關(guān)鍵詞：變質(zhì)毛椰子果；揮發(fā)性物質(zhì)；氣相色譜-離子遷移譜；正交偏最小二乘法判別分析

中圖分類號(hào)：S667.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

椰肉是椰子產(chǎn)品的主要加工原料，其營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特。獲取的主要方式是進(jìn)口毛椰子果，毛椰子果貯藏品質(zhì)直接影響椰肉品質(zhì)。在長(zhǎng)時(shí)間、遠(yuǎn)距離進(jìn)口運(yùn)輸過(guò)程中毛椰子果被封閉在集裝箱內(nèi)，容易產(chǎn)生高溫高濕環(huán)境而使毛椰子果壞果率增加。為了保障加工產(chǎn)品的質(zhì)量需要對(duì)變質(zhì)果加以剔除，在前期的研究中發(fā)現(xiàn)變質(zhì)果與正常果品質(zhì)存在較大差異，變質(zhì)果椰肉油脂的酸價(jià)高、脂肪酸含量低[1]。貯藏溫濕度越高、時(shí)間越長(zhǎng)，毛椰子果中椰肉油脂的酸價(jià)就越高、脂肪酸含量也越低。為了探索變質(zhì)果揮發(fā)性物質(zhì)的差異，前期利用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（headspacesolid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry， HS-SPME-GC-MS）和電子鼻（electronic nose， E-nose）技術(shù)對(duì)未貯藏正常新鮮毛椰子果和不同溫濕度貯藏條件下變質(zhì)毛椰子果的椰肉揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行了研究，篩選出特征揮發(fā)性物質(zhì)[2]。變質(zhì)果椰肉在電子鼻W2W（對(duì)芳香成分和有機(jī)硫化物敏感）傳感器的響應(yīng)值顯著高于未貯藏正常新鮮毛椰子果椰肉。

氣相色譜-離子遷移譜（gas chromatographyionmobility spectrometry， GC-IMS）技術(shù)是氣相色譜和離子遷移譜聯(lián)用的技術(shù)。該技術(shù)利用色譜突出的分離特性，對(duì)待測(cè)樣品的揮發(fā)性組分進(jìn)行預(yù)分離，使其成為單一組分，再通過(guò)離子遷移進(jìn)行二次分離，獲得漂移時(shí)間、保留時(shí)間和信號(hào)強(qiáng)度的三維譜圖，從而大大提高了檢測(cè)的精度[3]。與常規(guī)色譜相比，該技術(shù)無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行蒸餾、萃取等繁瑣的前處理，即使痕量的揮發(fā)性風(fēng)味化合物也能在很短的時(shí)間內(nèi)完成，檢測(cè)操作簡(jiǎn)便，風(fēng)味損失小，能更真實(shí)地保存樣品真正的風(fēng)味。對(duì)同分異構(gòu)體和極性相近的物質(zhì)具有理想的鑒別能力，特別適用于醛、醇、酮、酯類和芳香族化合物等高質(zhì)子親和力和高電負(fù)性的食品風(fēng)味組分的現(xiàn)場(chǎng)快速分析。相比于HS-SPME-GC-MS 技術(shù)，GC-IMS 鑒定的揮發(fā)性物質(zhì)種類和數(shù)量均相對(duì)較少，但是由于檢測(cè)的揮發(fā)性物質(zhì)的沸點(diǎn)比GC-MS的低，對(duì)高揮發(fā)性物質(zhì)更敏感，近年來(lái)GC-MS已被廣泛應(yīng)用于食品貯藏過(guò)程揮發(fā)性物質(zhì)分析等領(lǐng)域[4-6]。

因此，為了更全面探究變質(zhì)果在揮發(fā)性物質(zhì)方面的差異，本文采用GC-IMS 技術(shù)對(duì)未貯藏正常毛椰子果椰肉和3種不同溫濕度（25 ℃/70%、35 ℃/80%和45 ℃/90%）貯藏條件下的變質(zhì)毛椰子果椰肉進(jìn)行分析。采用正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least" squares discriminant analysis， OPLS-DA）構(gòu)建模型，依據(jù)變量投影重要性因子（variable importance in projection， VIP）分析變質(zhì)毛椰子果椰肉中特征揮發(fā)性物質(zhì)，為變質(zhì)果的鑒別和篩選提供更多的方法和技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試椰果 參考王媛媛等[1]的方法，選用可用于加工、未經(jīng)貯運(yùn)的海南本地高種成熟老椰子果為研究對(duì)象，剝?nèi)ネ獠恳?，修整成與國(guó)外進(jìn)口的毛椰子果相同的形態(tài)，分別貯藏于25 ℃/70%、35 ℃/80%和45 ℃/90% 3 種不同溫濕度條件下。取未經(jīng)貯藏正常毛椰子果和3 種不同溫濕度條件下變質(zhì)毛椰子果（25 ℃/70%條件下貯藏6周；35 ℃/80%條件下貯藏至4 周；45 ℃/90%條件下貯藏至3 周），破殼后削去種皮，取肉，分別標(biāo)注為FCM、DCM-25、DCM-35 和DCM-45，用粉碎機(jī)粉碎后存放于?80 ℃冰箱中待檢。

1.1.2 儀器與設(shè)備 MGC-450HP 人工氣候箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FlavourSpec?氣相離子遷移譜聯(lián)用儀，德國(guó)G.A.S.公司。

1.2 方法

GC-IMS分析：稱取椰肉樣品1.0 g，置于20 mL 頂空瓶中， 80 ℃ 孵育15 min 后利用FlavourSpec?氣相離子遷移譜聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)。

自動(dòng)頂空進(jìn)樣條件：孵育溫度80 ℃，孵育時(shí)間15 min，進(jìn)樣體積500 μL，進(jìn)樣針溫度85 ℃，孵化轉(zhuǎn)速500 r/min。

GC 條件：美國(guó)RESTEK 公司色譜柱，WAX柱（30 m×0.53 mm，1.0 μm），色譜柱溫度60 ℃，載氣N2（純度≥99.999%）。載氣流速：初始流速0～2 min，2 mL/min；2～10 min，2～10 mL/min；10～20 min ， 10～100 mL/min ； 20～30 min ，100 mL/min；分析時(shí)間：30 min。

IMS 檢測(cè)條件：漂移管長(zhǎng)度98 mm，管內(nèi)線性電壓500 V/cm，漂移管溫度45 ℃，漂移氣流量150 mL/min（高純氮?dú)?，純度?9.999%），放射源β 射線（氚，3H），正離子模式。

定性與定量：利用正構(gòu)酮C₄～C₉（正丁酮、正戊酮、正己酮、正庚酮、正辛酮、正壬酮）建立保留時(shí)間和保留指數(shù)的校準(zhǔn)曲線，通過(guò)目標(biāo)物的保留時(shí)間計(jì)算該物質(zhì)的保留指數(shù)， 并采用VOCal 軟件內(nèi)置的IMS 數(shù)據(jù)庫(kù)和NIST2020 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性；利用Reporter 插件和GalleryPlot 插件繪制不同樣品的差異圖譜和指紋圖譜。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。利用Office Excel 對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析；利用IBMSPSS Statistics 25.0軟件進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（Plt;0.05）；應(yīng)用SIMCA14.1 和Origin9.0 軟件進(jìn)行繪圖；利用SIMCA14.1 軟件進(jìn)行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫濕度貯藏條件下變質(zhì)毛椰子果椰肉中揮發(fā)性物質(zhì)GC-IMS 譜圖分析

基于Reporter 插件程序獲取不同溫濕度貯藏條件下毛椰子果椰肉中揮發(fā)性物質(zhì)的GC-IMS 三維譜圖、二維俯視圖和差異譜圖。不同溫濕度貯藏條件下毛椰子果椰肉中揮發(fā)性物質(zhì)的三維譜圖如圖1A 所示。整個(gè)圖背景為藍(lán)色，x 軸方向表征離子遷移時(shí)間，y軸方向表征氣相色譜保留時(shí)間。顏色代表物質(zhì)的濃度，白色表示含量較低，紅色表示含量較高，顏色越深表示含量越高。

與GC-IMS 三維譜圖相對(duì)應(yīng)的二維俯視圖如圖1B所示，RIP峰兩側(cè)的每一個(gè)點(diǎn)代表一種風(fēng)味特征物質(zhì)，其顏色深淺和面積大小代表物質(zhì)濃度的高低[7]。圖中大部分?jǐn)?shù)據(jù)位于遷移時(shí)間1.0～2.0和保留時(shí)間100～1600 s 的區(qū)域。為更明顯地比較4 種毛椰子果椰肉的揮發(fā)性物質(zhì)成分差異，通過(guò)Reporter 插件以FCM 樣品圖為參照，其他樣品譜圖做顏色抵消，如圖1C 所示，當(dāng)風(fēng)味特征物質(zhì)濃度高于參照時(shí)顏色呈現(xiàn)紅色，反之呈現(xiàn)藍(lán)色[8]。

2.2 變質(zhì)毛椰子果與未貯藏正常毛椰子果椰肉中GC-IMS揮發(fā)性物質(zhì)定性分析

運(yùn)用NIST 氣相保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫(kù)與IMS 遷移時(shí)間數(shù)據(jù)庫(kù)資料，根據(jù)揮發(fā)性物質(zhì)氣相色譜保留時(shí)間和IMS 遷移時(shí)間對(duì)揮發(fā)性組分進(jìn)行定性分析，如表1 所示，共定性出42 種揮發(fā)性物質(zhì)。其中醇類化合物13 種，酸類化合物5 種，酮類化合物8 種，酯類化合物10 種，醛類化合物4 種，吡嗪類化合物2 種，未定性的化合物3 種。醇類物質(zhì)峰體積最大（圖2A），占比最多（54.86%～78.64%），包括乙醇、丁醇、丙醇、2-甲基丙醇、3 - 甲基丁醇、己醇、戊醇。其次是酸類（7.60%～20.23%）和酮類（8.20%～17.36%），包括乙酸、2-甲基丙酸、庚酸以及丙酮、3-羥基-2-丁酮、環(huán)戊酮、2-丁酮、2-庚酮和4-甲基3-戊烯-2-酮。檢測(cè)到的酯類物質(zhì)占比為1.90%～8.77%，包括己酸丁酯、乙酸乙酯、丁酸丁酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、2-甲基戊酸乙酯、2-羥基丙酸乙酯和丙酸乙酯。醛類物質(zhì)占比在0.38%～1.68%之間，包括3-甲基丁醛、戊醛、庚醛和己醛。吡嗪類是2-乙基-3-甲基吡嗪（0.31%～1.91%）。未定性的物質(zhì)占比為0.50%～2.60%（圖2B）。

2.3變質(zhì)毛椰子果與未貯藏正常毛椰子果椰肉中GC-IMS 揮發(fā)性物質(zhì)指紋圖譜分析

為進(jìn)一步探索不同溫濕度貯藏條件下變質(zhì)毛椰子果椰肉與未貯藏正常毛椰子果椰肉中揮發(fā)性物質(zhì)的差異，采用GalleryPlot 插件制得指紋圖譜（圖3）。每一行代表同一樣品的全部信號(hào)峰，每一列代表同一揮發(fā)性物質(zhì)在不同樣品中的信號(hào)離子峰，顏色深淺代表其濃度高低。通過(guò)指紋圖譜的比較可作為辨別不同毛椰子果椰肉中揮發(fā)性物質(zhì)的依據(jù)[9]。這種可視化有助于辨別樣品中揮發(fā)性有機(jī)化合物及其標(biāo)志性風(fēng)味分子的差異。

如圖3 中A 區(qū)域內(nèi)所示，在FCM 中峰體積較高的揮發(fā)性物質(zhì)主要是環(huán)戊酮和丁醇單體2種。乙酸二聚體、丁醇二聚體、己酸丁酯單體和二聚體、戊醇單體和二聚體、2-庚酮二聚體、2-甲基丙醇二聚體、4-甲基-3-戊烯-2-酮、2-甲基戊酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、戊醛、己醛、2-乙基-3-甲基吡嗪?jiǎn)误w和二聚體、2-羥基丙酸乙酯、2-丁酮、丙酸乙酯、己醇單體和二聚體、丁酸丁酯單體和二聚體、3-甲基丁醇二聚體（24種）以及3 種未定性物質(zhì)在DCM-25 中峰體積高于其他毛椰子果椰肉，而2-甲基丙醇單體、3-羥基-2-丁酮單體和乙醇單體在DCM-25 中峰體積較低。3-羥基-2-丁酮二聚體、丙酮和乙酸乙酯在DCM-25 和DCM-45 中的峰體積均較高（C 區(qū)域內(nèi)）。如紅色箭頭所示，庚酸在DCM-35 中的峰體積最高。3-甲基丁醛和3-甲基丁醇單體在DCM-45中的峰體積高于其他處理（D 區(qū)域內(nèi)）。

2.4 基于PCA和OPLS-DA變質(zhì)毛椰子果椰肉中揮發(fā)性物質(zhì)分析

指紋圖譜僅對(duì)不同溫濕度貯藏條件下變質(zhì)毛椰子果和正常果椰肉中揮發(fā)性成分進(jìn)行粗略區(qū)分。較難精確地確定是哪種揮發(fā)性化合物造成了差異，PCA 和OPLS-DA 能夠有效區(qū)分不同組間的觀測(cè)值，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致各組間差異的重要變量。樣本間的異同可以通過(guò)模型的分值圖直觀地表示出來(lái)[10]。如圖4A 所示，以前2 個(gè)主成分繪制得分圖，方差貢獻(xiàn)率分別為68.5%和15.6%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為84.1%（≥80%），說(shuō)明PCA 分析可以將FCM 與DCM-25、DCM-35 和DCM-45 中檢測(cè)出的揮發(fā)性物質(zhì)種類進(jìn)行有效區(qū)分。FCM 與DCM-45 在一個(gè)象限內(nèi)其揮發(fā)性物質(zhì)相似，DCM-35 與DCM-45 均在不同的象限其差異較大。為了進(jìn)一步提高識(shí)別能力，采用了監(jiān)督化學(xué)計(jì)量技術(shù)，進(jìn)行OPLS-DA 分析，如圖4B所示，與PCA結(jié)果一致，F(xiàn)CM和DCM-45 位于同一個(gè)象限，較為相似，與其余2種位于不同空間位置，彼此保持一定的距離， 實(shí)現(xiàn)了很好的分離。表明DCM-45 雖然貯藏溫濕度高但到達(dá)變質(zhì)的時(shí)間較短， 與正常果揮發(fā)性物質(zhì)的差異也較小。OPLS-DA 模型的擬合參數(shù)（R²=1，Q²=0.970）表明該模型具有很強(qiáng)的解釋和預(yù)測(cè)能力。同樣，進(jìn)行200 次重復(fù)排列檢驗(yàn)以評(píng)估OPLS-DA 模型的穩(wěn)健性，如圖4C 所示，R²=0.275，Q²=-0.999，證明該模型是可靠的，不存在過(guò)擬合，能夠用來(lái)描述4 種毛椰子果椰肉中揮發(fā)性化合物的差異。根據(jù)揮發(fā)性物質(zhì)載荷散點(diǎn)圖（圖4D），丁醇單體在FCM 的峰體積高于其他樣品；己醛、戊醇二聚體、2-羥基丙酸乙酯、4-甲基3-戊烯-2-酮、未知物質(zhì)3、2-乙基-3-甲基吡嗪?jiǎn)误w和二聚體、2-丁酮和2-甲基丁酸乙酯等在DCM-25 的峰體積高于其他樣品；庚酸在DCM-35 的峰體積高于其他樣品；3-甲基丁醛在DCM-45 的峰體積高于其他樣品。

從圖4E 可見(jiàn)，VIP 大于1 的特征揮發(fā)性物質(zhì)共有13 種，分別為：3-甲基丁醛、環(huán)戊酮、3-甲基丁醇單體、丁醇單體、庚醛、丙酮、2-甲基丙醇單體、2-庚酮單體、庚酸、丁酸丁酯單體、乙酸乙酯、乙醇二聚體和2-乙基-3-甲基吡嗪?jiǎn)误w。通過(guò)繪制特征揮發(fā)性物質(zhì)含量的差異熱圖可知（圖4F），在FCM 中的特征揮發(fā)性物質(zhì)為環(huán)戊酮和丁醇單體；DCM-25 中的特征揮發(fā)性物質(zhì)為2-庚酮單體、丁酸丁酯單體、乙酸乙酯、乙醇二聚體和2-乙基-3-甲基吡嗪?jiǎn)误w；DCM-35 中的特征揮發(fā)性物質(zhì)是庚酸；DCM-45 中的特征揮發(fā)性物質(zhì)是3-甲基丁醛、庚醛和丙酮。

3 討論

與GC-MS 相比，利用GC-IMS 對(duì)樣品處理和分析的溫度更低，能夠檢測(cè)到一些熱穩(wěn)定性差和分子量較小的揮發(fā)性物質(zhì)[11-12]。本研究利用GC-IMS 檢測(cè)出DCM-25 的揮發(fā)性物質(zhì)峰體積最大，而HS-SPME-GC-MS 分析DCM-45 的揮發(fā)性物質(zhì)含量最多[2]，說(shuō)明在25 ℃/70%正常溫濕度條件下，由于貯藏時(shí)間長(zhǎng)（6 周），毛椰子果發(fā)生了較為嚴(yán)重的脂質(zhì)氧化降解[1]，生成了較多分子量小的脂質(zhì)氧化降解產(chǎn)物，可被GC-IMS 檢測(cè)出來(lái)。毛椰子果椰肉中的醇、酸、酮類揮發(fā)性物質(zhì)較多，且變質(zhì)后均增加。醇類中增加較為明顯的為丙醇、2-甲基丙醇二聚體和3-甲基丁醇二聚體等。醇類物質(zhì)主要來(lái)源于脂肪酸的降解、氨基酸代謝、碳水化合物發(fā)酵和甲基酮還原等多種途徑[13]，在感官分析上具有較高的閾值。酸類物質(zhì)形成與乳酸發(fā)酵、糖類和蛋白質(zhì)代謝有關(guān)[14]。酮類中增加較為明顯的是3-羥基-2-丁酮二聚體和2-丁酮等。酮類物質(zhì)大多來(lái)源于脂肪氧化、熱降解、氨基酸降解作用以及微生物代謝等，其香氣閾值較高[15]。此外，利用GC-IMS 還分析出2-乙基-3-甲基吡嗪化合物，且變質(zhì)后增加。

在FCM特征揮發(fā)性物質(zhì)中環(huán)戊酮具有令人愉快的薄荷氣味，丁醇具有酒味。DCM-25 特征揮發(fā)性物質(zhì)中2-庚酮具有奶油香和果香，主要由亞油酸氧化降解產(chǎn)生[16]。丁酸丁酯具有蘋(píng)果、香蕉、菠蘿等果香香味，在自然界存在于蘋(píng)果、香蕉、葡萄、梨、草莓等水果之中[17]；乙酸乙酯有酯香、果香氣味[18]；乙醇具有酒香的氣味；2-乙基-3-甲基吡嗪則具有堅(jiān)果、焙烤和甜香味道[19]，是一類通過(guò)含氨基化合物和羰基化合物發(fā)生的Maillard 反應(yīng)形成的含氮雜環(huán)化合物，通過(guò)Streker降解反應(yīng)產(chǎn)生[20]。在前期的報(bào)道中也發(fā)現(xiàn)毛椰子果長(zhǎng)時(shí)間貯藏后會(huì)出現(xiàn)Maillard 的褐變反應(yīng)[1]。DCM-25 中的特征揮發(fā)性物質(zhì)以酯、醇、酮類為主。酯、醇類物質(zhì)多存在于發(fā)酵型食品中尤其是酒類，丁酸丁酯、乙酸乙酯、乙醇在白酒中均有報(bào)道[21-22]?？赡苁且?yàn)?5 ℃/70%的正常溫濕度貯藏過(guò)程中，貯藏時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，毛椰子果椰肉中糖類物質(zhì)代謝生成醇類，醇類進(jìn)一步與酸類酯化而成酯類物質(zhì)。庚酸是DCM-35 中的特征揮發(fā)性物質(zhì)，具有發(fā)酵香和果香，在貯藏后期產(chǎn)生[23]。稍高的35 ℃/80%貯藏溫濕度，貯藏時(shí)間較短，抑制了醇類和酯類物質(zhì)的生成，但加速了酸類物質(zhì)的積累。DCM-45 特征揮發(fā)性物質(zhì)中3-甲基丁醛具有水果香/堅(jiān)果香/奶酪香[24]，主要是由亮氨酸通過(guò)生物合成和Strecker 降解途徑產(chǎn)生[25]。由于Strecker降解途徑需要在一定溫度下進(jìn)行，本研究中的3-甲基丁醛可能主要由于45 ℃/90%的高溫高濕條件發(fā)生的Strecker 降解途徑產(chǎn)生的。庚醛具有魚(yú)腥和油脂味[26]，主要由亞麻酸分解產(chǎn)生；丙酮?jiǎng)t具有苦杏仁味、蘋(píng)果香和梨香[27]。DCM-45 中的特征揮發(fā)性物質(zhì)主要為醛、酮類物質(zhì)。脂肪中不飽和脂肪酸在溫度較高的情況下容易被氧化生成過(guò)氧化物，繼而進(jìn)一步分解為風(fēng)味閾值較低的醛、酮等揮發(fā)性物質(zhì)。醛類在低濃度下具有特征性的脂肪香氣，但高于臨界值的較高濃度會(huì)產(chǎn)生腐爛、腐臭或其他異味[28]。

綜上所述，在4種椰肉樣品中均定性出42種揮發(fā)性物質(zhì)，其中醇類13種，酸類5種，酮類8種，酯類10種，醛類4種，吡嗪類化合物2種。醇類最多，其次是酸、酮、酯、醛和吡嗪類物質(zhì)，且變質(zhì)后醇、酸、酮類均增多。利用OPLS-DA分析出13 種特征揮發(fā)性物質(zhì)，其中FCM 中的特征揮發(fā)性物質(zhì)有環(huán)戊酮和丁醇單體；DCM-25中有2-庚酮單體、丁酸丁酯單體、乙酸乙酯、乙醇二聚體和2-乙基-3-甲基吡嗪?jiǎn)误w（以酯、醇、酮為主）；DCM-35中有庚酸（主要是酸類）；而DCM-45中有3-甲基丁醛、庚醛和丙酮（以醛、酮類為主）。本研究為變質(zhì)果的篩選提供了更多的理論依據(jù)。