNHK01 代謝產(chǎn)物的影響，因此生防菌PaHNHK01 具有良好的生防潛力，研究結(jié)果為劍麻斑馬紋病病原菌煙草疫霉的生物防治提供良好的菌種資源。