摘 要：【目的】對雜交構(gòu)樹UGDH基因家族成員進行克隆、生物信息學及表達特性分析?！痉椒ā坷秒s交構(gòu)樹（Broussonetia kazinoki×Broussonetia papyifera）的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲取UGDH基因序列，分別命名為BpUGDH1、BpUGDH2和BpUGDH4，設(shè)計引物克隆雜交構(gòu)樹的UGDH基因家族成員（其中BpUGDH3在前期研究中已克?。捎肊xPASy、TMHMMServerv2.0、Swiss-ModeL、SOPMA、MEGA11.0等軟件進行了生物信息學分析；采用qRT-PCR對不同器官組織進行基因表達差異分析?！窘Y(jié)果】通過克隆獲得了雜交構(gòu)樹UGDH1、UGDH2、UGDH3和UGDH4基因全長序列分別為1 895、927、1 658和481 bp，編碼480、294、480和131個氨基酸；其中BpUGDH2為疏水性蛋白，其余為親水性蛋白。BpUGDH基因均不含信號肽；均無跨膜結(jié)構(gòu)域，蛋白均存在PLNO2353 superfamily一個超家族保守結(jié)構(gòu)域。多序列比對得出BpUGDH1、BpUGDH2、BpUGDH3、BpUGDH4蛋白序列之間相似性為68.39%；系統(tǒng)進化樹BpUGDH1同大豆UGDH2聚為一類；BpUGDH2和大豆UGDH4親緣關(guān)系較近，同時BpUGDH2和BpUGDH4聚為一類，BpUGDH4和水稻UGDH1、水稻UGDH2以及玉米UGDH2親緣關(guān)系近；BpUGDH3和擬南芥UGDH3有較近的親緣關(guān)系。蛋白二級結(jié)構(gòu)分析表明BpUGDH1、BpUGDH2、BpUGD4均以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主，BpUGDH3則以無規(guī)則卷曲為主，占39.79%。qRT-PCR結(jié)果顯示BpUGDH1在葉的表達量最高；BpUGDH2在根的表達量最高；BpUGDH3在莖中的表達量最高，BpUGDH4在莖的表達量最高，該基因家族均在莖中表達?！窘Y(jié)論】本研究克隆得到了雜交構(gòu)樹UGDH1、UGDH2、UGDH4基因并與吉仁花克隆所得的雜交構(gòu)樹UGDH3基因共同進行生物信息學分析，為研究探討各基因之間在調(diào)控半纖維素和果膠含量及二者相互作用奠定了一定理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：雜交構(gòu)樹；UGDH基因；生物信息學分析；表達分析

中圖分類號：S794.9 文獻標志碼：A 文章編號：1673-923X（2024）11-0120-13

基金項目：內(nèi)蒙古自治區(qū)地區(qū)科學基金項目（32360402）；內(nèi)蒙古自治區(qū)教育廳高等學?？茖W研究項目（NJZY22501）；內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學人才引進科研啟動項目（NDYB2020-14）。

Bioinformatics analysis and expression characteristics analysis of UGDH gene family in hybrid Broussonetia kazinoki×Broussonetia papyifera

GAO Na， LYU Xinfei， LIU Jiaxin， BAI Yu’e， JI Renhua

（College of Forestry， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot 010019， Inner Mongolia， China）

Abstract：【Objective】Cloning， bioinformatics and expression analysis of UGDH gene family members in Broussonetia kazinoki×Broussonetia papyifera.【Method】The UGDH gene sequences were obtained by using the transcriptome data of B. kazinoki×B. papyifera.， named BpUGDH1， BpUGDH2 and BpUGDH4， respectively. The primers were designed to clone the UGDH gene family members of the hybrid B. papyrifera （BpUGDH3 has been cloned in the previous study）. Bioinformatics analysis was performed using ExPASy， MHMMServerv2.0， Swiss-ModelL， SOPMA， MEGA11.0 and other software. The gene expression differences of different organs and tissues were analyzed by qRT-PCR.【Result】The full-length sequences of BpUGDH1， BpUGDH2， BpUGDH3 and BpUGDH4 were 1 895， 927， 1 658 and 481 bp， respectively， encoding 480， 249， 480 and 131 amino acids. BpUGDH2 was a hydrophobic protein， and the rest was a hydrophilic protein. BpUGDH gene did not contain signal peptide. There is no transmembrane domain， and the proteins all had a conserved domain of the PLNO2353 superfamily. Multiple sequence alignment showed that the similarity between BpUGDH1， BpUGDH2， BpUGDH3 and BpUGDH4 protein sequences was 68.39 %. The phylogenetic tree BpUGDH1 was clustered with soybean UGDH2. BpUGDH2 was closely related to soybean UGDH4， and BpUGDH2 and BpUGDH4 were clustered together. BpUGDH4 was closely related to rice UGDH1， rice UGDH2 and maize UGDH2. BpUGDH3 had a close relationship with Arabidopsis. Protein secondary structure analysis showed that BpUGDH1， BpUGDH2 and BpUGD4 were dominated by alpha helix and random coil， while BpUGDH3 was dominated by random coil， accounting for 39.79%. The results of qRT-PCR showed that the expression of BpUGDH1 was the highest in leaves. The expression of BpUGDH2 was the highest in root. The expression level of BpUGDH3 was the highest in the stem， and the expression level of BpUGDH4 was the highest in the stem.【Conclusion】In this study， the UGDH1， UGDH2 and UGDH4 genes of hybrid B. papyrifera were cloned and analyzed by bioinformatics with the UGDH3 gene of hybrid B. papyrifera. It laid a theoretical foundation for the study of the regulation of hemicellulose and pectin content and the interaction between them.

Keywords： Broussonetia papyrifera； UGDH gene； bioinformatics analysis； expression analysis

構(gòu)樹（Broussonetia papyrifera）屬于桑科（Moraceae）構(gòu)屬（Broussonetia）多年生喬木，又稱楮桃，是一種具有重要價值的多功能樹種。構(gòu)樹作為本土植物它具有豐富的種質(zhì)資源，根據(jù)它的各種特征已經(jīng)開展了全面創(chuàng)新利用工作。為了進一步了解和利用構(gòu)樹資源，更好地開發(fā)和推廣構(gòu)樹，中國科學院植物研究所利用野生構(gòu)（Broussonetia papyifera）為父本、小構(gòu)樹（Broussonmetia kazinoki）為母本，通過現(xiàn)代生物技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)雜交育種方法培育出具有突出抗逆性的速生和豐產(chǎn)樹種—雜交構(gòu)樹（Broussonetia kazinoki×Broussonetia papyifera）。雜交構(gòu)樹還是我國重要的經(jīng)濟林木之一，其樹皮所含有的纖維品質(zhì)優(yōu)良，可廣泛用于造紙及創(chuàng)制新型紡紗材料。

現(xiàn)在已有的研究中構(gòu)樹在繁苗、育苗、新品種繁育等方面取得顯著成績，王鳳英等[1]選育出構(gòu)樹新品種—黃色葉構(gòu)樹；Li等[2]通過農(nóng)桿菌介導的構(gòu)樹葉盤轉(zhuǎn)化法獲得44株抗性植株，建立了構(gòu)樹的高效轉(zhuǎn)基因體系；李巖等[3]利用RT-PCR技術(shù)，從構(gòu)樹中克隆出一條在植物中廣泛存在的內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子-Actin作為構(gòu)樹內(nèi)參基因，為進一步開展構(gòu)樹基因工程研究打下了良好的基礎(chǔ)；雜交構(gòu)樹具有優(yōu)異生物活性的生物固氮菌種，研發(fā)多功能生物固氮菌劑，為提高我國西北半干旱區(qū)森林生態(tài)系統(tǒng)的生產(chǎn)力奠定基礎(chǔ)；謝曉陽等[4]通過對已有的雜交構(gòu)樹組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化技術(shù)的集成和優(yōu)化，首次建立了雜交構(gòu)樹的組織轉(zhuǎn)化與篩選技術(shù)，以及雜交構(gòu)樹粗蛋白含量的先期轉(zhuǎn)化技術(shù)，為進一步開展雜交構(gòu)樹的遺傳轉(zhuǎn)化研究打下堅實的基礎(chǔ)。

細胞壁是由多種生物大分子構(gòu)成的復雜結(jié)構(gòu)，它在植物細胞的生命活動中起著至關(guān)重要的作用，1）維持細胞形態(tài)：細胞壁給細胞提供了形態(tài)支持，使細胞能夠保持特定的形狀和結(jié)構(gòu)。2）調(diào)節(jié)細胞生長和分化：細胞壁通過參與細胞的生長和分化過程，調(diào)控細胞的發(fā)育和功能。3）參與細胞間信號轉(zhuǎn)導：細胞壁中的成分可以作為信號分子，參與細胞間的信號傳遞和調(diào)控。其中，果膠質(zhì)是細胞壁的重要組成部分，其來源于UDP-葡萄糖醛酸的單體。此外，細胞壁中還包含有大量的多糖、蛋白質(zhì)、酶類和脂肪酸等分子[5]。這些組分協(xié)同工作，維持了細胞壁的穩(wěn)定性和功能。在科學研究中，對細胞壁的深入理解對于提高農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，以及開發(fā)新的生物材料等都具有重要的意義。細胞壁中的多糖主要是纖維素、半纖維素和果膠類，它們是由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸等聚合而成，UDP-葡萄糖脫氫酶（UGDH）是參與高等植物細胞壁形成的重要活性，該酶結(jié)合了醇和醛脫氫酶的功能[6]，并利用由蔗糖合成酶或UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase）[7-8]產(chǎn)生的UDP-葡萄糖形成UDP-葡萄糖醛酸。后者隨后轉(zhuǎn)化為半乳糖醛酸的UDP衍生物，然后轉(zhuǎn)化為木糖和阿拉伯糖的衍生物，半纖維素和果膠形成的前體。UDP-葡糖醛酸可以將葡萄糖-1-P轉(zhuǎn)化為肌醇，然后氧化為葡糖醛酸，并通過焦磷酸解反應(yīng)形成UDP-葡糖醛酸[32]。在高等植物中，多糖代謝在調(diào)控纖維素、半纖素、果膠、胼胝質(zhì)等細胞壁物質(zhì)的形成、營養(yǎng)器官的生長及生殖器官的發(fā)育過程發(fā)揮重要作用[9]。

1996年首次在植物（大豆）中克隆出UGDH基因，隨后諸多物種的UGDH基因序列便相繼克隆問世，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）[10]、苧麻（Boehmeria nivea）[11]、海島棉（Gossypium barbadense）[12]、玉米（Zea mays）[13]、桉樹（Eucalyptus robusta）[14]、興安落葉松（Larix gmelinii）[15]等植物中均被鑒定。雖現(xiàn)有的研究已經(jīng)得到不少植物的UGDH序列并進行了一些初步的分析，但對UGDH家族成員的研究資料較少。除已證實的人類UGDH基因為單基因外[16]，UGDH通常以家族的形式存在。擬南芥中曾有4個UGDH成員，后通過酶促反應(yīng)動力學檢驗及報告基因表達分析把AtUGDH1剔除，并發(fā)現(xiàn)在UDP-Glc催化為UDPGlcA過程中AtUGDH2、AtUGDH3成員是主要貢獻酶[17]。

關(guān)于植物UGDH的大多數(shù)論文要么忽略了亞型的存在，要么同時對幾種亞型進行了組合分析。因此，本研究對雜交構(gòu)樹UGDH基因家族剩余3個基因進行克隆，并結(jié)合先前吉仁花[9]克隆的BpUGDH3，進行生物信息學分析以及采用qRTPCR技術(shù)研究雜交構(gòu)樹各部位該基因的特異性表達情況，試著尋找雜交構(gòu)樹中UDP-Glc向UDPGlcA轉(zhuǎn)化的主要貢獻酶，為進一步探討UGDH基因提高雜交構(gòu)樹耐寒性的分子機制，提高雜交構(gòu)樹的耐寒性，使其適應(yīng)北方低溫氣候條件奠定理論和實踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料

雜交構(gòu)樹：將雜交構(gòu)樹插條剪成長度為35 cm，扦插在1∶1比例的土壤和蛭石混勻的花盆中，并從4周植物幼嫩葉片中提取RNA。

1.1.2 試劑材料

TIANGEN的植物總RNA提取試劑盒（RNAprep Pure Plant Plus Ki），TransScript？FirstStrand cDNA Synthesis Super Mix Reverse Transcription Kit（TransGeneBiotech）試劑盒，2×Taq PCR SuperMix（+dye），Ex-Taq，T載連接試劑盒（pMDTM19-T Vector Cloning Kit），Trans1-T1 Phage Resistant化學感受態(tài)細胞，生工瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，快速質(zhì)粒小提試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA提取和cDNA合成

剪取雜交構(gòu)樹幼苗的根、莖、葉組織分別于液氮中迅速研磨成粉末，使用TIANGEN植物組織RNA快速提取試劑盒提取總RNA。使用Nano-500檢測RNA的純度及濃度，使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量及完整性。以雜交構(gòu)樹根、莖、葉總RNA為模板，Oligo（dT）為引物，采用TransScript？First-Strand cDNA Synthesis Super Mix Reverse TranscriptionKit（TransGeneBiotech）試劑盒反轉(zhuǎn)錄生成第一鏈cDNA。

1.2.2 BpUGDH1、BpUGDH2、BpUGDH3、BpUGDH4基因全長cDNA的克隆

根據(jù)本課題組前期對雜交構(gòu)樹進行的轉(zhuǎn)錄組深度測序數(shù)據(jù)確定BpUGDH1、BpUGDH2、BpUGDH4基因的編碼全長序列，使用primerprimer5設(shè)計引物，引物序列見表1。采用20 μL的PCR擴增體系，包括模板cDNA、Ex-Taq酶、上游引物（10 μmol·L-1）、下游引物（10 μmol·L-1）、無核酸酶水，分別是1.00、10.0、0.50、0.50、8.00 μL。BpUGDH3采用25 μL的PCR擴增體系[9]，PCR反應(yīng)程序分別為94 ℃3 min、94 ℃30 s、57 ℃（55、59、53.6 ℃）30 s、35循環(huán)、72 ℃2 min（1、2、1 min）、72 ℃10 min、4 ℃保存。

采用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結(jié)果，TAKARA瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行膠回收純化，具體方法參照試劑盒說明書。將回收的DNA片段連接到pMD19-T載體詳情見說明書。轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)Trans1-T1，在含有50 mg·L-1Kan的LB固體培養(yǎng)基上做抗性篩選，挑取陽性單克隆菌落搖菌，進行菌落PCR，將條帶正確的菌液送擎科生物技術(shù)公司測序。

1.2.3 生物信息學分析

通過NCBI的ORF在線軟件分析BpUGDH基因的開放閱讀框；利用BioEdit軟件繪制BpUGDH基因的核苷酸及其編碼的氨基酸圖；使用ExPASyProtParam對BpUGDH基因家族氨基酸序列蛋白理化性質(zhì)進行了分析預測；采用ExPASy-ProtScale對蛋白的疏水性/親水性進行預測分析；蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預測是使用在線軟件TMHMMServerv2.0做分析；利用NCBI保守域數(shù)據(jù)庫（CDD）進行蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預測；采用NetPhos3.1Server軟件預測蛋白磷酸化位點；使用在線軟件Signal4.1進行信號肽的預測；利用SOPMA和Swiss-ModeL對氨基酸序列進行二級結(jié)構(gòu)預測和三級結(jié)構(gòu)預測；使用DNAMAN做多序列比對；采用MEGA11.0軟件中鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；利用在線亞細胞定位軟件Cell-Ploc2.0進行亞細胞定位。

1.2.4 BpUGDH1、BpUGDH2、BpUGDH3基因組織特異性的實時定量表達分析

為分析BpUGDH1、BpUGDH2、BpUGDH3和BpUGDH4基因功能，本研究利用定量PCR分析BpUGDH1、BpUGDH2、BpUGDH3和BpUGDH4基因在雜交構(gòu)樹中不同組織部位的表達差異。從扦插苗中剪取嫩葉、莖段、根立即放入液氮中，-80 ℃保存，參考試劑盒說明書提取葉片總RNA、莖段總RNA、根系總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，選取光葉褚Bpactin作為內(nèi)參基因[3]。使用TAKARA TB Green？ Premix Ex Taq？ II （Tli RNaseH Plus）試劑盒進行實時熒光定量PCR實驗。采用PreimrPreimr 5設(shè)計BpUGDH基因?qū)崟r熒光定量引物見表1，內(nèi)參基因利用光葉褚肌動蛋白基因Bpactin的特異性引物BpactinF和BpactinR。以cDNA為模板進行熒光定量PCR檢測，BpUGDH1、2、4反應(yīng)體系為：TB 10.0 μL、F（樣） 1.00 μL、R（樣） 1.00 μL、cDNA（根、莖、葉） 1.00 μL、ddH2O 7.00 μL；BpUGDH3反應(yīng)體系為：2xTransScript ？Tip Green qPCR SuperMix10.0 μL、F（樣） 0.40 μL、R（樣） 0.40 μL、cDNA（根、莖、葉） 2.00 μL、ddH2O 7.20 μL。反應(yīng)條件：BpUGDH1、BpUGDH2、BpUGDH4為95 ℃2 min；95 ℃10 s，57、55、56.3 ℃20 s，72 ℃single 20 s，45循環(huán)；95 ℃20 s，65 ℃20 s，95 ℃ continuous 1 min； 40 ℃2 min；BpUGDH3反應(yīng)程序為：95 ℃2 min；95℃10 s，55 ℃20 s，72 ℃20 s，45循環(huán)；95 ℃20 s，65 ℃ l min，95 ℃ continuous；40 ℃2 min，各組織均含有3個生物學重復，將得到的數(shù)據(jù)用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交構(gòu)樹RNA的獲取

雜交構(gòu)樹根、莖、葉總RNA的1.2%非變性瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果呈現(xiàn)清晰的18S和28S條帶，見圖1。紫外-可見光分光光度計檢測結(jié)果顯示A260/A280處于1.8～2.0，表明總RNA質(zhì)量合格，可用于全長擴增及Real-time PCR分析。

2.2 BpUGDH1、BpUGDH2、BpUGDH3、BpUGDH4基因全長cDNA的獲得

以逆轉(zhuǎn)錄獲得的BpUGDH1、BpUGDH2、BpUGDH3、BpUGDH4葉片的cDNA為模板分別進行PCR擴增，克隆獲得了BpUGDH1長度約1 895 bp的特異性條帶（圖2a），BpUGDH2長度約為927 bp的特異性條帶（圖2b）；BpUGDH3長度約為1 658 bp（圖2c）[9]；BpUGDH4長度約為481 bp（圖2d）的特異性條帶與目的基因長度一致，擴增結(jié)果見（圖2）。

2.3 BpUGDH1、BpUGDH2、BpUGDH3、BpUGDH4 cDNA及氨基酸序列的BLAST分析

以雜交構(gòu)樹葉片cDNA為模板進行PCR擴增，克隆得到BpUGDH1、BpUGDH2、BpUGDH3和BpUGDH4基因編碼區(qū)全長序列長分別為189 5、972、1 658和481 bp，編碼氨基酸殘基分別為480、294、480和131 aa（圖3）。

2.4 BpUGDH1、BpUGDH2、BpUGDH3、BpUGDH4蛋白理化性質(zhì)分析及親水性/疏水性分析

使用ExPA SyProtParam工具對BpUGDH1、BpUGDH2、BpUGDH3、BpUGDH4的cDNA編碼的氨基酸序列進行理化性質(zhì)分析，結(jié)果表明：

BpUGDH1蛋白分子式為C2370H3751N629O696S22；分子量為52 897.97；理論等電點為6.67；蛋白不穩(wěn)定系數(shù)（Ⅱ）21.41（<40），表明BpUGDH1是結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的蛋白，有56個負電荷氨基酸殘基，有55個正電荷氨基酸殘基，脂肪系數(shù)為92.62，氨基酸編碼長度為480，脂肪系數(shù)為92.62。

BpUGDH2蛋白分子式為C1397H2248N384O424S12；分子量為31 592.26，理論等電點為5.80，蛋白不穩(wěn)定系數(shù)（Ⅱ）25.95（<40），表明BpUGDH2是結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的蛋白，有33個負電荷氨基酸殘基，有29個正電荷氨基酸殘基，氨基酸編碼長度為294，脂肪系數(shù)為100.51。

BpUGDH3蛋白分子式為C2378H3760N626O705S20；分子量為53 040.99理論等電點為5.89；蛋白不穩(wěn)定系數(shù)（Ⅱ）26.64（<40），表明BpUGDH3是結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的蛋白，有59個負電荷氨基酸殘基，有55個正電荷氨基酸殘基，氨基酸編碼長度為480，脂肪系數(shù)為92.42。

BpUGDH4蛋白分子式為C671H1040N176O196S5；分子量為14 869.00；理論等電點為6.82；蛋白不穩(wěn)定系數(shù)（Ⅱ）21.88（<40），表明BpUGDH4是結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的蛋白，有19個負電荷氨基酸殘基，有19個正電荷氨基酸殘基，氨基酸編碼長度為131，脂肪系數(shù)為74.50。

利用Expasy protscale在線預測BpUGDH1、BpUGDH2、BpUGDH3和BpUGDH4蛋白質(zhì)的疏水曲線，BpUGDH1蛋白第33個氨基酸處，疏水性最強，最高值為2.000，在第339個氨基酸處的最低值為-2.733，親水性最強，總平均疏水指數(shù)（GRAVY）為-0.055（<0），該蛋白為親水性蛋白；BpUGDH2蛋白第22個氨基酸處，疏水性最強，最高值為2.256；在第11個氨基酸處的最低值為-2.644親水性最強，總平均親水系數(shù)（GRAVY）0.045（>0）該蛋白為疏水性蛋白；BpUGDH3蛋白第33個氨基酸處，疏水性最強，最高值為2.000，在第339個氨基酸處的最低值為-2.733，親水性最強，總平均疏水指數(shù)（GRAVY）為-0.085（<0），該蛋白為親水性蛋白；BpUGDH4蛋白第14個氨基酸處，疏水性最強，最高值為1.967，在第22個氨基酸處的最低值為-2.733，親水性最強，總平均親水系數(shù)（GRAVY）-0.475（<0），該蛋白為親水性蛋白（圖4）。

2.5 BpUGDH1、BpUGDH2、BpUGDH3、BpUGDH4跨膜結(jié)構(gòu)域分析

使用TMHMMServerv2.0分別預測BpUGDH1、BpUGDH2、BpUGDH4跨膜結(jié)構(gòu)域，見圖5。預測結(jié)果表明BpUGDH1、BpUGDH2和BpUGDH4不含跨膜結(jié)構(gòu)域且都在膜外，BpUGDH3預測結(jié)果也不含有跨膜結(jié)構(gòu)域[9]。

2.6 BpUGDH1、BpUGDH2、BpUGDH3、BpUGDH4保守結(jié)構(gòu)域預測

利用NCBI中的CD Search工具進行保守結(jié)構(gòu)域預測，見圖6。結(jié)果顯示三個蛋白均有PLNO2353superfamily；BpUGDH1蛋白有3個高度保守的結(jié)構(gòu)功能區(qū)域，分屬于UDP—葡萄糖/ GDP—甘露糖脫氫酶家族的3個典型區(qū)域，分別為N端NAD結(jié)合區(qū)UDPG_MGDP_dh_N、中間部分UDPG_MGDP_dh和C端UDP結(jié)合 UDPG_ MGDP dh_Cdh_C；BpUGDH2蛋白具有一個特定匹配為UDPG_MGDP_dh_N；BpUGDH4蛋白具有兩個特定匹配均為UDPG_MGDP dh_C，先前[9]研究BpUGDH3具有一個保守結(jié)構(gòu)域--UDPG_ MGDP_dh superfamily，由此推測BpUGDH編碼的蛋白質(zhì)是脫氫酶家族的成員。

2.7 蛋白磷酸化位點和信號肽預測

采用NetPhos3.1Server軟件預測蛋白磷酸化位點結(jié)果顯示（圖7），當潛在磷酸化位點的閾值為0.5時BpUGDH1、BpUGDH2、BpUGDH3和BpUGDH4分別具有18、14、16和5個絲氨酸（Ser）位點；12、8、13和4個蘇氨酸（Thr）位點；5個、2個、9個和1個酪氨酸（Tyr）位點。

使用SignalP-4.0Server軟件對BpUGDH1、BpUGDH2、BpUGDH3、BpUGDH4進行信號肽預測，見圖8。結(jié)果表明BpUGDH1、BpUGDH2、 BpUGDH3[9]，BpUGDH4蛋白中均不含有信號肽序列。

2.8 BpUGDH1、BpUGDH2、BpUGDH3、BpUGDH4蛋白結(jié)構(gòu)分析

使用SOPMA在線軟件預測BpUGDH1、BpUGDH2、BpUGDH4蛋白的二級結(jié)構(gòu)，見圖10。結(jié)果顯示三條氨基酸序列均α螺旋和無規(guī)則卷曲為主要組成部分，BpUGDH3則以無規(guī)則卷曲為主，占39.79%，α螺旋次之，占31.67%且無β-轉(zhuǎn)角（表2，圖9）。

使用Swiss-Model在線工具預測BpUGDH1、BpUGDH2、BpUGDH3、BpUGDH4蛋白三級結(jié)構(gòu)模型，分別是由一個（PDB數(shù)據(jù)庫ID）SMTLID號為2o3j.2.A，UDP-葡萄糖6-脫氫酶秀麗隱桿線蟲UDP-葡萄糖脫氫酶的結(jié)構(gòu)為模版建立，一致性57.45%、63.38%、58.87%和49.57%，GMQE值為0.83，0.89，0.84和0.75；序列相似性為0.48，0.51、0.47和0.43（圖10）

2.9 雜交構(gòu)樹UGDH序列同源性、進化樹分析及亞細胞定預測

1）利用DNAMAN軟件進行多序列比對發(fā)現(xiàn)，BpUGDH1、BpUGDH2、BpUGDH3、BpUGDH4蛋白序列之間相似性為：68.39%（圖11）

2）通過phytozome獲取擬南芥、大豆、玉米UGDH基因家族的氨基酸序列，NCBI中獲取水稻UGDH基因家族和毛果楊UGDH基因家族的氨基酸序列，采用MEGA11.0軟件中的neighbor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。結(jié)果顯示BpUGDH1同大豆UGDH2聚為一類；BpUGDH2和大豆UGDH4親緣關(guān)系較近，同時BpUGDH2和BpUGDH4聚為一類，BpUGDH4和水稻UGDH1、水稻UGDH2以及玉米UGDH2親緣關(guān)系近；BpUGDH3和擬南芥UGDH3有較近的親緣關(guān)系（圖12）。

3）為分析雜交構(gòu)樹BpUGDH1、BpUGDH2、BpUGDH3和BpUGDH4的基因功能，利用CellPloc2.0 對雜交構(gòu)樹BpUGDH基因進行亞細胞定位預測，結(jié)果證明BpUGDH基因均定位于葉綠體，與BpUGDH3分析結(jié)果一致[9]。

2.10 BpUGDH1、BpUGDH2、、BpUGDH3和BpUGDH4基因的表達分析

定量PCR分析了該基因在雜交構(gòu)樹中根、莖和葉部位的表達差異（圖13）。qRT-PCR結(jié)果顯示BpUGDH1在葉的表達量最高，根的表達量最低；BpUGDH2在根的表達量最高，莖的表達量最低；BpUGDH3在莖中的表達量最高，葉片次之，BpUGDH4同BpUGDH3一致，莖的表達量最高，葉片次之，該基因家族在莖中穩(wěn)定表達，對各基因進行了組間顯著性差異分析表明各基因之間表達量較穩(wěn)定。

3 討 論

尿甘二磷酸葡萄糖脫氫酶（UDP-glucose dehydrogenas）普遍存在于生物體內(nèi)，是半纖維素和果膠生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，它催化UDPGlC生成多糖合成過程中的關(guān)鍵前體物質(zhì)一UDPGIcA，半纖維素和果膠都是細胞壁的關(guān)鍵組分，提供了增強和粘連細胞壁結(jié)構(gòu)的基質(zhì)[16]。多達60%的細胞壁總多糖含量直接或間接衍生自UDPGIcA。植物中，UDP-GlcA繼續(xù)糖化得到UDP-半乳糖醛酸、UDP-木糖和UDP-芹菜塘等多種核苷糖，進而參與半纖維素及果膠的生物合成[18]。在高等植物中纖維素、半纖素、果膠、胼胝質(zhì)等細胞壁物質(zhì)的形成、營養(yǎng)器官的生長及生殖器官的發(fā)育過程被多糖代謝所調(diào)控，并具有重要作用。先前的研究表明，UDP-Glc參與細胞壁的生物合成并影響細胞壁結(jié)構(gòu)，而UGDH被鑒定為樹木形成層分生組織發(fā)育中木質(zhì)部細胞的標記酶[19]，細胞壁按各類成分的含量不盡相同，其部位所發(fā)揮的功能也有所差異[20]?，F(xiàn)有擬南芥[10]、苧麻[11]、海島棉[12]、玉米[13]、桉樹[14]、興安落葉松[15]、雜交構(gòu)樹[9]等植物的UGDH序列被克隆同時進行了初步的分析，但對UGDH家族成員的研究資料較少。UGDH通常以家族的形式存在，基因家族是指來源于同一祖先，通過基因復制產(chǎn)生一個基因的兩個或多個副本而構(gòu)成的一組基因。

3.1 UGDH基因的表達模式分析

研究表明UGDH基因在不同的植物中特異性表達也不同，興安落葉松（Larix gmelinii）的UGDH基因表達量分析結(jié)果顯示，LgUGDHI、LgUGDH2在興安落葉松的針葉、莖段、根中均穩(wěn)定表達且莖中的表達最高，根中的表達量最低[18，21]；苧麻（Abutilon theophrasti） UDPGDH基因在根莖皮葉中均有表達，在莖中表達量最高[11]；在大豆（Glycine max）的根尖和側(cè)根UGD 基因表達量最高，胚軸中表達次之，而在下胚軸和葉中表達量最低[22-23]；通對不同年齡段桉樹（Eucalyptus robusta）的韌皮部，根，莖，葉進行半定量分析結(jié)果顯示3年生的表達量最高，6月齡的表達量最少[9，14]；龍眼（Dimocarpus longan）UGD在植物不同生長發(fā)育時期，同一器官UGD基因表達量有所變化，在營養(yǎng)生長階段，龍眼的根和莖UGD基因表達量顯著高于龍眼其他部位[24]；而在生殖發(fā)育階段，主要在花藥和種子中表達量較高[23，24]；在3日齡和5日齡擬南芥中AtUGDH基因在根中占主要表達[17]；在毛竹（Phyllostachys heterocycla）[25]中，77%的PeUGDH基因在莖中高水平表達，其次是葉，在根中最低；PtUGDH1-4基因在毛楊（P. trichocarpa）的所有組織中都有表達，其中PtUGDH3和PtUGDH4在莖中的表達量最高[26]；在雜交構(gòu)樹BpUGDH3基因表達模式結(jié)果顯示BpUGDH基因在根莖葉中均穩(wěn)定表達[9]，本實驗分析了BpUGDH1、BpUGDH2、BpUGDH3和BpUGDH4在雜交構(gòu)樹不同組織中的表達量，結(jié)果為BpUGDH1在根莖葉中均穩(wěn)定表達，BpUGDH2在莖、葉的表達量較一致，BpUGDH3在莖中的表達量最高，葉片次之[9]，BpUGDH4 在莖中的表達量最高，總結(jié)得出該基因家族均在莖中表達。構(gòu)樹纖維縱向呈中間略粗兩端尖細的封閉的管狀，表面有少量的凹槽和細小竹節(jié)紋少量纖維還有不明顯的轉(zhuǎn)曲，胞壁厚度比較均勻，沿徑向有少許輻射紋。構(gòu)樹葉含干物質(zhì)85.85%，粗蛋白質(zhì)21.15%，粗脂肪3.58%，雜交構(gòu)樹莖粗纖維10.07%，可以促進大量細胞壁的增厚和新細胞壁的形成。核苷糖是細胞壁多糖合成的活化底物，核苷糖的合成由一整套酶完成，尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶（UDPGDH）在細胞壁核苷糖合成、纖維素及半纖維素合成過程中起到重要作用。高等植物UGDH氨基酸序列的高度同一性，表明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的嚴格同一性，這些高度保守的結(jié)構(gòu)域可能是UGDH基因參與多糖代謝的主要功能區(qū)域。研究表明植物中存在2條UDP-GlcA路徑，1）尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶（UGDH）通過煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）連接的尿苷二磷酸葡萄糖（UDPGlc）氧化成尿苷二磷酸葡萄糖醛酸鹽（UDP-GlcA）的多步不可逆糖相互轉(zhuǎn)化，最后轉(zhuǎn)化成木糖和阿拉伯糖的衍生物，半纖維素和果膠形成的前體[7]；2）UDP-Glc A也可以通過肌醇加氧途徑通過更復雜的反應(yīng)形成[27]。這兩種途徑都可能存在于植物中，其重要性取決于植物的種類和組織，UGDH通常在幼嫩組織中活性最高，包括樹種中的形成層。前人研究表明茶樹細胞壁形成主要通過第1條路徑，這與UGDH本質(zhì)上參與細胞壁形成的觀點一致[23，7]。這說明此酶在形成細胞壁半纖維素前體物過程中起著非常重要的作用[19]，UGDH在木質(zhì)部中表達，但在韌皮部中觀察到很少或沒有表達，即UGDH代表木質(zhì)部分化的有價值的分子標記。苧麻UGDH、大豆UGDH、擬南芥UGDH、興安落葉松UGDH1、UGDH2在莖的表達量最高，與本實驗研究結(jié)一致。由此推測BpUGDH基因在莖中表達量較高可能與莖段木質(zhì)化，在半纖維素的生物合成、細胞壁生物合成相關(guān)。

3.2 UGDH基因功能驗證

植物細胞壁對于植物生長、防御、結(jié)構(gòu)完整性起著至關(guān)重要的作用；理解細胞壁形成的分子機制、為通過積累細胞壁多聚糖而增加細胞壁的厚度提供重要的信息。UDP葡糖脫酶催化UDP葡萄糖氧化生成UDP-葡萄糖醛酸酯，UDP-葡萄糖醛酸酯是合成半纖維素和果膠的關(guān)鍵核糖。UGDH蛋白已被證實是半纖維素和果膠生物合成的關(guān)鍵限速酶[29]，在興安落葉松中LgUGDH1的超表達增加了半纖維素和可溶性糖的含量，LgUGDH2、LgUGDH1協(xié)同作用可以增加半纖維素和果膠生物合成[18，21]；在楊樹中，PtUGDH基因主要在發(fā)育中的木質(zhì)部和幼葉中表達[19]。雜交楊樹的PtUGDH基因表現(xiàn)出組織特異性（韌皮部、木質(zhì)部、幼葉、葉尖等）的表達模式[19，26]；在轉(zhuǎn)基因苜蓿中增加了UGDH基因，可以減少細胞壁多糖和木質(zhì)素含量的增加[18]；玉米中UGDH-A1基因的突變可以干擾戊糖的生成量，這意味著UGDH可能影響細胞壁的形成[7，13]，在毛竹中PeUGDH4基因過表達對細胞壁增厚有著促進作用[25]；前人研究煙草在進行次生壁生物合成時，UGDH酶活性較高，UDP-木糖的合成要優(yōu)先于木質(zhì)素生物合成，說明UGDH基因影響半纖維素和果膠的形成；在梧桐樹中，UGDH活性從形成層到分化的木質(zhì)部細胞逐漸增強[28]；6周齡甘草（Glycyrrhiza uralensis）[31]幼苗根部UGDH1基因表達水平較高，與根的初生和次生生長過程中細胞壁的大量生物合成相關(guān)。吉仁花[9]從雜交構(gòu)樹中分離了BpUGDH3基因及其啟動子，亞細胞定位結(jié)果顯示在葉綠體，并認為葉綠體在細胞繁衍過程中提供能量，由此也推測雜交構(gòu)樹UGDH基因促進半纖維素和果膠的形成。目前對雜交構(gòu)樹UGDH基因研究較少，本研究為雜交構(gòu)樹UGDH進一步的基因功能鑒定提供參考，為探討各基因之間在調(diào)控半纖維素和果膠含量及二者相互作用奠定了一定理論基礎(chǔ)。本研究初步對雜交構(gòu)樹UGDH基因家族進行克隆，基因家族當中BpUGDH2和BpUGDH4克隆獲得不是基因全長序列（基因某個片段），下一步工作針對這兩個基因進一步克隆其全長序列，并深入研究家族基因的功能，分析出主要貢獻酶。

4 結(jié) 論

本研究利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的基因序列設(shè)計引物克隆了雜交構(gòu)樹UGDH基因家族成員BpUGDH1、BpUGDH2、和BpUGDH4，與吉仁花[9]的BpUGDH3共同分析，長度分別為1 895 bp（BpUGDH1）、927 bp（BpUGDH2）1 658 bp（BpUGDH3）[9]、481 bp（BpUGDH4），并且特異性條帶與目的基因長度一致。通過生物信息學分析了解到BpUGDH蛋白編碼長度為131～480 aa，等電點范圍為5.98～8.11，脂肪系數(shù)范圍為74.50～99.74，不穩(wěn)定系數(shù)范圍為21.41～31.56。BpUGDH2為疏水性蛋白，其余為親水性蛋白。BpUGDH基因均不含信號肽即該蛋白不是分泌蛋白不被分泌到胞外；無跨膜結(jié)構(gòu)域，蛋白均存在PLNO2353superfamily一個超家族保守結(jié)構(gòu)域，并推測UGDH基因編碼的蛋白質(zhì)是脫氫酶家族的成員。雜交構(gòu)樹UGDH1、2、4與BpUGDH3同屬于一個基因家族，我們對雜交構(gòu)樹UGDH基因進行亞細胞定位預測，結(jié)果顯示該基因定位于葉綠體，與BpUGDH3測定結(jié)果一致[9]。BpUGDH1同大豆UGDH2聚為一類；BpUGDH2和大豆UGDH4親緣關(guān)系較近，同時BpUGDH2和BpUGDH4聚為一類，BpUGDH4和水稻UGDH1、水稻UGDH2以及玉米UGDH2親緣關(guān)系近；BpUGDH3和擬南芥UGDH3有較近的親緣關(guān)系。BpUGDH1在根莖葉中均穩(wěn)定表達，BpUGDH2在莖、葉的表達量較一致，BpUGDH3在莖中的表達量最高，葉片次之[9]，BpUGDH4在莖中的表達量最高，總結(jié)得出該基因家族均在莖中表達。

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[本文編校：吳 毅]