摘 要：本文采用HPLC-柱后光化學(xué)衍生法測定玉米中黃曲霉毒素B1含量，通過系統(tǒng)分析整個測定過程的影響因素，評估不確定度來源，評定各個不確定度分量，發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制與測量重復(fù)性引入的不確定度對測量結(jié)果的影響較大。當(dāng)玉米樣品中黃曲霉毒素B1含量為7.86 μg·kg-1時，擴(kuò)展不確定度為0.68 μg·kg-1（k=2）。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜-柱后光化學(xué)衍生法；玉米；黃曲霉毒素B1；不確定度

Abstract： High performance liquid chromatography-post column photochemical derivatization method was used to determine aflatoxin B1 content in corn. Through systematic analysis of the influencing factors of the whole determination process， the sources of uncertainty were evaluated， and each uncertainty component was evaluated. It was found that the uncertainty introduced by the concentration of standard substance， the preparation of standard solution and the measurement repeatability had a great influence on the measurement results. When aflatoxin B1 content was 7.86 μg·kg-1， the extended uncertainty was 0.68 μg·kg-1（k=2）.

Keywords： high performance liquid chromatography-post column photochemical derivatization method; maize; aflatoxin B1; uncertainty

黃曲霉毒素B1是一種對人類健康危害極大的霉菌毒素，存在于土壤、動植物中，尤其容易污染玉米、小麥、花生等糧食作物與堅果，其通過食物鏈攝入人體后，不僅會損害人體免疫系統(tǒng)，還有強(qiáng)烈的致畸、致癌、致突變效應(yīng)[1-2]。近年來，在日常食品安全抽檢工作中發(fā)現(xiàn)，食用油、炒貨堅果、芝麻醬等糧食和堅果產(chǎn)品中黃曲霉毒素B1問題比較突出。因此，準(zhǔn)確測定玉米等農(nóng)產(chǎn)品中的黃曲霉毒素B1含量非常重要。測量不確定度評定可以反映檢驗檢測過程中影響測定結(jié)果準(zhǔn)確性的各個因素，進(jìn)而提升檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度。本研究參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》（GB 5009.22—2016）[3]中第三法高效液相色譜-柱后衍生法測定玉米中黃曲霉毒素B1含量，依據(jù)《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）中[4]規(guī)定的方法程序評定該檢測過程中的測量不確定度，以期提高測量結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

U3000高效液相色譜儀（配熒光檢測器），美國賽默飛公司；ME3002E電子天平（精度0.01 g），美國梅特勒-托利多公司；KH-100DB超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；TG16G高速離心機(jī)，常州市億能實驗儀器廠；Synergy超純水機(jī)，德國Milli-Q公司。

甲醇中黃曲霉毒素B1（濃度為2 μg·mL-1），壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉均為分析純，無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純，德國Merck公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

（1）標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。準(zhǔn)確吸取0.5 mL濃度為2 μg·mL-1的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液，并用甲醇定容至10 mL，混勻，配制成濃度為100 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

（2）標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。分別吸取0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL和3.0 mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液，用流動相定容至10 mL，混勻，配制為1 ng·mL-1、2 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1和30 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.2.2 樣品處理過程

稱取5 g粉碎、過篩、混勻的玉米試樣于50 mL離心管中，加入20 mL甲醇-水溶液（70+30），超聲振蕩20 min，于6 000 r·min-1下離心10 min，得到上清液。

準(zhǔn)確移取4 mL上清液，加入23 mL PBS溶液，混勻。取出免疫親和柱，待其恢復(fù)至室溫后，連接在注射器套管上，將上述樣液移入注射器中。再將空氣壓力泵連接在注射器上，通過調(diào)節(jié)壓力使溶液以1滴/s的速度過柱，待溶液滴完空氣進(jìn)入時，加入20 mL超純水，以1滴/s淋洗免疫親和柱，棄去流出液，直至抽干小柱。向小柱中準(zhǔn)確加入2 mL甲醇以1滴/s的流速進(jìn)行洗脫，收集全部洗脫液于玻璃刻度試管中，于50 ℃下氮氣吹干。用流動相溶解殘渣，并定容至1 mL，過濾膜后上機(jī)測定。

1.2.3 液相色譜條件

色譜柱：C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：40 ℃；流動相：甲醇+乙腈（50+50）∶水（32∶68），等度洗脫；流速：1.0 mL·min-1；熒光檢測器：激發(fā)與發(fā)射波長分別為360 nm、440 nm；進(jìn)樣量：50 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度分析

2.1.1 測量數(shù)學(xué)模型

玉米試樣中黃曲霉毒素B1含量的計算公式為

式中：X為玉米試樣中黃曲霉毒素B1含量，μg·kg-1；c為待測試液中黃曲霉毒素B1濃度，ng·mL-1；V1為提取液體積，mL；V2為過柱時分取樣液體積，mL；V3為最終待測液定容體積，mL；m為稱樣量，g；1 000為單位換算系數(shù)。

2.1.2 不確定度來源

根據(jù)樣品處理過程與測量數(shù)學(xué)模型，該方法的測量不確定度來源為稱樣量、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、樣液移取定容體積、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合及測量重復(fù)性引入的不確定度。

2.2 測量不確定度評定

2.2.1 稱樣量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

使用ME3002E電子天平稱取5.00 g試樣，由檢定證書查得示值誤差為0.02 g，假設(shè)按照均勻分布，其引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為 g，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

甲醇中黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液編號為90107s，濃度為2 μg·mL-1，由標(biāo)準(zhǔn)證書可知相對擴(kuò)展不確定度為Urel=8%（k=2），因此，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

（1）配制標(biāo)準(zhǔn)使用溶液時，使用0.5 mL分度吸量管（A級）吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用10 mL單標(biāo)線容量瓶（A級）定容。根據(jù)《常用玻璃量器》（JJG 196—2006）[5]，兩種玻璃量器的容量允差分別為±0.005 mL、±0.020 mL，玻璃儀器允差引入的不確定度計算公式為；假設(shè)實驗溫差為±5 ℃，水膨脹系數(shù)為2.10×10-4 ℃-1，溫差變化引入的不確定度計算公式為，玻璃量器引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。兩種玻璃量器引入的不確定度結(jié)果見表1，該過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。

（2）配制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液時，吸取0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL和3.0 mL標(biāo)準(zhǔn)中間液分別使用0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL和5 mL分度吸量管（A級），根據(jù)JJG 196—2006，6個玻璃量器的容量允差分別為±0.002 mL、±0.003 mL、±0.005 mL、±0.008 mL、±0.012 mL和±0.025 mL，定容使用10 mL單標(biāo)線容量瓶（A級）6次，玻璃儀器允差與溫差引入的不確定度計算公式同上，結(jié)果見表1，該過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

綜上，標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.4 樣液移取定容體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

移取提取液20 mL甲醇-水溶液（70+30）使用20 mL單標(biāo)線吸量管（A級），移取4 mL分取樣液使用5 mL分度吸量管（A級），最終待測液定容使用1 mL單標(biāo)線容量瓶（A級），根據(jù)JJG 196—2006，3種玻璃量器的容量允差分別為±0.030 mL、±0.025 mL、±0.010 mL，玻璃儀器允差與溫差引入的不確定度計算公式2.2.3，結(jié)果見表1，該過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度

將配制的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行測定，以黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（c）為橫坐標(biāo)，相對應(yīng)測得的色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)，測試數(shù)據(jù)見表2，根據(jù)表2中數(shù)據(jù)，基于最小二乘法擬合線性曲線，得到回歸方程為y=14 082c-1 107.5，b=14 082，a=-1 107.5。由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為，其中，n為標(biāo)準(zhǔn)系列溶液測試次數(shù)，n=6；由上述公式計算得，sR=408.2815。P為玉米樣品測量次數(shù)，P=6，玉米樣品中黃曲霉毒素B1含量的平均值為7.855 μg·kg-1，代入2.1.1中數(shù)學(xué)模型計算得c=7.855 ng·mL-1，c=11.333 ng·mL-1，，，由此計算得標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u（q）=0.017 19 ng·mL-1，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。

2.2.6 測量重復(fù)性引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

對某批次抽檢的玉米樣品在期間精密度條件下進(jìn)行6次測量，結(jié)果分別為8.08 μg·kg-1、7.94 μg·kg-1、7.59 μg·kg-1、7.95 μg·kg-1、7.85 μg·kg-1和7.72 μg·kg-1，測量平均值X為7.855 μg·kg-1，標(biāo)準(zhǔn)偏差s為0.176 3，因此，測量重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。

2.3 合成與擴(kuò)展不確定度評定

2.3.1 合成不確定度

黃曲霉毒素B1測定過程中的6個相對不確定度分量互不相關(guān)，根據(jù)方和根公式計算合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

合成不確定度為

u（X）=urel（X）×X=0.043 4×7.855=0.341 μg·kg-1

2.3.2 擴(kuò)展不確定度

取包含因子k=2，置信水平為95%時，黃曲霉毒素B1測定過程中的測量擴(kuò)展不確定度為U=k×u（X）=2×0.341=0.682 μg·kg-1。

2.4 測量不確定度結(jié)果

HPLC-柱后光化學(xué)衍生法測定玉米中黃曲霉毒素B1含量為（7.86±0.68）μg·kg-1，k=2。

3 結(jié)論

通過分析HPLC-柱后光化學(xué)衍生法測定玉米中黃曲霉毒素B1含量的過程，評定影響測量結(jié)果的各個不確定度分量發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制與測量重復(fù)性引入的不確定度對測量結(jié)果的影響較大，樣液移取定容體積、稱樣量及標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合對測量結(jié)果的影響較小。因此，在檢測過程中可以通過使用精度高且允差小的玻璃量器配制標(biāo)準(zhǔn)溶液、選用不確定度小的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、適當(dāng)增加樣品測試次數(shù)等手段，降低各種不確定度因素對測量結(jié)果的影響，提升測量結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度。

參考文獻(xiàn)

[1]尹安胤.免疫親和柱凈化-HPLC光化學(xué)柱后衍生法測定玉米中黃曲霉毒素B1的含量[J].現(xiàn)代食品，2021（15）：193-196.

[2]雷欣宇，仲伶俐，李曦，等.UPLC-光化學(xué)衍生法測定糧油中黃曲霉毒素[J].糧食與油脂，2022，35（10）：150-153.

[3]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會，國家食品藥品監(jiān)督管理總局.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定：GB 5009.22—2016[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

[4]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.測量不確定度評定與表示：JJF 1059.1—2012[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2012.

[5]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.常用玻璃量器：JJG 196—2006[S].北京：中國計量出版社，2006.

作者簡介：閻安婷（1984—），女，山西長治人，碩士，工程師。研究方向：食品檢驗檢測。